Name: Inmersión alternativa en glucosa para producir hiperglucemia prolongada en el pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprende a inducir hiperglucemia prolongada en Danio rerio mediante inmersión alternativa en glucosa. Este protocolo no invasivo permite estudiar complicaciones diabéticas y evaluar respuestas inflamatorias retinianas en modelo animal.

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Nos gustaría dar las gracias a VPC, CJR y MCP por el desarrollo de este protocolo. EMM recibió apoyo financiero de la American University College of Arts and Sciences Graduate Student Support para llevar a cabo esta investigación. Este trabajo también fue apoyado por un Premio Mellon de la Facultad de la Universidad Americana y la financiación a través de la American University College of Arts and Sciences (ambos a VPC).

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de american university.
1. Preparación de los tanques de solución
<ol><li>Obtenga seis tanques, dos para cada grupo experimental (glucosa, manitol y agua). Etiquete uno de los dos tanques como "tanque de alojamiento" (albergará el pescado) y etiquete el otro "tanque de solución" (sostendrá la solución). NOTA: El grupo de tratamiento de manitol es el control osmótico, y el grupo de tratamiento de agua es un control de manejo / estrés. Es importante mantener los tanques, las líneas aéreas/airstones, las tapas y los suministros de limpieza separados para cada grupo de tratamiento</li>
	<li>Utilice un tanque de 2 L si el número total de peces utilizados es menor que 20. Utilice un tanque de 4 L si el número total de peces utilizados es superior a 20. NOTA: Utilice un N de 5-10 por grupo de tratamiento por punto de tiempo de muestreo.</li>
	<li>Mantenga los tanques en un baño de agua a 28-29 °C para mantener la temperatura del agua.</li>
	<li>El día 1, coloque los peces en sus respectivas soluciones de tratamiento (glucosa, manitol, agua) durante 24 horas ('Agua a tratamiento'). El día 2, transfiera los peces de sus soluciones de tratamiento al agua durante 24 horas ('Tratamiento a agua'). El día 3, transfiera los peces del agua a las soluciones de tratamiento ('Agua a tratamiento'). Esta exposición alterna continúa durante el resto del experimento (Figura 1). Transfiera diariamente los peces de control tratados con agua del agua al agua.</li>
	<li>Asegúrese de que los peces sean alimentados y transferidos dentro de la misma ventana de 2 horas cada día durante la duración del experimento.</li>
</ol>2. Preparación del pescado
<ol><li>Utilizar pez cebra adulto (4 meses – 1 año)5.</li>
	<li>Alimente a los peces molidos con escamas tetramin diariamente a su llegada al laboratorio.</li>
	<li>Registrar el pH y la temperatura de todos los tanques y registrar el estado general de los peces.</li>
</ol>3. Transferencia de peces
<ol><li>Transfiera los peces de cada grupo de tratamiento del tanque de alojamiento al tanque de solución correspondiente utilizando una red de pescado estándar.</li>
	<li>Coloque el tanque que contiene los peces de nuevo en el baño de agua, reemplace la piedra de aire y la tapa del tanque. Este tanque es ahora el "tanque de alojamiento" y el tanque que anteriormente contenía el pez es ahora el "tanque de solución".</li>
	<li>Deseche la solución vieja y limpie el tanque, junto con las tapas del tanque, las líneas aéreas, las piedras de aire y las redes para evitar la acumulación de glucosa y manitol. NOTA: No lave los artículos con jabón. Use agua y un cepillo/esponja de exfoliación dedicado para cada condición de tratamiento para limpiar adecuadamente los tanques.</li>
	<li>Seque los "tanques de solución" recién limpiados con una toalla de papel. Prepare las soluciones para el día siguiente utilizando este tanque. Asegúrese de que los demás elementos estén secos y separados por los grupos de tratamiento apropiados. NOTA: Mantenga un registro de las soluciones de las que los peces se transfieren fuera y hacia cada día, así como las soluciones que se preparan para el día siguiente. Por ejemplo: Pescado transferido de glucosa aH2O, nueva solución de glucosa al 1% preparada para mañana.</li>
</ol>4. Preparación de la solución posterior a la transferencia
<ol><li>Preparación de soluciones de azúcar<ol>
<li>Llene cada tanque de solución con 2 L (o 4 L) de agua del sistema (el agua del sistema se define como el agua que ha sido tratada con la proporción correcta de solución salina y está a la misma temperatura que los tanques de stock y tratamiento).</li>
		<li>Mida la cantidad correcta de glucosa y manitol (consulte el paso 5 a continuación) utilizando una báscula de carga superior y botes de pesaje separados para cada producto químico.</li>
		<li>Agregue la alícuota de glucosa o manitol pesada al tanque de solución limpia apropiado, que contiene solo agua del sistema.</li>
		<li>Revuelva las soluciones de glucosa y manitol con barras de agitación de vidrio separadas hasta que los azúcares se disuelvan por completo.</li>
		<li>Devolver los tanques de solución al baño de agua y cubrir con sus correspondientes tapas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de soluciones de agua<ol>
<li>Llene los tanques experimentales (2 L o 4 L) con agua del sistema.</li>
		<li>Devuelva estos 'tanques de solución' al baño de agua y cubra con sus tapas correspondientes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Cambio de porcentajes
<ol><li>Mantenga el pescado en una solución al 1% durante las primeras 2 semanas de tratamiento: 40 g de glucosa o manitol en un tanque de 4 L.</li>
	<li>Mantener el pescado en una solución al 2% durante las semanas 3 y 4 de tratamiento: 80 g de glucosa o manitol en un tanque de 4 L.</li>
	<li>Mantenga el pescado en una solución al 3% durante las últimas 4 semanas de tratamiento: 120 g de glucosa o manitol en un tanque de 4 L.</li>
</ol>6. Medición de los niveles de glucosa en sangre y recolección de tejido
<ol><li>Anestesiar los peces 2 a la vez en una solución Tricaine al 0,02%.</li>
	<li>Decapitar los peces directamente detrás de las branquias usando una navaja de afeitar.</li>
	<li>Mida el valor del azúcar en la sangre. NOTA: Utilizamos un medidor de glucosa en sangre (por ejemplo, Freestyle Lite) para medir la glucosa en sangre y colocar la tira reactiva directamente en el corazón expuesto (muestra de sangre cardíaca).</li>
	<li>Diseccionar el tejido deseado de los peces (cerebro, músculo, etc.).</li>
	<li>Almacene el tejido recolectado mediante congelación repentina sobre hielo seco y almacenamiento en un congelador de -80 °C, fijando en paraformadehído al 4% o colocándolo en una solución tampón para uso inmediato.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

La diabetes es un problema nacional. Los estudios muestran que para 2030, se estima que 400 millones de personas tendrán algún tipo de diabetes. En modelos de roedores, la DM tipo 2 se estudia mediante manipulación genética. En ratas, las ratas grasas diabéticas de Zucker (ZDF), y las ratas grasas de Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF), están proporcionando más información sobre los efectos del tipo - 2 DM10. Además, las dietas altas en grasas se han utilizado en roedores para inducir hiperglucemi...

El pez cebra(Danio rerio)se está convirtiendo rápidamente en un modelo animal ampliamente utilizado para estudiar tanto la enfermedad como la cognición1. La facilidad de la manipulación genética y la transparencia embrionaria a través de las primeras etapas del desarrollo, los convierten en un candidato principal para estudiar enfermedades humanas con una base genética conocida. Por ejemplo, el pez cebra se ha utilizado para estudiar el síndrome de Holt-Oram, las cardiomiopatías, la enfermedad renal glomerulocística, la distrofia muscular y la diabetes mellitus (DM) entre otras enfermedades1. Además, el modelo de pez cebra es ideal debido al pequeño tamaño de la especie, la facilidad de mantenimiento y la alta fecundidad2,3.
El páncreas del pez cebra es anatómica y funcionalmente similar al páncreas demamíferos 4. Por lo tanto, las características únicas de tamaño, alta fecundidad y estructuras endocrinas similares hacen del pez cebra un candidato adecuado para estudiar las complicaciones relacionadas con la DM. En el pez cebra, existen dos métodos experimentales utilizados para inducir la hiperglucemia prolongada que es característica de la DM: una afluencia de glucosa (modelado tipo 2) y el cese de la secreción de insulina (modelado tipo 1)5,6. Experimentalmente, para parar la secreción de la insulina, las β-células pancreáticas se pueden destruir químicamente usando las inyecciones del Streptozotocin (STZ) o del Alloxan. STZ se ha utilizado con éxito en roedores y pez cebra, dando lugar a complicaciones asociadas conla retinopatía 7,8,9,deterioro cognitivo10,y la regeneración de extremidades11. Sin embargo, en el pez cebra, las células β se regeneran después del tratamiento, haciendo que las "inyecciones de refuerzo" de STZ sean necesarias para mantener las condiciones diabéticas12. Alternativamente, el páncreas del pez cebra se puede extirpar6. Estos son procedimientos altamente invasivos, debido a las múltiples inyecciones, y un extenso tiempo de recuperación.
Inversamente, la hiperglucemia se puede inducir no invasor con la exposición a la glucosa exógena. En este protocolo, los peces se sumergen en una solución de glucosa altamente concentrada durante 24 horas5,13 o continuamente durante 2 semanas14,15,16. La glucosa exógena se toma por vía transdérmica, por ingestión, y /o a través de las branquias, lo que resulta en niveles elevados de azúcar en la sangre. Dado que esta técnica no invasiva no manipula directamente los niveles de insulina, no puede pretender inducir dm tipo 2. Sin embargo, se puede utilizar para examinar las complicaciones inducidas por la hiperglucemia, que es uno de los principales síntomas de la DM tipo 2.
Recientemente, el mutante de pez cebra pdx1-/- fue desarrollado mediante la manipulación del gen homeobox 1 pancreático y duodenal, un gen vinculado a la causa genética del tipo 2 DM en humanos. Usando este mutante, los investigadores han podido replicar la interrupción del desarrollo pancreático, el alto nivel de azúcar en la sangre y estudiar la retinopatía diabética inducida por hiperglucemia17,18.
En este papel, describimos un método no invasor de la inducción de la hiperglucemia que utilice un protocolo de la inmersión que se alterna. Este protocolo mantiene condiciones hyperglycemic por hasta 8 semanas con las complicaciones subsecuentes observadas. En resumen, los peces cebra adultos se colocan en una solución de azúcar durante 24 horas y luego en una solución de agua durante 24 horas. A diferencia de la inmersión continua en soluciones externas de glucosa, la alternancia de días entre el azúcar y el agua imita el aumento y la caída del azúcar en la sangre en la diabetes. Un protocolo de glucosa alterna, además, permite que la hiperglucemia sea inducida por períodos de tiempo más largos, ya que el pez cebra no es tan capaz de compensar las altas condiciones externas de glucosa. Como prueba del principio, proporcionamos los datos que muestran que la hiperglucemia inducida usando este protocolo altera química y fisiología retinianas.

<table><tbody><tr><td>Tubo de línea de aire</td><td>petsmart</td><td>5291863</td><td>Esto se puede usar en el tanque para hacer circular el aire</td></tr><tr><td>Bomba</td> de aire <td>petsmart</td><td>5094984</td><td>Esto se puede usar en el tanque para hacer circular el aire</td></tr><tr><td>Airstones</td><td>petsmart</td><td>5149683</td><td>Esto se puede usar en el tanque para hacer circular el aire</td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270-5KG</td><td></td></tr><tr><td>D-manitol</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>AC125340050</tr><tr><td>Freestyle Lite Meter</td><td>Amazon</td><td>B01LMOMLTU</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Lite Tiras</td><td>Amazon</td><td>B074ZN3H2Z</td><td></td></tr><tr><td>Net</td><td>petsmart</td><td>5175115</td><td></td></tr><tr><td>Camisetas sin mangas Amazon</td><td></td><td>B0002APZO4</td><td></td></tr></tbody></table>

inmersión alternativa en glucosa para producir hiperglucemia prolongada en el pez cebra

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Los peces cebra(Danio rerio)son un excelente modelo para investigar los efectos de la hiperglucemia crónica, un sello distintivo de la Diabetes Mellitus Tipo II (DM2). Este protocolo alternativo de inmersión es un método no invasivo y gradual para inducir la hiperglucemia hasta por ocho semanas. Los peces cebra adultos se exponen alternativamente al azúcar (glucosa) y al agua durante 24 horas cada uno. El pez cebra comienza el tratamiento en una solución de glucosa al 1% durante 2 semanas, luego una solución al 2% durante 2 semanas y, finalmente, una solución al 3% durante las 4 semanas restantes. En comparación con los controles tratados con agua (estrés) y manitol (osmóticos), el pez cebra tratado con glucosa tiene niveles de azúcar en la sangre significativamente más altos. El pez cebra tratado con glucosa muestran niveles de azúcar en la sangre de 3 veces el de los controles, lo que sugiere que después de cuatro y ocho semanas se puede lograr la hiperglucemia. La hiperglucemia continua fue asociada a la proteína ácida fibrilosa glial creciente (GFAP) y a los niveles nucleares crecientes de la Kappa B (N-F-kB) del factor en retina y a respuestas fisiológicas disminuidas, así como los déficits cognoscitivos que sugerían que este protocolo se puede utilizar para modelar complicaciones de la enfermedad.

Utilizando este protocolo(Figura 1),los valores de azúcar en sangre se elevan significativamente después de 4 semanas y 8 semanas de tratamiento(Figura 2A),con hiperglucemia definida como 3 veces los promedios de control de los grupos tratados con agua y manitol. Los controles tratados con agua se transfieren dentro y fuera del agua diariamente, proporcionando un control de estrés / manejo. El manitol sirve como un control osmótico en estudios de glucosa in vitr...

Este protocolo no invasiva induce hiperglucemia en el pez cebra durante un tiempo de hasta 8 semanas. Usando este protocolo, un estudio profundizado de los efectos nocivos de la hiperglucemia puede ser hecho.

Inmersión alternativa en glucosa para producir hiperglucemia prolongada en el pez cebra

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

Este protocolo induce hiperglucemia en pescados de la cebra en un patrón de la subida y de la caída que mímico la hiperglucemia que se considera en el tipo diabetes dos. La principal ventaja de esta técnica es que se trata de una técnica no invasiva que permite asegurar que la hiperglucemia es la causa de las alteraciones observadas en los peces hiperglucémicos. Este protocolo se podría potencialmente utilizar para explorar las avenidas terapéuticas o los productos farmacéuticos que apuntan complicaciones de la hiperglucemia.Este protocolo tiene muchos pasos, pero cuando los pasos se siguen correctamente y con cuidado, debería convertirse rápidamente en una segunda naturaleza. Recuerde, sin embargo, siempre tratar a los animales con suavidad y humanidad a lo largo de todo el protocolo. Comience por establecer seis tanques, dos para cada grupo experimental.Utilice tanques de dos litros, si el número total de peces es inferior a 20 y tanques de cuatro litros si el número total de peces es superior a 20. Etiquete uno de los dos tanques, el tanque de alojamiento y el otro tanque de solución. Mantenga los tanques en un baño de agua a 28 a 29 grados Centígrados para mantener la temperatura del agua.El primer día, coloque los peces en sus respectivas soluciones de tratamiento durante 24 horas. El segundo día, transfiera los peces de sus soluciones de tratamiento al agua durante 24 horas. El tercer día, transfiera los peces del agua a las soluciones de tratamiento.Continúe con esta exposición alterna durante el resto del experimento. Transferencia diaria de peces de control tratados con agua de agua a agua. Asegúrese de que los peces sean alimentados y transferidos dentro de la misma ventana de dos horas cada día durante la duración del experimento.Transfiera los peces de cada grupo de tratamiento del tanque de alojamiento al tanque de solución correspondiente utilizando una red de pescado estándar. Coloque el tanque que contiene los peces de nuevo en el baño de agua y reemplace la piedra de aire y la tapa del tanque. Este tanque es ahora el tanque de alojamiento y el tanque que anteriormente contenía el pez es ahora el tanque de solución.Deseche la solución vieja y limpie el tanque junto con las tapas del tanque, las líneas de aire, las piedras de aire y las redes para evitar la acumulación de glucosa y manitol. Use agua y una esponja dedicada para cada condición de tratamiento para limpiar adecuadamente los tanques. Seque los tanques de solución recién limpiados con una toalla de papel y prepare las soluciones para el día siguiente usando este tanque.Asegúrese de que los demás elementos estén secos y separados por los grupos de tratamiento apropiados. Para preparar las soluciones de azúcar, llene cada tanque de solución con dos o cuatro litros de agua del sistema. Mida la cantidad correcta de glucosa y manitol usando una báscula de carga superior y botes de pesaje separados para cada producto químico.Agregue la alícuota de glucosa o manitol pesada al tanque de solución limpia apropiado. Revuelva las soluciones con barras de agitación de vidrio separadas hasta que los azúcares se disuelvan por completo. A continuación, devuelva los tanques de solución al baño de agua y cúbralos con sus tapas correspondientes.Para preparar la solución de agua, llene los tanques experimentales con agua del sistema Devuelva estos tanques de solución al baño de agua y cúbralos con sus tapas correspondientes. Los valores del azúcar de sangre fueron elevados perceptiblemente después de tratamientos de la glucosa de cuatro semanas y de ocho semanas. Con hiperglucemia definida como tres veces los promedios de control de los grupos tratados con agua y manitol tratados.El tejido retiniano recogido después de cuatro semanas de hiperglucemia tenía un aumento en niveles ácidos fibrilosos glial de la proteína o de GFAP. La expresión de GFAP se observa en las células gliales de Mueller en la retina, que se alteran en la retinopatía diabética. Este aumento en GFAP fue asociado a un aumento en niveles nucleares del kappaB del factor.Sugiriendo que la hiperglucemia inducida acciona una respuesta inflamatoria y un gliosis reactivo. Las grabaciones del ERGIO después de cuatro semanas del tratamiento identificaron una respuesta disminuida en las retinas tratadas glucosa comparadas a los controles tratados manitol. Las amplitudes del fotorreceptor y de los componentes bipolares de la célula fueron disminuidas en pescados hyperglycemic.Este procedimiento se puede complementar con otras pruebas de hiperglucemia. Por ejemplo, un ensayo de memoria se puede utilizar para observar los déficits cognitivos o registrar respuestas basadas en la visión, como la respuesta optomotora para evaluar las complicaciones basadas en la visión. Una vez establecida esta técnica, nuestro laboratorio pudo utilizarla para estudiar complicaciones inducidas por hiperglucemia en el modelo de pez cebra.Observamos estas complicaciones relativamente rápidamente, después de cuatro semanas del tratamiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Demostramos inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra. Nosotros usamos un 10 l microjeringa NanoFil controlado por un controlador Micro4 y III UltraMicroPump. Esta demostración incluye el uso de agua fría como un anestésico.

Inyección intraperitoneal en adultos de pez cebra

Este video describe la técnica de creación de un modelo de pez cebra para la diabetes mellitus tipo 1 con la ayuda del medicamento Streptozocin, para estudiar la fisiopatología de las complicaciones diabéticas y la memoria metabólica.

Tratamiento con estreptozocina: un modelo de pez cebra con diabetes mellitus tipo 1

Memoria metabólica es el fenómeno por el cual las complicaciones diabéticas persistir y progresar sin obstáculos, incluso después de euglucemia se logra farmacéuticamente. Aquí se describe un modelo de pez cebra diabetes mellitus, que es la única que permite el examen de los componentes epigenéticos mitóticamente transmisibles de memoria...

Un modelo de pez cebra de la diabetes mellitus y la memoria metabólica

El pez cebra es un importante organismo modelo para el estudio de la homeostasis energética.  Mediante la utilización de un indicador redox sensible a NADH2, alamar Blue, hemos desarrollado un ensayo que mide la tasa metabólica de las larvas de pez cebra en un formato de placa de 96 pocillos y se puede aplicar al descubrimiento de fármacos o genes.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Ensayo gasto energético

Este trabajo describe métodos para establecer modelos de hiperglucemia aguda y crónica en el pez cebra. El objetivo es investigar el impacto de la hiperglucemia sobre los procesos fisiológicos, tales como la neurogénesis constitutiva y la inducida por lesión. El trabajo también destaca el uso de pez cebra para seguir moléculas radiomarcadas (aquí, [ 18 F] -FDG) utilizando PET / CT.

Modelos agudos y crónicos de la hiperglucemia en el pez cebra: un método para evaluar el impacto de la hiperglucemia en la neurogénesis y la biodistribución de las moléculas radiomarcadas

Aquí, discutimos un protocolo de método que permita un fácil análisis de la vasculatura retiniana del pez cebra adulto tg(fli:EGFP) como una lectura rápida en entornos de patologías vasculares a largo plazo vinculados a la neoangiogénesis y cambios estructurales.

Estudiar la Diabetes a través de los ojos de un pez: Microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:EGFP)

Funcionalidad de la célula beta es importante para la homeostasis de la glucosa en sangre, que es evaluada en unicelulares resolución usando un reportero genéticamente codificado para la afluencia del calcio.

Análisis de la función de célula Beta usando proyección de imagen de resolución sola célula calcio en islotes de pez cebra

Presentamos una cámara conductual diseñada para evaluar el rendimiento cognitivo. Proporcionamos datos que muestran que una vez adquirido, el pez cebra recuerda la tarea 8 semanas después. También mostramos que el pez cebra hiperglucémico ha alterado el rendimiento cognitivo, lo que indica que este paradigma es aplicable a los estudios que evalúan la cognición y la memoria.

La tarea de comportamiento de elección de tres cámaras utilizando el pez cebra como sistema modelo

Paradigma clásico condicionamiento del miedo se ha adaptado para que los participantes humanos en un entorno de realidad virtual de inmersión total. Utilizando un paradigma de la discriminación, el miedo condicionado el momento justo, y la retención de la memoria contexto, y la extinción se midió con la respuesta de conductancia de la piel a la dinámica serpientes y arañas virtuales (estímulo condicionado) en dos contextos virtuales distintos.

El condicionamiento del miedo humanos realizados en inmersión completa en 3 dimensiones de Realidad Virtual

El vídeo de la actualidad muestra un método que aprovecha las ventajas de la combinación de electroporación y la microscopía confocal para realizar las imágenes en vivo en cada células progenitoras neurales en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Aprende a inducir hiperglucemia prolongada en Danio rerio mediante inmersión alternativa en glucosa. Este protocolo no invasivo permite estudiar complicaciones diabéticas y evaluar respuestas inflamatorias retinianas en modelo animal.

Inmersión alternativa en glucosa para producir hiperglucemia prolongada en el pez cebra

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