Name: Un modelo de cultivo celular de adipocitos para estudiar el impacto de la modulación de proteínas y microARN en la función de los adipocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a realizar transfección inversa en adipocitos 3T3-L1 para manipular proteínas y microARN. Este método eficiente permite estudiar señalización de insulina y metabolismo glucídico en investigación metabólica.

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Este trabajo fue apoyado por el INSERM, la Université Côte d'Azur y la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR) a través del programa Inversiones para el futuro Laboratorio de Excelencia (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) e Iniciativa de Excelencia (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. cuenta con el apoyo de subvenciones de la Société Francophone du Diabète (SFD), la Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), el Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) y la Fondation Benjamin-Delessert. J.G. cuenta con el apoyo de ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. cuenta con el apoyo de la subvención ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 y una subvención de la Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). También agradecemos la Instalación Central de Imágenes de C3M financiada por el Conseil Départemental des Alpes-Maritimes y la Région PACA, que también cuenta con el apoyo de la Plataforma de Microscopía e Imágenes GIS IBiSA Côte d'Azur (MICA).

NOTA: Utilice técnicas estériles para realizar todos los pasos del protocolo en una campana de cultivo celular de flujo laminar. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los reactivos y equipos.
1. Diferenciación de fibroblastos murinos 3T3-L1 en adipocitos
<ol><li>Cultivar los fibroblastos 3T3-L1 en platos de 100 mm en cultivo medio-DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% de suero de ternero recién nacido, y 1% de penicilina y estreptomicina (Figura 1A). Coloque los platos en una incubadora de cultivo de tejidos (7% CO2 y 37 °C).</li>
	<li>Dos días después de la confluencia, cambie el medio de cultivo, reemplazando con DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% de suero fetal de terneros (FCS) y 1% de penicilina y estreptomicina suplementados con 0.25 mM de 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 0.25 μM de dexametasona, 5 μg / ml de insulina y 10 μM de rosiglitazona. NOTA: Se necesitan 5 días para alcanzar la confluencia cuando las células se siembran a 300,000 células por plato de 100 mm.</li>
	<li>Dos días después, reemplace el medio de cultivo con DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% fcS y 1% de penicilina y estreptomicina suplementada con 5 μg / ml de insulina y 10 μM de rosiglitazona e incube durante 2 días. Luego, alimente las células cada 2 días con DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% fcS y 1% de penicilina y estreptomicina(Figura 1B).</li>
	<li>Transfectar los adipocitos 3T3-L1 7-8 días después del inicio del protocolo de diferenciación. NOTA: Es importante alcanzar un alto nivel de diferenciación (>80%) antes de la transfección para evitar la proliferación de los fibroblastos restantes después de la transfección, lo que llevaría a una población mixta de células que podría sesgar los resultados.</li>
</ol>2. Preparación de placas preestutuadas
<ol><li>El día anterior o unas horas antes de la transfección, prepare una solución de colágeno tipo I a 100 μg/mL en etanol al 30% a partir de una solución stock a 1 mg/mL. Agregue 250 μL de colágeno por pozo de una placa de 12 pozos y 125 μL por pozo de una placa de 24 pozos, y extienda la solución sobre la superficie del pozo.</li>
	<li>Deje la placa sin la tapa debajo de la campana de cultivo hasta que el colágeno se seque. Lavar dos veces con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS). NOTA: Las placas preestuadas están disponibles para su compra.</li>
</ol>3. Preparación de la mezcla de transfección
NOTA: La concentración final de siRNA está entre 1 y 100 nM (1 a 100 pmol de siRNA por pozo de una placa de 12 pozos). La concentración final del imitador miR es de 10 nM (10 pmol/pozo). Determine la mejor concentración de cada siRNA, imitación de miR u otro oligonucleótido antes de comenzar el experimento para evitar efectos fuera del objetivo. Realizar experimentos de transfección por triplicado para facilitar el análisis estadístico de los resultados. Prepare todos los reactivos en exceso para tener en cuenta la pérdida normal durante el pipeteo.
<ol><li>Mezclar mediante pipeteo (volumen/volumen) el siRNA (u otros oligonucleótidos) con el Medio Esencial Mínimo mejorado (Tabla 1). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir el reactivo de transfección y el Medio Esencial Mínimo mejorado al siRNA, y pipet a la mezcla (Tabla 1). Incubar durante 20 min a temperatura ambiente (durante este tiempo, continúe con la sección 4). Agregue la mezcla de transfección a cada pozo de la placa recubierta de colágeno.</li>
</ol>4. Preparación de los adipocitos 3T3-L1
<ol><li>Lave las celdas en la placa de Petri de 100 mm dos veces con D-PBS. Agregue 5x tripsina a las células (1 ml por plato de 100 mm), asegurándose de cubrir toda la superficie con la tripsina. Espere 30 s y retire cuidadosamente la tripsina.</li>
	<li>Incubar la placa de Petri durante 5-10 min a 37 °C en la incubadora. Toque el plato de 100 mm para separar las celdas.</li>
	<li>Añadir 10 ml de DMEM sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% FCS, y 1% de penicilina y estreptomicina para neutralizar la tripsina. Pipetee cuidadosamente el medio hacia arriba y hacia abajo para separar las células y homogeneizar la suspensión celular.</li>
	<li>Cuente las células utilizando una cámara de conteo de Malassez o un contador de células automatizado, y ajuste la concentración de las células a 6.25 x 105 celdas / ml de medio. Sembrar 800 μL de la suspensión celular/pozo de una placa de 12 pozos (5 x 105 células) o 400 μl de la suspensión celular/pozo de una placa de 24 pozos (2,5 x 105 células) que contiene la mezcla de transfección. NOTA: Una placa de Petri de 100 mm de adipocitos permitirá la preparación de una placa de 12 pozos o una placa de 24 pozos. Un plato de 100 mm generalmente contiene 6-7 x 106 adipocitos, que corresponden a 5 x 105 adipocitos por pozo de una placa de 12 pozos.</li>
	<li>Incubar las placas en una incubadora de cultivo celular (7% CO2 y 37 °C), y no perturbar las células durante 24 h. Al día siguiente, reemplace cuidadosamente el sobrenadante con DMEM fresco sin piruvato, 25 mM de glucosa, 10% fcS y 1% de penicilina y estreptomicina. NOTA: También es posible sembrar las células en placas de 48 y 96 pozos precubiertas de colágeno, pero tome más precauciones al reemplazar los medios para evitar el desprendimiento de los adipocitos.</li>
</ol>5. Análisis funcional de adipocitos 3T3-L1 transfectados
<ol><li>El objetivo del estudio es derribar 24-48 h y 48-96 h después de la administración de imitación de siRNA o miR para ARNm y proteína, respectivamente.</li>
	<li>Realizar análisis funcionales de adipocitos transfectados para estudiar la señalización de insulina, la captación de glucosa, la secreción de adipoquinas, la lipólisis y la lipogénesis.</li>
</ol>

<ol><li>Klöting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
<li>Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+subcutaneous+abdominal+adipocyte+size%2C+but+not+obesity+itself%2C+predicts+type+II+diabetes+independent+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance.</a> Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).</li>
<li>Blüher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+contributes+to+obesity+related+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases.</a> Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).</li>
<li>Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+other+non-coding+RNAs+in+adipose+tissue+and+obesity%3A+emerging+roles+as+biomarkers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets.</a> Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+the+activation+of+the+p53+pathway+mediate+alterations+in+metabolic+and+secretory+functions+of+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li>
<li>Berthou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tpl2+kinase+regulates+the+COX-2%2Fprostaglandin+E2+axis+in+adipocytes+in+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions.</a> Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).</li>
<li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li>
<li>Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+through+down-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).</li>
<li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo presenta un protocolo detallado para la diferenciación y transfección de adipocitos maduros. Este método de transfección inversa es un método simple, económico y altamente eficiente para transfectar oligonucleótidos como, entre otros, siRNAs, imitadores de micro-ARN y anti-micro-ARN en adipocitos 3T3-L1, que es una de las líneas celulares más difíciles de transfectar. Este método tiene algunas limitaciones que deben considerarse. Este protocolo no es eficiente para la transfección con ADN plásmido, lo que li...

La obesidad se considera un factor de riesgo importante para numerosas enfermedades metabólicas, incluida la resistencia a la insulina (RI), la diabetes tipo 2 (DT2) y las enfermedades cardiovasculares1. Las terapias actuales no han logrado detener la prevalencia en constante aumento de estas enfermedades, y el manejo de la RI de pacientes obesos y diabéticos sigue siendo un problema clínico importante. El tejido adiposo juega un papel crucial en el control de la homeostasis energética, y su expansión patológica durante la obesidad contribuye al desarrollo de IR y DT22,3. Esto pone de relieve la necesidad de comprender mejor el mecanismo molecular implicado en la disfunción de los adipócitos para desarrollar nuevas terapias contra las enfermedades relacionadas con la obesidad. Muchos estudios de investigación han investigado el papel de los ARN codificantes de proteínas en la fisiología de los adipocitos y su asociación con la obesidad.
Más recientemente, el descubrimiento de los ARN no codificantes (NCRNAs), especialmente los micro-RNAs (miRs), ha forjado conceptos novedosos relacionados con el mecanismo de regulación de los programas de expresión génica. Los estudios han demostrado que los ncRNAs son importantes reguladores de la función de los adipocitos, y que su desregulación juega un papel importante en las enfermedades metabólicas4. Así, la manipulación de proteínas y ncRNAs en adipocitos es crucial para descifrar sus papeles en la función de los adipocitos y su impacto en patologías como la DT2. Sin embargo, la manipulación de la expresión de proteínas y ncRNAs in vivo, así como en adipocitos primarios sigue siendo un gran desafío, favoreciendo el uso de modelos de adipocitos in vitro.
Los fibroblastos murinos 3T3-L1 se diferencian fácilmente en adipocitos maduros, funcionales y sensibles a la insulina, que son una línea celular bien caracterizada utilizada para estudiar la función de los adipocitos (por ejemplo, señalización de insulina, captación de glucosa, lipólisis y secreción de adipoquinas)5,6,7,8,9,10. Estas propiedades hacen de los adipocitos 3T3-L1 un modelo atractivo para modular la expresión de los arneses codificantes de proteínas y nc-ARN para descifrar su papel en la función de los adipocitos y su papel potencial en las enfermedades relacionadas con la obesidad. Desafortunadamente, mientras que los fibroblastos 3T3-L1 son fáciles de transfectar utilizando reactivos disponibles comercialmente, los adipocitos 3T3-L1 diferenciados son una de las líneas celulares más difíciles de transfectar. Esta es la razón por la que numerosos estudios que manipulan la expresión génica en células 3T3-L1 se han centrado en la diferenciación de adipocitos en lugar de en la función de los adipocitos.
Durante mucho tiempo, la única técnica eficiente para transfectar adipocitos fue la electroporación5,que es tediosa, costosa y puede causar daño celular. Este artículo informa una técnica de transfección inversa que utiliza un reactivo de transfección común, que reduce el tiempo práctico para la transfección, no tiene ningún efecto sobre la viabilidad celular y es mucho menos costoso que la electroporación. Este protocolo es perfectamente adecuado para la transfección de siRNA y otros oligonucleótidos como imitadores de micro-ARN (imitadores de miR) y anti-miRs. El principio del protocolo de transfección inversa es incubar el reactivo de transfección y los oligonucleótidos para formar un complejo en la placa de cultivo celular y luego sembrar los adipocitos maduros en los pozos. Luego, los adipocitos se vuelven a unir a la superficie de la placa adherente en presencia del complejo oligonucleótidos / reactivo de transfección. Esta metodología simple, eficiente y económica permite estudiar el papel de los ARN y miR codificantes de proteínas en la función de los adipocitos y su papel potencial en las enfermedades relacionadas con la obesidad.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos</td><td>Dutscher 353043</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,5% de tripsina (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>diluido a 5x con D-PBS</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Accell Piscina no objetivo</td><td>Horizon Discovery</td><td>D-001910-10-05</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno tipo I de piel de becerro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's&nbsp; Medio de Águila Modificado (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>41965062</td><td>4,5 g/L de D-glucosa; L-glutamina; no Etanol de piruvato</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr> Control <tr><td>negativo marcado con FAM si-RNA</td><td>Invitrogen</td><td>AM4620</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de glicerol libre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Solución estándar de glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo</td> <td>HSP90Santa Cruz</td><td>sc-131119</td><td>Dilución: 0.5 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>Medio Esencial Mínimo Mejorado (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Insulina Recombinante Humana</td><td>Gibco</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN micro-RNA imita</td><td>Horizon Discovery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer Ensayos Hs_RNU6-2_11</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primeros ensayos Mm_miR-34a_1</td><td>Qiagen</td><td>MS00001428</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Kit de PCR Verde</td><td>Qiagen</td><td>219073</td><td></td></tr><tr><td>Suero para terneros recién nacidos</td><td>Gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Rojo O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Ratón Plin1 si-RNA SMARTpool</td><td>Horizon Descubrimiento</td><td>L-056623-01-0005</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina y estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de perilipina-1</td><td>Señalización celular</td><td>3470</td><td>Dilución: 1/1000</td></tr><tr><td>Placa de Petri 100 mm x 20 mm</td><td>Dutscher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>PKB anticuerpo</td><td>Señalización celular</td><td>9272</td><td>Dilución: 1/1000</td></tr><tr><td>PKB Phospho Thr308 anticuerpo</td><td>Célula Señalización</td><td>9275</td><td>Dilución : 1/1000</td></tr><tr><td>Rosiglitazona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección (INTERFERin)</td><td>Polyplus</td><td>409-10</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-tubulina anticuerpo</td><td>Sigma aldrich</td><td>T6199</td><td>Dilución : 0,5 &micro; g/mL</td></tr> de <tr><td>anticuerpo Vamp2</td><td>R& D Sistemas</td><td>MAB5136</td><td>Dilución : 0,1 y micro; g/mL</td></tr></tbody></table>

un modelo de cultivo celular de adipocitos para estudiar el impacto de la modulación de proteínas y microarn en la función de los adipocitos

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

La alteración de la función de los adipocitos contribuye a la patogénesis de enfermedades metabólicas como la diabetes tipo 2 y la resistencia a la insulina. Esto pone de relieve la necesidad de comprender mejor el mecanismo molecular implicado en la disfunción de los adipócitos para desarrollar nuevas terapias contra las enfermedades relacionadas con la obesidad. Modular la expresión de proteínas y micro-ARN en los adipocitos sigue siendo un gran desafío. Este artículo describe un protocolo para diferenciar los fibroblastos murinos en adipocitos maduros y para modular la expresión de proteínas y micro-ARN en adipocitos maduros a través de la transfección inversa utilizando oligonucleótidos de ARN de interferencia pequeña (siRNA) y micro-ARN imitador (miR mimic). Este protocolo de transfección inversa implica la incubación del reactivo de transfección y los oligonucleótidos para formar un complejo en la placa de cultivo celular al que se añaden los adipocitos maduros. Luego se permite que los adipocitos se vuelvan a unir a la superficie de la placa adherente en presencia del complejo oligonucleótidos / reactivo de transfección. Se pueden realizar análisis funcionales como el estudio de la señalización de insulina, la captación de glucosa, la lipogénesis y la lipólisis en los adipocitos maduros 3T3-L1 transfectados para estudiar el impacto de la manipulación de proteínas o microARN en la función de los adipocitos.

Utilizando el procedimiento de transfección inversa descrito aquí para modular la expresión de proteínas o micro-ARN en adipocitos 3T3-L1, se ha demostrado que los adipocitos preservan su morfología después de la transfección(Figura 1B,C). De hecho, 2 días después de la transfección, los adipocitos estaban bien diseminados y unidos a la placa y presentaban gotas lipídicas multiloculares que son una característica de los adipocitos 3T3-L1 madu...

Aquí se presenta un protocolo para administrar oligonucleótidos como ARN de interferencia pequeña (siRNA), imitadores de microARN (miR) o anti-micro-ARN (anti-miR) en adipocitos maduros para modular la expresión de proteínas y microARN.

Un modelo de cultivo celular de adipocitos para estudiar el impacto de la modulación de proteínas y microARN en la función de los adipocitos

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Este protocolo permite manipular proteínas, o expresión de microARN, en adipocitos diferenciados para estudiar su papel en la función de los adipocitos. Este método de transfección inversa es un método simple, económico y altamente eficiente para transfectar oligonucleótidos en adipocitos 3T3-L1 de ratón. Este método también se puede aplicar a preadipocitos humanos diferenciados en adipocitos.Demostrando el procedimiento estará Melanie Gaudfrin, una técnica de nuestro laboratorio. Cultive los fibroblastos 3T3-L1 en platos de 100 milímetros en DMEM sin piruvato, glucosa 25 milimolar, suero de ternero recién nacido al 10% y uno por ciento de penicilina y estreptomicina. Coloque los platos en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados y siete por ciento de dióxido de carbono.Dos días después de la confluencia, cambie el medio de cultivo, reemplazándolo con DMEM sin piruvato, 25 milimolares de glucosa, 10% FCS y uno por ciento de penicilina y estreptomicina suplementadas con 0.25 milimolares IBMX, 0.25 micromolares dexametasona, cinco microgramos por mililitro de insulina y 10 rosiglitazona micromolar. Incubar los platos durante dos días. Dos días después, reemplace el medio de cultivo con DMEM sin piruvato, 25 milimolares de glucosa, 10% FCS y uno por ciento de penicilina y estreptomicina suplementados con cinco microgramos por mililitro de insulina y 10 rosiglitazona micromolar e incube durante otros dos días.Alimente las células cada dos días con DMEM sin piruvato, glucosa 25 milimolares, 10% FCS y uno por ciento de penicilina y estreptomicina y mantenga las células en la incubadora. Un día o unas horas antes de la transfección, prepare una solución de colágeno tipo I a 100 microgramos por mililitro en etanol al 30% a partir de una solución de stock a un miligramo por mililitro. Agregue 250 microlitros de colágeno por pozo de una placa de 12 pozos o 125 microlitros por pozo de una placa de 24 pozos y extienda la solución sobre la superficie del pozo.Deje la placa sin la tapa debajo de la campana de cultivo hasta que el colágeno se seque. Luego lávelo dos veces con D-PBS. Pipetear el siRNA con un medio esencial mínimo mejorado para mezclar e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.Agregue el reactivo de transfección y el medio esencial mínimo mejorado al siRNA y la pipeta para mezclar. Incubarlo durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego agregue la mezcla de transfección a cada pozo de la placa recubierta de colágeno.Lave las células en la placa de Petri de 100 milímetros dos veces con D-PBS. Agregue 5x tripsina a las células, asegurándose de cubrir toda la superficie con la tripsina. Espere 30 segundos y retire cuidadosamente la tripsina.Incubar la placa de Petri durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados en la incubadora. Luego toque el plato para separar las células, evitando el daño celular. Agregue 10 mililitros de DMEM sin piruvato, 25 milimolares de glucosa, 10% FCS y uno por ciento de penicilina y estreptomicina para neutralizar la tripsina.Pipetee cuidadosamente el medio hacia arriba y hacia abajo para separar las células y homogeneizar la suspensión celular. Cuente las células utilizando una cámara de conteo de Malassez o un contador celular automatizado y ajuste la concentración de las células a 0,625 millones de células por mililitro de medio. Sece 800 microlitros de la suspensión celular por pozo de una placa de 12 pozos o 400 microlitros de la suspensión celular por pozo de una placa de 24 pozos que contiene la mezcla de transfección.Incubar las placas en una incubadora de cultivo celular y no molestarlas durante 24 horas. Al día siguiente, reemplace cuidadosamente el sobrenadante con DMEM fresco sin piruvato, glucosa 25 milimolar, 10% FCS y uno por ciento de penicilina y estreptomicina y devuelva las células a la incubadora. Los puntos de tiempo típicos para detectar el derribo objetivo después de la administración de siRNA o miR son de 24 a 48 horas para el ARNm y de 48 a 96 horas para la proteína.Se pueden realizar experimentos funcionales en adipocitos transfectados, incluida la señalización de insulina, la absorción de glucosa, la secreción de adipoquinas, la lipólisis y la lipogénesis. Se ha demostrado que los adipocitos preservan su morfología después de la transfección. Dos días después de la transfección, los adipocitos presentaron gotas lipídicas multiloculares con contenido lipídico no diferente entre los adipocitos transfectados y no transfectados.La expresión de ARNm de varios marcadores de diferenciación no se modificó en las células transfectadas en comparación con la de los adipocitos no transfectados. El protocolo de transfección inversa es eficiente ya que más del 70% de los adipocitos fueron transfectados. Tres días después de la transfección con siRNA contra Perilipina-1, el nivel de ARNm de Perilipina-1 había disminuido en un 70% y el nivel de proteína en un 63%La expresión de Perilipina-1 también se analizó por microscopía de fluorescencia cuatro días después de la transfección y se encontró que había disminuido en un 92% en comparación con su expresión en adipocitos de control.La transfección inversa de adipocitos con microARN que imita a los oligonucleótidos para regular al pie la expresión de miR-34a se muestra aquí. La sobreexpresión de miR-34a condujo a la disminución de la expresión de la proteína VAMP2 en un 50%El derribo de la perilipina-1 en los adipocitos 3T3-L1 condujo a un aumento de la lipólisis basal, mientras que la sobreexpresión de miR-34a condujo a la inhibición de la fosforilación de la proteína quinasa B inducida por la insulina y la absorción de glucosa. Es importante alcanzar un alto nivel de diferenciación de adipocitos para realizar la transfección en adipocitos recién diferenciados y controlar cuidadosamente el tratamiento de los adipocitos con tripsina.Después de la transfección, es posible realizar experimentos funcionales en los adipocitos para estudiar el impacto de las proteínas o la manipulación de microARN en la señalización de la insulina, la absorción de glucosa, la lipogénesis y la lipólisis.

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