Name: Xenopus laevis Preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprende a preparar extractos citoplasmáticos de huevos de Xenopus laevis para imágenes en vivo de la dinámica citoplasmática. Este método permite visualizar patrones espaciales y autoorganización celular en tiempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a J. Kamenz, Y. Chen y W. Y. C. Huang por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM110564, P50 GM107615 y R35 GM131792) otorgadas a James E. Ferrell, Jr.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Stanford.
1. Preparación de portaobjetos y cubreobjetos
<ol><li>Aplique una capa de cinta adhesiva de etileno propileno fluorado (FEP) a un portaobjetos de vidrio con un aplicador de rodillos. Corte el exceso de cinta sobre los bordes con una cuchilla de afeitar limpia. Prepare los cubreobjetos recubiertos con cinta FEP de la misma manera (Figura 1A).</li>
	<li>Aplique un espaciador de imágenes adhesivas de doble cara al lado recubierto con cinta FEP de la diapositiva. Deje el forro protector en la parte superior sin pelar (Figura 1A). NOTA: Las diapositivas y los cubreobjetos deben prepararse antes del experimento. Se pueden usar inmediatamente o almacenar en cajas para evitar la acumulación de polvo en las superficies. El pozo en el espaciador de imágenes tiene una profundidad de 120 μm y tiene un diámetro de 9 mm.</li>
</ol>2. Preparación e imágenes en vivo de extractos de huevo detenidos entre fases
NOTA: El siguiente protocolo está adaptado de Deming y Kornbluth19, Murray20 y Smythe y Newport25 con modificaciones. Todos los pasos deben realizarse a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.
<ol><li>De tres a diez días antes de la recolección de huevos, inyecte ranas hembras maduras de Xenopus laevis por vía subcutánea en el saco linfático dorsal con 100 UI de gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG).</li>
	<li>De dieciséis a dieciocho horas antes de la recolección planificada de huevos, inyecte las ranas del paso 2.1 con 500 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG). Dejar las ranas a 18 °C en tampón de puesta de huevos (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4·7H 2 O, 2.5 mM CaCl 2·2H2O, 0.5 mM HEPES, 0.1 mM EDTA, preparar como una solución madre 20x a pH 7.4 y diluir con agua limpia del tanque de rana hasta 1x antes de usar) hasta la recolección de huevos.</li>
	<li>El día del experimento, recolecte los huevos en una placa de Petri de vidrio grande y evalúe la calidad del huevo. Deseche cualquier huevo que parezca bolas hinchadas blancas o que aparezca en una cuerda (Figura 1B). Examine los huevos bajo un estereoscopio, mantenga los huevos con apariencia normal (Figura 1C) y deseche aquellos con pigmento irregular o moteado (Figura 1D). NOTA: Este protocolo funciona con huevos recolectados de una sola rana, que generalmente pone 25 ml de huevos 16 horas después de la inyección de hCG. Por lo general, un total de 3 a 6 ranas son inducidas por hCG, y la rana con la más alta calidad de huevo se elige para el experimento de preparación de extractos.</li>
	<li>Transfiera los huevos a un vaso de precipitados de vidrio de 400 ml y elimine la mayor cantidad posible de tampón de puesta de huevos por decantación.</li>
	<li>Incubar los huevos en 100 ml de solución desejelante recién preparada (2% p/v L-cisteína en agua, ajustar a pH 8.0 con NaOH) y agitarlos suavemente periódicamente. Después de unos 3 minutos, vierta la solución y agregue 100 ml de solución desejelante fresca. Continúe la incubación hasta que los huevos estén bien empaquetados (sin espacio entre los huevos), pero evite dejar los huevos en la solución desarticulada durante más de un total de 5 minutos.</li>
	<li>Eliminar la mayor cantidad posible de solución desarticulada por decantación y lavar los huevos en tampón MMR 0,25x (25 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 0,25 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl2, 0,025 mM EDTA, 1,25 mM HEPES, preparado como una solución madre 10x, ajustado a pH 7,8 con NaOH, y diluido en agua Milli-Q antes de su uso) añadiendo el tampón, Agitando los huevos y luego vertiendo el amortiguador. Repita varias veces hasta que se use un total de 1 L del tampón para los lavados.</li>
	<li>Lave los huevos varias veces con un total de 400 ml de tampón de lisis de huevo (250 mM de sacarosa, 10 mM de HEPES, 50 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, frescos y ajustados a pH 7,7 con KOH). Retire los huevos con apariencia anormal utilizando una pipeta Pasteur entre los lavados. NOTA: Los huevos con apariencia anormal se refieren a aquellos que parecen bolas hinchadas blancas (Figura 1B), tienen pigmentación moteada (Figura 1D), se están deteriorando con una región blanca en crecimiento (Figura 1E) o muestran un área pigmentada oscura y contraída en el hemisferio animal (Figura 1F).</li>
	<li>Usando una pipeta de transferencia con la punta bien abierta, transfiera los huevos a un tubo de centrífuga de fondo redondo de 17 ml que contenga 1 ml de tampón de lisis de huevo. Gire el tubo en una centrífuga clínica a 400 x g durante 15 segundos para empacar los huevos.</li>
	<li>Retire la mayor cantidad posible del tampón de lisis del huevo de la parte superior de los huevos envasados con una pipeta Pasteur. NOTA: Es importante eliminar la mayor cantidad posible de tampón de los huevos empacados, con el fin de minimizar la dilución del extracto de huevo. A veces es necesario eliminar algunos huevos sueltos junto con el tampón residual para lograr esto.</li>
	<li>Determine el volumen aproximado de los huevos empacados y luego agregue 5 μg/ml de aprotinina, 5 μg/ml de leupeptina, 5 μg/ml de citocalasina B y 50 μg/ml de cicloheximida directamente sobre los huevos empacados. NOTA: La aprotinina y la leupeptina son inhibidores de la proteasa. La citocalasina B inhibe la polimerización de actina, evitando que el extracto se contraiga y gelifique26. La cicloheximida inhibe la síntesis de proteínas, manteniendo así el extracto en la interfase del ciclo celular.</li>
	<li>Triturar los huevos centrifugando el tubo a 12.000 x g, 4 °C, durante 15 minutos, en un rotor de cuchara oscilante. NOTA: Al final de la centrifugación, los huevos deben haberse roto y el lisado separado en tres capas principales: una capa lipídica amarilla en la parte superior, el extracto citoplasmático (también llamado extracto crudo) en el medio y una capa densa oscura que contiene los gránulos de pigmento en la parte inferior (Figura 1G).</li>
	<li>Coloque una aguja de calibre 18 en una jeringa. Con el bisel de la punta de la aguja hacia arriba, perfore el tubo desde el lado en la parte inferior de la capa citoplasmática y recupere el extracto dibujando lentamente. NOTA: Extraiga el extracto citoplasmático lentamente para evitar la inclusión de contenido contaminante de la capa lipídica amarilla.</li>
	<li>Transfiera el extracto citoplasmático recuperado a un nuevo tubo de microcentrífuga y manténgalo en hielo. Use el extracto dentro de 1 hora.</li>
	<li>Cuando esté listo para obtener imágenes, complemente el extracto con los reactivos deseados y las sondas de imágenes de fluorescencia. NOTA: Las sondas de imágenes de fluorescencia marcan estructuras citoplasmáticas específicas para que puedan ser visualizadas por un microscopio de fluorescencia.</li>
	<li>Retire el revestimiento protector superior del espaciador de imágenes del portaobjetos preparado en el paso 1.2 y deposite aproximadamente 7 μL de extracto en el centro del pocillo. Aplique inmediatamente el cubrecubierto con cinta FEP con el lado FEP orientado hacia el extracto para sellar el pozo. Proceda rápidamente a la obtención de imágenes (Figura 1H, I).</li>
	<li>Coloque la diapositiva en un microscopio invertido o vertical con una platina motorizada y una cámara digital. Obtener imágenes de los extractos en las posiciones espaciales deseadas y los intervalos de tiempo tanto en canales de campo claro como de fluorescencia. NOTA: Normalmente, se utiliza un objetivo 5x para la obtención de imágenes. La platina motorizada permite la adquisición automatizada de imágenes en múltiples posiciones espaciales definidas. La microscopía de campo claro visualiza estructuras citoplasmáticas con diferentes grados de transparencia. La microscopía de fluorescencia visualiza las estructuras citoplasmáticas específicamente marcadas por las sondas de imágenes de fluorescencia agregadas en el paso 2.14. La cámara graba imágenes de lapso de tiempo de estas estructuras, capturando así la dinámica de la organización citoplasmática.</li>
</ol>

<ol><li>Murray, A. W., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+synthesis+drives+the+early+embryonic+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle.</a> Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).</li>
<li>Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+cdc2+protein+is+a+component+of+MPF%2C+a+cytoplasmic+regulator+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis.</a> Cell. 54 (3), 423-431 (1988).</li>
<li>Minshull, J., Golsteyn, R., Hill, C. S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-+and+B-type+cyclin+associated+cdc2+kinases+in+Xenopus+turn+on+and+off+at+different+times+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The A- and B-type cyclin associated cdc2 kinases in Xenopus turn on and off at different times in the cell cycle.</a> EMBO J. 9 (9), 2865-2875 (1990).</li>
<li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP1-mediated+dephosphorylation+of+phosphoproteins+at+mitotic+exit+is+controlled+by+inhibitor-1+and+PP1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">PP1-mediated dephosphorylation of phosphoproteins at mitotic exit is controlled by inhibitor-1 and PP1 phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 11 (5), 644-651 (2009).</li>
<li>Pomerening, J. R., Sontag, E. D., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+cell+cycle+oscillator%3A+hysteresis+and+bistability+in+the+activation+of+Cdc2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Building a cell cycle oscillator: hysteresis and bistability in the activation of Cdc2.</a> Nature Cell Biology. 5 (4), 346-351 (2003).</li>
<li>Mochida, S., Maslen, S. L., Skehel, M., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greatwall+phosphorylates+an+inhibitor+of+protein+phosphatase+2A+that+is+essential+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Greatwall phosphorylates an inhibitor of protein phosphatase 2A that is essential for mitosis.</a> Science. 330 (6011), 1670-1673 (2010).</li>
<li>Blow, J. J., Laskey, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+DNA+replication+in+nuclei+and+purified+DNA+by+a+cell-free+extract+of+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs.</a> Cell. 47 (4), 577-587 (1986).</li>
<li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li>
<li>Cheng, X., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+emergence+of+cell-like+organization+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous emergence of cell-like organization in Xenopus egg extracts.</a> Science. 366 (6465), 631-637 (2019).</li>
<li>Nguyen, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+cytokinesis+signaling+reconstituted+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of cytokinesis signaling reconstituted in a cell-free system.</a> Science. 346 (6206), 244-247 (2014).</li>
<li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li>
<li>Hazel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cytoplasmic+volume+are+sufficient+to+drive+spindle+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Changes in cytoplasmic volume are sufficient to drive spindle scaling.</a> Science. 342 (6160), 853-856 (2013).</li>
<li>Brownlee, C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importin+alpha+Partitioning+to+the+Plasma+Membrane+Regulates+Intracellular+Scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Importin alpha Partitioning to the Plasma Membrane Regulates Intracellular Scaling.</a> Cell. 176 (4), 805-815 (2019).</li>
<li>Nguyen, P. A., Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prc1E+and+Kif4A+control+microtubule+organization+within+and+between+large+Xenopus+egg+asters%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Prc1E and Kif4A control microtubule organization within and between large Xenopus egg asters.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (3), 304-316 (2018).</li>
<li>Desai, A., Maddox, P. S., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase+A+chromosome+movement+and+poleward+spindle+microtubule+flux+occur+At+similar+rates+in+Xenopus+extract+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Anaphase A chromosome movement and poleward spindle microtubule flux occur At similar rates in Xenopus extract spindles.</a> Journal of Cell Biology. 141 (3), 703-713 (1998).</li>
<li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+polymerization+dynamics%2C+opposed+motors%2C+and+a+tensile+element+in+governing+the+length+of+Xenopus+extract+meiotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles.</a> Molecular Biology of the Cell. 16 (6), 3064-3076 (2005).</li>
<li>Mitchison, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bipolarization+and+poleward+flux+correlate+during+Xenopus+extract+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Bipolarization and poleward flux correlate during Xenopus extract spindle assembly.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5603-5615 (2004).</li>
<li>Murray, A. W., Desai, A. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+observation+of+anaphase+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real time observation of anaphase in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12327-12332 (1996).</li>
<li>Deming, P., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+apoptosis+in+vitro+using+the+Xenopus+egg+extract+reconstitution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Study of apoptosis in vitro using the Xenopus egg extract reconstitution system.</a> Methods in Molecular Biology. 322, 379-393 (2006).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Field, C. M., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+Spindles+and+Asters+in+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assembly of Spindles and Asters in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Guan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+tunable+mitotic+oscillator+in+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A robust and tunable mitotic oscillator in artificial cells.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Guan, Y., Wang, S., Jin, M., Xu, H., Yang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+Cell-cycle+Oscillations+in+Microemulsions+of+Cell-free+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e58240(2018).</li>
<li>Oakey, J., Gatlin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Encapsulation+of+Demembranated+Sperm+Nuclei+in+Xenopus+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Encapsulation of Demembranated Sperm Nuclei in Xenopus Egg Extracts.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li>
<li>Smythe, C., Newport, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+for+the+study+of+nuclear+assembly%2C+DNA+replication%2C+and+nuclear+breakdown+in+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems for the study of nuclear assembly, DNA replication, and nuclear breakdown in Xenopus laevis egg extracts.</a> Methods in Cell Biology. 35, 449-468 (1991).</li>
<li>Field, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+behavior+in+bulk+cytoplasm+is+cell+cycle+regulated+in+early+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Actin behavior in bulk cytoplasm is cell cycle regulated in early vertebrate embryos.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 12 2086-2095 (2011).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+trigger+waves+and+the+spatial+coordination+of+the+Xenopus+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitotic trigger waves and the spatial coordination of the Xenopus cell cycle.</a> Nature. 500 (7464), 603-607 (2013).</li>
<li>Chang, J. B., Ferrell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustly+Cycling+Xenopus+laevis+Cell-Free+Extracts+in+Teflon+Chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Robustly Cycling Xenopus laevis Cell-Free Extracts in Teflon Chambers.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (8), (2018).</li>
<li>Chatterjee, S., Javier, M., Stochaj, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+nuclear+protein+traffic+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of nuclear protein traffic in mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 346-350 (1997).</li>
<li>Mochida, S., Hunt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+is+required+to+release+Xenopus+egg+extracts+from+meiotic+M+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcineurin is required to release Xenopus egg extracts from meiotic M phase.</a> Nature. 449 (7160), 336-340 (2007).</li>
<li>Heald, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+into+bipolar+spindles+around+artificial+chromosomes+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts.</a> Nature. 382 (6590), 420-425 (1996).</li>
<li>Helmke, K. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPX2+levels+modulate+meiotic+spindle+size+and+architecture+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TPX2 levels modulate meiotic spindle size and architecture in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 206 (3), 385-393 (2014).</li>
<li>Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+assembly+by+two+different+pathways+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle assembly by two different pathways in vitro.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 925-940 (1991).</li>
<li>Belmont, L. D., Hyman, A. A., Sawin, K. E., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+cell+cycle-dependent+changes+in+microtubule+dynamics+in+cytoplasmic+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts.</a> Cell. 62 (3), 579-589 (1990).</li>
<li>Krauss, S. W., Lee, G., Chasis, J. A., Mohandas, N., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+protein+4.1+domains+essential+for+mitotic+spindle+and+aster+microtubule+dynamics+and+organization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two protein 4.1 domains essential for mitotic spindle and aster microtubule dynamics and organization in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (26), 27591-27598 (2004).</li>
<li>Wang, S., Romano, F. B., Field, C. M., Mitchison, T. J., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mechanisms+determine+ER+network+morphology+during+the+cell+cycle+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple mechanisms determine ER network morphology during the cell cycle in Xenopus egg extracts.</a> Journal of Cell Biology. 203 (5), 801-814 (2013).</li>
<li>Field, C. M., Nguyen, P. A., Ishihara, K., Groen, A. C., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+egg+cytoplasm+with+intact+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Xenopus egg cytoplasm with intact actin.</a> Methods in Enzymology. 540, 399-415 (2014).</li>
<li>Good, M. C., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Cellular+Extracts+from+Xenopus+Eggs+and+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of Cellular Extracts from Xenopus Eggs and Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).</li>
<li>Field, C. M., Pelletier, J. F., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+extract+approaches+to+studying+microtubule+organization+and+signaling+in+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Xenopus extract approaches to studying microtubule organization and signaling in cytokinesis.</a> Methods in Cell Biology. 137, 395-435 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los extractos de huevos de Xenopus laevis se han convertido en un poderoso sistema modelo para estudios basados en imágenes de diversas estructuras subcelulares 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 y organización citoplasmática en su conjunto<sup...

El citoplasma constituye el volumen principal de una célula y tiene una organización distinta. Los ingredientes del citoplasma eucariota pueden autoensamblarse en una amplia gama de estructuras espaciales, como los ásteres de microtúbulos y el aparato de Golgi, que a su vez están dispuestos dinámicamente y se voltean dependiendo de la identidad y el estado fisiológico de la célula. Por lo tanto, comprender la organización espacial del citoplasma y su vínculo con las funciones celulares es importante para comprender cómo funciona la célula. Los extractos de huevo de Xenopus laevis se han utilizado tradicionalmente para ensayos bioquímicos a granel 1,2,3,4,5,6,7,8, pero trabajos recientes los establecen como un poderoso sistema de imágenes en vivo para estudios mecanicistas de estructuras citoplasmáticas y sus funciones celulares 9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18. Estos extractos no diluidos preservan muchas estructuras y funciones del citoplasma, al tiempo que permiten manipulaciones directas de los contenidos citoplasmáticos no alcanzables en modelos convencionales basados en células19,20. Esto los hace ideales para caracterizar fenómenos citoplasmáticos y diseccionar sus fundamentos mecanicistas.
Los métodos existentes para obtener imágenes de extractos requieren modificaciones químicas de la superficie o la fabricación de dispositivos microfluídicos. Un método basado en cubreobjetos requiere la pasivación del polietilenglicol (PEG) de los cubreobjetos de vidrio21. Un método basado en microemulsiones requiere la deposición de vapor de tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano en superficies de vidrio22,23. Los sistemas basados en microfluídicos permiten un control preciso del volumen, geometría y composición de las gotas de extracción, pero requieren instalaciones especializadas de microfabricación11,12,24.
Aquí presentamos un método alternativo para obtener imágenes de extractos de huevo que es fácil de implementar y utiliza materiales fácilmente disponibles y de bajo costo. Esto incluye la preparación de una cámara de imágenes con un portaobjetos y un cubreobjetos recubiertos con cinta de etileno propileno fluorado (FEP). La cámara se puede utilizar para extraer imágenes con una variedad de sistemas de microscopía, incluidos estereoscopios y microscopios verticales e invertidos. Este método no requiere tratamiento químico de superficies, al tiempo que logra una claridad óptica similar obtenida con los métodos existentes basados en vidrio discutidos anteriormente. Está diseñado para obtener imágenes de una capa de extractos con un grosor uniforme en un campo 2D, y se puede extender fácilmente para obtener imágenes de un volumen 3D de extractos. Es muy adecuado para imágenes de lapso de tiempo del comportamiento citoplasmático colectivo en un amplio campo de visión.
Hemos utilizado extractos de huevo detenidos entre fases para demostrar nuestro método de imagen. La preparación del extracto sigue el protocolo de Deming y Kornbluth19. Brevemente, los huevos naturalmente detenidos en la metafase de la meiosis II son aplastados por un giro de baja velocidad. Este giro libera el citoplasma del paro meiótico y permite que el extracto proceda a la interfase. Normalmente, la citocalasina B se agrega antes del giro de trituración para inhibir la formación de actina F. Sin embargo, se puede omitir si se desea F-actina. La cicloheximida también se agrega antes del centrifugado para evitar que el extracto de interfase entre en la siguiente mitosis. Los extractos se colocan posteriormente en las cámaras de imagen antes mencionadas y se colocan en un microscopio. Finalmente, las imágenes se registran a lo largo del tiempo a intervalos definidos por una cámara conectada al microscopio, produciendo series de imágenes de lapso de tiempo que capturan el comportamiento dinámico del extracto en un campo 2D.

<table><tbody><tr><td>Tubo centrífugo de 17 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>337986</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm cuadrado #1 cubreobjetos</td><td>Corning</td><td>284522</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>MilliporeSigma</td><td>10236624001</td><td>Inhibidor de la proteasa</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>MilliporeSigma</td><td>01810</td><td>Inhibidor de la síntesis de proteínas</td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>MilliporeSigma</td><td>C6762</td><td>Actina inhibidor de la polimerización</td></tr><tr><td>ranas hembra Xenopus laevis Nasco</td><td></td><td>LM00535MX</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente HiLyte 488 proteína de tubulina marcada</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL488M-A</td><td>Para visualizar el citoesqueleto de microtúbulos</td></tr><tr><td>Fluorescente HiLyte 647 marcado con proteína de tubulina</td><td>Citoesqueleto, Inc.</td><td>TL670M-A</td><td>Para la visualización del citoesqueleto de microtúbulos</td></tr> Cinta ópticamente <tr><td>transparente de etileno propileno fluorado (FEP)</td><td>CS Hyde company</td><td>23-FEP-2-5</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina coriónica humana (hCG)</td><td>MilliporeSigma</td><td>CG10</td><td></td></tr><tr><td>Espaciador de imagen</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>70327-8S</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>MilliporeSigma</td><td>11017101001</td><td>Inhibidor de la proteasa</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-100B</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>MilliporeSigma</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7512</td><td>Para la visualización de mitocondrias</td></tr><tr><td>Yegua embarazada gonadotropina sérica (PMSG)</td><td>BioVendor</td><td>RP1782725000</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de rodillo</td><td>Amazon</td><td>B07HMBJSP8</td><td>Para aplicar la cinta FEP a los portaobjetos y cubreobjetos de vidrio</td></tr><tr><td>Hojas de afeitar de un solo filo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>Para eliminar el exceso de cinta FEP</td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus laevis preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Tradicionalmente utilizados para ensayos bioquímicos a granel, los extractos de huevo de Xenopus laevis se han convertido en una poderosa herramienta basada en imágenes para estudiar fenómenos citoplasmáticos, como la citocinesis, la formación del huso mitótico y el ensamblaje del núcleo. Basándose en los primeros métodos que tomaban imágenes de extractos fijos muestreados en puntos de tiempo dispersos, los enfoques recientes de imágenes de extractos en vivo utilizando microscopía de lapso de tiempo, revelando características más dinámicas con una resolución temporal mejorada. Estos métodos generalmente requieren tratamientos superficiales sofisticados del vaso de imágenes. Aquí presentamos un método alternativo para obtener imágenes en vivo de extractos de huevo que no requieren tratamiento químico de superficie. Es fácil de implementar y utiliza consumibles de laboratorio producidos en masa para obtener imágenes. Describimos un sistema que se puede utilizar tanto para microscopía de campo amplio como para microscopía confocal. Está diseñado para extractos de imágenes en un campo de 2 dimensiones (2D), pero se puede extender fácilmente a imágenes en 3D. Es muy adecuado para estudiar la formación de patrones espaciales dentro del citoplasma. Con datos representativos, demostramos la organización dinámica típica de microtúbulos, núcleos y mitocondrias en extractos de interfase preparados utilizando este método. Estos datos de imagen pueden proporcionar información cuantitativa sobre la dinámica citoplasmática y la organización espacial.

Los extractos de huevo de Xenopus laevis se pueden utilizar para estudiar la autoorganización del citoplasma durante la interfase. La figura 2A muestra los resultados de un experimento exitoso. Suplementamos extractos detenidos entre fases con núcleos de espermatozoides 19 de Xenopus laevis demembranados a una concentración de 27 núcleos/μL y 0,38 μM purificados GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (proteína de fusión que consiste en glutatió...

Describimos un método para la preparación y obtención de imágenes en vivo de extractos citoplasmáticos sin diluir de huevos de Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...

Este método es adecuado para imágenes en vivo de la dinámica citoplasmática utilizando extractos de huevos de rana, lo que permite el estudio de la información de patrones espaciales en el citoplasma. Las muestras pueden formarse en una capa con un grosor uniforme y ajustable y obtener imágenes a través de un campo 2D o volumen 3D. Este método es rentable y fácil de implementar.Comience aplicando una capa de cinta adhesiva FEP a un portaobjetos de vidrio con un aplicador de rodillos. Corte el exceso de cinta sobre los bordes con una cuchilla de afeitar limpia. A continuación, prepare los cubrecubiertos recubiertos con cinta FEP de la misma manera.Luego aplique un espaciador de imágenes adhesivas de doble cara al lado recubierto de cinta FEP de la diapositiva, dejando el revestimiento protector sin pelar. Transfiera los huevos a un vaso de precipitados de vidrio de 400 mililitros y elimine la mayor cantidad posible de tampón de puesta de huevos por decantación. Luego incubar los huevos en 100 mililitros de solución desjante recién preparada y agitarlos suavemente.Después de unos tres minutos, vierta la solución y agregue 100 mililitros de solución desejosa fresca. Continúe la incubación hasta que los huevos estén bien empaquetados, pero evite dejar los huevos en la solución desarticulada durante más de un total de cinco minutos. Después de la incubación, retire la solución desarticulada tanto como sea posible y lave los huevos en tampón MMR 0.25x.Agite los huevos, luego vierta el amortiguador. Repita varias veces hasta que se use un total de un litro del tampón para los lavados. A continuación, lave los huevos varias veces con un total de 400 mililitros de tampón de lisis de huevo, eliminando los huevos anormales entre los lavados.Luego use una pipeta de transferencia con una punta de corte ancho para transferir los huevos a un tubo de centrífuga de fondo redondo de 17 mililitros que contenga un mililitro de tampón de lisis de huevo. Gire el tubo en una centrífuga clínica a 400 g durante 15 segundos para empacar los huevos. A continuación, retire la mayor cantidad posible del tampón de lisis del huevo con una pipeta Pasteur.Determine el volumen aproximado de los huevos empacados. luego agregue cinco microgramos por mililitro de aprotinina, leupeptina y citocalasina B y 50 microgramos por mililitro de ciclohexamida directamente sobre los huevos empacados. Triturar los huevos centrifando el tubo durante 15 minutos a 12, 000 g y cuatro grados centígrados en un rotor de cubo oscilante.Luego, coloque una aguja de calibre 18 en una jeringa. Con el bisel de la punta de la aguja hacia arriba perforar el tubo desde el lado en la parte inferior de la capa citoplasmática y recuperar el extracto dibujando lentamente. Transfiera el extracto citoplasmático recuperado a un nuevo tubo de microcentrífuga y manténgalo en hielo.Cuando esté listo para obtener imágenes, complemente el extracto con los reactivos deseados y las sondas de imágenes de fluorescencia. Retire el revestimiento protector superior del espaciador de imágenes en el portaobjetos preparado y deposite aproximadamente siete microlitros de extracto en el centro del pozo. Aplique inmediatamente el cubrecubierto con cinta FEP con el lado FEP orientado hacia el extracto para sellar el pocillo y proceder rápidamente a la obtención de imágenes.Coloque la diapositiva en un microscopio invertido o vertical con una platina motorizada y una cámara digital. Obtener imágenes de los extractos en las posiciones espaciales deseadas en intervalos de tiempo tanto en canales de campo brillante como de fluorescencia. Aquí se muestra un experimento de lapso de tiempo utilizando extractos de huevos de xenopus laevis para estudiar la autoorganización del citoplasma durante la interfase.Después de unos 20 minutos de incubación a temperatura ambiente, las áreas agotadas de componentes citoplasmáticos de dispersión de luz fueron visibles tanto en los canales de campo brillante como en los de mitocondrias. A los 60 minutos a temperatura ambiente, un patrón espacial que consiste en compartimentos similares a células debe estar bien establecido con microtúbulos que forman una estructura hueca en forma de corona y mitocondrias claramente divididas en cada compartimento. Aquí se muestra una comparación del rendimiento del extracto en cámaras de imagen con y sin cintas FEP en vidrio.En la cámara hecha con vidrio FEP pegado con cinta adhesiva, el extracto se autoorganizó en patrones normales similares a células. En la cámara donde las superficies de vidrio no estaban cubiertas por la cinta FEP, el extracto mostró patrones anormales de campo brillante y microtúbulos que se interrumpieron cada vez más con el tiempo. No se observaron diferencias significativas en la importación nuclear de la proteína GST-mCherry-NLS.Las cosas importantes a recordar son pasivar las superficies de vidrio con cinta FEP y eliminar todos los huevos malos durante la preparación del extracto. Con este sistema, podemos controlar fácilmente el grosor de la muestra extraída, allanando el camino para obtener imágenes de patrones citoplasmáticos en 3D, utilizando microscopía de lámina de luz.

xenopus-laevis-egg-extract-preparation-live-imaging-methods-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Extractos de Xenopus huevo crudo y fraccionado se puede utilizar para proporcionar ingredientes para la reconstitución de los procesos celulares de análisis morfológicos y bioquímicos. Lisis de huevo y centrifugación diferencial se utilizan para preparar el extracto crudo que a su vez en utilizarse para preparar extractos fraccionados y preparados ligeros membrana.

Preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo Xenopus laevis

Aquí se demuestra la microinyección citoplasmática...

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Xenopus epitelios embrionarios son un sistema modelo ideal para estudiar los comportamientos celulares, tales como el desarrollo de la polaridad y cambiar de forma durante la morfogénesis epitelial. Histología tradicional de muestras fijas cada vez se complementa con células vivas de imagen confocal. Aquí se demuestra métodos para aislar los tejidos de rana y visualizar en directo las células epiteliales y su citoesqueleto utilizando células vivas, la microscopía confocal.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Ectodermo embrionario de Xenopus se ha convertido en un atractivo modelo para el estudio de la polaridad celular. Un ensayo se describe, en el que la distribución subcelular de las proteínas fluorescentes se evalúa en las células de ectodermo. Este protocolo ayudará a contestar preguntas relacionadas con el control espacial de la señalización.

Translocación polarizado de proteínas fluorescentes en Xenopus Ectodermo en respuesta a la señalización de Wnt

Los cultivos neuronales de explantes de<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus laevis proporciona un sistema modelo ideal para el estudio de la especificación del destino celular y la función fisiológica de las células individuales de la retina en cultivo de células primarias. Aquí se presenta una técnica para la disección de tejidos retinales y la generación de cultivos de células primarias que se toman imágenes de la actividad del calcio y se analizaron mediante hibridación in situ.

Disección, Cultura y Análisis de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tejido de la retina embrionaria

Un protocolo para la obtención de imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados o estructuras autofluorescentes en...

Imágenes en directo de las proteínas GFP-etiquetados en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovocitos

Los mecanismos de escalamiento celular e intracelular siguen siendo esquivos. El uso de extractos de embriones de Xenopus se ha vuelto cada vez más común para dilucidar los mecanismos de regulación del tamaño de los orgánulos. Este método describe la preparación de extractos embrionarios y un nuevo ensayo de escalamiento nuclear a través del cual se pueden identificar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear.

Un ensayo libre de células Utilizando<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrión Extrae para estudiar los mecanismos de regulación del tamaño nuclear

Presentamos un protocolo de dos partes que combina imágenes fluorescentes de calcio con hibridación in situ, permitiendo al experimentador correlacionar patrones de actividad de calcio con perfiles de expresión génica a nivel de una sola célula.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Describimos un protocolo simple para desarrollar organoides epiteliales mucociliares a partir de células ectoderm profundas aisladas de embriones Xenopus laevis. Los progenitores multipotentes regeneran precursores de células de copa epitelial y permiten el seguimiento en vivo de la iniciación y progresión de las transiciones celulares en la superficie de los organoides.

Organoides epiteliales mucocilios de células embrionarias de Xenopus: generación, cultura e imágenes en vivo de alta resolución

En el embrión temprano de Drosophila , muchos orgánulos son móviles. En principio, se pueden obtener imágenes en vivo a través de sondas fluorescentes específicas, pero la cáscara del huevo impide la aplicación directa al embrión. Este protocolo describe cómo introducir tales sondas a través de la microinyección, y luego analizar el movimiento de orgánulos a granel a través de la velocimetría de imagen de partículas.

Visualización del tráfico dependiente de citoesqueletos de orgánulos que contienen lípidos en embriones de Drosophila

Aprende a preparar extractos citoplasmáticos de huevos de Xenopus laevis para imágenes en vivo de la dinámica citoplasmática. Este método permite visualizar patrones espaciales y autoorganización celular en tiempo real.

Xenopus laevis Preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica (Video) | JoVE Journal

Xenopus laevis Preparación de extracto de huevo y métodos de imágenes en vivo para visualizar la organización citoplasmática dinámica

Explorar más videos