Name: Un método de cultivo para mantener las células madre hematopoyéticas humanas quiescentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprende a mantener células madre hematopoyéticas humanas en estado quiescente in vitro mediante un método que replica el microambiente de médula ósea. Este protocolo permite evaluar compuestos terapéuticos sin modelos animales.

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Agradecemos a M. Haraguchi y S. Tamaki por soporte técnico y gestión de laboratorio y a K. Shiroshita por tomar fotografías. HK recibió el apoyo en parte de la Subvención KAKENHI de MEXT/JSPS (subvención Nº 19K17847) y el Centro Nacional de Salud y Medicina Mundiales. KT recibió el apoyo en parte de las Subvenciones KAKENHI de MEXT/JSPS (subvención Nº 18H02845 y 18K19570), Centro Nacional de Salud y Medicina Mundial (subvención nº 26-001 y 19A2002), AMED (grant nos. JP18ck0106444, JP18ae0201014 y JP20bm0704042), Ono Medical Research Foundation, Kanzawa Medical Research Foundation y Takeda Science Foundation.

El protocolo sigue las directrices del Centro Nacional de Salud y Medicina Mundial. Todos los procedimientos experimentales realizados en ratones son aprobados por el Comité de Experimentos con Animales del Centro Nacional de Salud y Medicina Global. NOTA: Se ilustra una visión general del protocolo en la Figura 1.
1. Preparación lipídica
<ol><li>Disolver los siguientes lípidos en metanol en tubos de vidrio a las concentraciones indicadas: palmitato sódico, 16 mg/ml; oleato de sodio, 30 mg/ml; y colesterol, 4 mg/ml. Almacene la solución lipídica a -30 °C y descongele la muestra antes de usarla.</li>
	<li>Mezcle las soluciones lipídicas preparadas en el paso 1.1 en un tubo de vidrio fresco a las dosis necesarias para obtener la concentración final de 100 μg/ml de palmitato, 100 μg/mL oleato y 20 μg/mL de colesterol. Por ejemplo, al preparar 10 ml de medios de cultivo, mezcle 62,5 μL de solución de palmitato, 33 μL de solución de oleato y 50 μL de solución de colesterol en el tubo de vidrio.</li>
	<li>Evaporar el metanol pasando gas nitrógeno a través de la solución lipídica(Figura 2A y 2B). Si no hay gas nitrógeno disponible, pase aire a través de la solución mediante una pipeta-ayuda.</li>
	<li>Evapore completamente el metanol restante calentando el tubo de vidrio en un baño de agua a 37 °C(Figura 2C). NOTA: El uso de una alta concentración de gas N2 en el espacio confinado es potencialmente dañino. Aunque el volumen utilizado en el protocolo para evaporar el metanol es limitado y por lo tanto se considera seguro, ventilar la habitación adecuadamente y etiquetar áreas de concentraciones potencialmente altas de gas N2 es importante en caso de que se produzca una fuga de gas inesperada.</li>
</ol>2. Preparación media
<ol><li>Prepare el medio Eagle modificado (DMEM) /F12 de Dulbecco (con HEPES y glutamina). Añadir sulfato de penicilina y estreptomicina al medio a la concentración final de 50 unidades y 50 μg/ml, respectivamente. El medio DMEM/F12 que contiene antibióticos se puede almacenar a 4 °C durante al menos 2 meses.</li>
	<li>Añadir 4% w/v de albúmina sérica bovina (BSA) al medio Eagle modificado (DMEM) / F12 de Dulbecco (con HEPES y glutamina).</li>
	<li>Ajuste el pH del medio al pH 7.4-7.8 utilizando la solución NaOH, normalmente a pH 7.6.</li>
	<li>Agregue el medio al tubo de vidrio preparado en el paso 1. Para lograr una solución con máxima solubilidad, se recomienda la adición de medio de 3-15 ml.</li>
	<li>Disolver completamente los lípidos por sonicación (óptimo: más de 20 min de sonicación). Después de disolver el BSA y los lípidos, la muestra debe almacenarse a -80 °C y utilizarse en un plazo de 2 meses. Descongelar inmediatamente antes de su uso.</li>
	<li>Agregue 1/1.000 de la mezcla de insulina, transferrina, selenito sódico y amina de etanol (ITS-X) al DMEM/F12. Filtre el medio mixto utilizando un filtro de 0,22 μm (designado como "medio de referencia cultural"). Antes de su uso, agregue el factor de células madre humanas (SCF) y la trombopoietina humana (TPO) a los medios de cultivo a una concentración final de 3 ng/ml cada uno. Después de añadir las citoquinas y ITS-X, el medio no se puede almacenar.</li>
	<li>Tampone de tinción: Agregue un 10% de FCS a la solución salina tamponada de fosfato sin ca y mg (PBS). Esta solución se puede almacenar a 4 °C durante 2 semanas.</li>
	<li>Medios de descongelación: Agregue un 10% de FCS al DMEM/F12. Esta solución es de un solo uso.</li>
	<li>Solución de citoquina: Disolver cada SCF humano o TPO humano en PBS (libre de ca y mg) a 20 μg/ml. Esta solución se puede almacenar a -80 °C durante al menos un año sin pérdida de actividad. Una vez descongelada, guarde la solución de stock a 4 °C y utilíquela en un plazo de 1 mes. NOTA: Examine el lote después de cada compra para evitar variaciones en los contaminantes en BSA. Cultivo HSC al mismo tiempo con diferentes lotes de BSA y examinar el número fenotípico HSC en el día 7 como se describe a continuación. Si un lote de BSA muestra un número bajo o una frecuencia de celdas CD34+ (por ejemplo, menos de la mitad del número de celdas de entrada), evite usar este lote.</li>
</ol>3. Preparación de médula ósea humana CD34+ células
<ol><li>Comprar cd34 humano+ células de médula ósea y almacenar las células en nitrógeno líquido hasta su uso. Alternativamente, las células de médula ósea de un voluntario saludable o glóbulos de cordón fresco pueden ser utilizadas tras la aprobación del comité ético del instituto y el consentimiento del donante.</li>
	<li>Caliente 10 ml de medios de descongelación en un tubo cónico de 15 ml en un baño de agua de 37 °C.</li>
	<li>Descongelar las células congeladas en viales en un baño de agua a 37 °C en 2 minutos. Después de limpiar el vial con 70% de etanol para eliminar contaminantes, transfiera las células al tubo cónico de 15 ml que contiene el medio precalentado del paso 3.2.</li>
	<li>Centrífuga el tubo de 15 ml a 200 × g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante cuidadosamente para mantener el pellet intacto (dejando < 50 μL de medio). Resuspend las células con el medio restante y transfiéralas a un tubo de 1,5 ml sobre hielo. NOTA: La exposición a muestras derivadas de personas directamente en la mucosa, incluido el ojo o el tejido herido, puede causar infección por patógenos conocidos o desconocidos; por lo tanto, guantes y anteojos se recomiendan al manipular células humanas. Incluso si las células CD34+ compradas dan negativo para el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH1), se debe realizar un seguimiento cuidadoso de acuerdo con las directrices institucionales si se produce una incidencia de exposición. Siga las directrices institucionales al deshacerse de materiales expuestos a células humanas.</li>
</ol>4. Clasificación de HSC
<ol><li>Etiquete las células con anticuerpos fluorocromos conjugados. Mezclar 50 μL de tampone de tinción más 10 μL de anti-CD34-FITC, 2 μL de anti-CD38-PerCP-Cy5.5, 5 μL de anti-CD90-PE-Cy7 y 10 μL de anti-CD45RA-PE. Resuspend el pellet celular en la mezcla de anticuerpos. Incubar las células durante 30 min a 4 °C en la oscuridad.</li>
	<li>Agregue 1 ml de tampone de tinción para lavar los anticuerpos. Centrífuga los tubos a 340 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspend el pellet celular en 0,5 ml de tampone de tinción + 0,1% yoduro de propidio. Transfiera la suspensión a un tubo de 5 ml utilizando un filtro de 40 μm.</li>
	<li>Enciba los HSC fenotípicos dentro del PI-CD34+CD38-CD90+CD45RA- fracción utilizando el FACS Aria-IIIu y ordene las células en un tubo de 1,5 ml lleno con 500 μL de medios de cultivo (Figura 3). Usando la estrategia de gating mostrada en la Figura 3, ~10% de CD34+ se espera que las células sean HSC fenotípicos. Registre el número de celda ordenado para calcular el volumen de medios para resuspend las celdas en el paso 5.3. NOTA: La estrategia de gating se realiza como se describió anteriormente16 mientras se omite la tinción del marcador de linaje dada la baja expresión de marcadores de linaje en la fracción CD34+CD38- de individuos sanos17 .</li>
	<li>Centrífuga las celdas ordenadas a 340 × g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante para asegurarse de que el pellet permanece intacto.</li>
	<li>Almacene las celdas ordenadas en hielo hasta la cultura. NOTA: Durante el primer experimento se debe realizar una compensación por fluorescencia de superposición espectral.</li>
</ol>5. Cultivo celular
<ol><li>Transfiera 200 μL de los medios de cultivo que contienen citoquinas preparadas en el paso 2 en placas planas de 96 pozos.</li>
	<li>Para evitar la evaporación del medio, llene todos los pozos no utilizados con 100-200 μL de PBS.</li>
	<li>Resuspend los HSC ordenados en medios de cultivo sin citoquinas a 60 células/μL.</li>
	<li>Aliquot 600 HSCs/well (10 μL de suspensión celular) en cada pozo. El número de celda se puede modificar. Menos de 300 células conducirán a una variación técnica mayor, y por lo tanto se necesitan más pozos por condición para detectar diferencias biológicas. Se debe evitar la cultivo de más de 1000 células en un solo pozo debido a la privación de citoquinas/nutrientes o la acumulación de citoquinas/quimioquinas desfavorables.</li>
	<li>Culta las células en una incubadora de múltiples gases humidificada a 37 °C en una atmósfera de 5% CO2 y 1% O2. </li>
	<li>Para cultivos de más de 7 días, se recomienda reemplazar la mitad del volumen de medios cada 3-4 días. Aspirar cuidadosamente 100 μL de medios pipeteando y añadir 100 μL de medios de cultivo recién preparados que contengan citoquinas a cada pozo. Los medios de cultivo deben ser pre-calentados a 37 °C.</li>
</ol>6. Análisis de fenotipos de marcadores utilizando citometría de flujo
NOTA: Aunque las células deben analizarse después de 7 días de cultivo, la duración de la referencia cultural se puede cambiar.
<ol><li>Deseche 170 μL del medio mediante una pipeta de 8 canales.</li>
	<li>Etiquete las células con la mezcla de anticuerpos. Mezclar 0,5 μL de anti-CD34-FITC, 0,1 μL de anti-CD38-PerCP-Cy5,5, 0,25 μL de anti-CD90-PE-Cy7, 0,5 μL de anti-CD45RA-PE y 9 μL de tambalo por pozo. Añadir 10 μL de la mezcla a la placa de 96 pozos e incubar las células durante 30 min a 4 °C en la oscuridad.</li>
	<li>Para lavar los anticuerpos, añadir 100 μL de amortiguador de tinción a los pozos y centrifugar las placas a 400 × g durante 5 minutos a 4 °C utilizando baja aceleración y desaceleración media.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente 100 μL del sobrenadante para mantener las células en la parte inferior de los pozos, luego resuspend las células en 200 μL de tampone de tinción + 0.1% v/v de PI + 1% v/v de microesferas fluorescentes (por ejemplo, Fluorosferas de control de flujo).</li>
	<li>Configure el instrumento de citometría de flujo. Adquiera datos para las muestras en modo rápido con el modo de muestra mixta activado y volúmenes de captación de 100 μL.</li>
	<li>Exporte los datos en formato FCS y analícelos utilizando software como FlowJo. Los números de celda se pueden determinar utilizando el recuento de cuentas de microesfera fluorescente. Por ejemplo, si el investigador agrega 2000 cuentas por pozo y el recuento de cuentas es de 700, multiplique el número de células de cada fracción para 2000/700 para estimar el número total de células de la fracción en el pozo. NOTA: Las microesferas fluorescentes son tóxicas para las células cultivadas debido a la presencia de formaldehído. Esto puede inducir la muerte celular durante el análisis. Minimice el número de pozos (<50 pozos) analizados continuamente para evitar sesgos.</li>
</ol>7. Trasplante de HSCs humanos
NOTA: La actividad de repoblación de las células cultivadas se valida mediante trasplante a ratones inmunodeficientes. Todos los procedimientos deben ser aprobados por comités de experimentos con animales o sus equivalentes.
<ol><li>Como donantes, prepare un número suficiente de ratones inmunodeficientes NOD-SCID-Il2rg-null (NOG) de 8-12 semanas. Como los ratones NOG son altamente susceptibles a la infección, mantenga las jaulas de cría lo más limpias posible y alimente a los ratones con una dieta esterilizada y agua.</li>
	<li>Cultivo un número adecuado de HSC para trasplante como se describe en el paso 5. Por ejemplo, cuando 5000 HSC (día 0 equivalente) son trasplantados a 6 ratones receptores, cultivo 35,000-40,000 HSC en 40 pozos de una placa de 96 pozos (200 μL de medios de cultivo por pozo) o en 8 pozos de una placa de 24 pozos (1 mL de medios de cultivo por pozo). Culta las células durante 2 semanas con cambios de medio medio soporte cada 3-4 días en una incubadora multigás humidificada a 37 °C con 5% de CO2 y 1% O2. La duración de la referencia cultural se puede modificar.</li>
	<li>Irradia ratones NOG a 2,5 Gy a 6-24 h antes del trasplante.</li>
	<li>Recoja los HSC cultivados en tubos de 1,5 ml. Centrífuga los tubos a 340 ×g durante 5 min a 4°C.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente los sobrenautas y volver a usar las células en tampones estériles de tinción helada a una densidad celular de 5000 HSC (día 0 equivalente) por 200 μL. Para esterilizar el búfer de tinción, filtrelo utilizando un filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Antes del trasplante, anestesia a los ratones por inhalación de sevoflurano o isoflurano.</li>
	<li>Para trasplantar 5000 HSC cultivados (día 0 equivalente), inyecte 200 μL de la suspensión celular en la vena de la cola o el seno orbital retro de ratones NOG irradiados en el paso 7.1 utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja de calibre 27. Los HSC de médula ósea recién aislados o descongelados se pueden trasplantar como control. Los guantes deben esterilizarse con un 70% de etanol v/v entre cada procedimiento.</li>
</ol>8. Análisis de la frecuencia de las células derivadas de las personas en la sangre periférica
<ol><li>Para examinar la repoblación de células humanas, recoger la sangre periférica a 1, 2 y 3 meses después del trasplante.</li>
	<li>Antes de recoger la sangre periférica, anestesia a los ratones por inhalación de sevoflurano.</li>
	<li>Recoger 40-80 μL de sangre periférica del seno retro-orbital utilizando tubos capilares de vidrio heparinizado y suspender esta muestra en 1 ml de PBS + heparina (1 U/ml) en tubos de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrífuga la suspensión sanguínea a 340 × g durante 3 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a gastar el pellet en 1 ml de PBS + 1,2% w/v dextran (200 kDa) durante 45 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a otro tubo y centrífuga de 1,5 ml a 340 × g durante 3 minutos.</li>
	<li>Para la lisis de los glóbulos rojos, resuspend las células en 0,17 M NH4Cl durante 5 min.</li>
	<li>Centrífuga la suspensión celular 340 × g durante 3 min a 4 °C. Resuspend las células en 50 μL de tampone de tinción que contiene 0,3 μL de bloque Fc anti-ratón. Incubar esta muestra a 4 °C durante 5 min.</li>
	<li>Añadir los siguientes anticuerpos para la tinción del marcador de superficie: 0,3 μL de ratón CD45-PE-Cy7, 0,3 μL ratón Ter-119-PE-Cy7, 0,3 μL de CD45-BV421 humano, 0,3 μL de CD13-PE humano, 1,2 μL de CD33-PE humano, 0,3 μL de CD19-APC humano, 0,3 μL de CD3-APC-Cy7 humano. Incubar las células a 4 °C durante 15 min.</li>
	<li>Lave una vez con 1 ml de amortiguador de tinción y centrífuga a 340 × g durante 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a abrir las células en 200 μL de tampone de tinción + 0,1% v/v de PI.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a una placa de fondo plano de 96 pozos y adquiera datos utilizando el cytómetro de flujo en modo rápido con el modo de muestra de mezcla activado y un volumen de absorción de 100 μL.</li>
	<li>Exporte los datos en formato FCS para su análisis utilizando software como FlowJo.</li>
	<li>Configure el cytómetro de flujo. Adquiera datos para las muestras en modo rápido con el modo de muestra de mezcla activado y un volumen de absorción de 100 μL.</li>
	<li>Exporte los datos en formato FCS para su análisis utilizando software como FlowJo.</li>
</ol>

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<li>Danet, G. H., Pan, Y., Luongo, J. L., Bonnet, D. A., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+human+SCID-repopulating+cells+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Expansion of human SCID-repopulating cells under hypoxic conditions.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (1), 126-135 (2003).</li>
<li>Kikushige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Flt3+is+expressed+at+the+hematopoietic+stem+cell+and+the+granulocyte%2Fmacrophage+progenitor+stages+to+maintain+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Flt3 is expressed at the hematopoietic stem cell and the granulocyte/macrophage progenitor stages to maintain cell survival.</a> Journal of Immunology. 180 (11), 7358-7367 (2008).</li>
<li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+All-Recombinant+Protein-Based+Culture+System+Specifically+Identifies+Hematopoietic+Stem+Cell+Maintenance+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An All-Recombinant Protein-Based Culture System Specifically Identifies Hematopoietic Stem Cell Maintenance Factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li>
</ol>

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses asociado a este estudio.

Recientemente, se han notificado varios métodos para ampliar los HSC con una diferenciación mínima18,19,20,21. Aunque estos métodos son excelentes, los HSC se ven obligados a activar sus ciclos celulares en presencia de altos niveles de citoquinas, que difiere de la situación in vivo en la que los HSC muestran un ciclismo mínimo. Este protocolo es útil para mantener los HSC como reposo, como se observa in vivo, recapitulando el microambiente de médula ósea.
Al cultivar HSC humanos bajo condiciones citoquinas bajas, ricas en lípidos e hipoxis, los HSC mostraron un ciclismo mínimo manteniendo sus fenotipos marcadores. El paso crítico en este protocolo es la preparación de medios que contienen una alta concentración de ácidos grasos y colesterol y bajas concentraciones de citoquinas y cultivo bajo hipoxia (Paso 1, Paso 2 y Paso 4). Sin colesterol y/o ácidos grasos, la tasa de mantenimiento de HSC bajo bajas concentraciones de citoquinas disminuye22. La cultectación de células en condiciones hipoxisas también es importante, como se informó anteriormente23.
Las condiciones de cultivo eran similares a las utilizadas para los HSC murinos, excepto para las concentraciones de citoquinas. Los HSC de Murine sobreviven sin TPO, mientras que los HSC humanos requieren al menos 2 ng/mL de TPO con 3 ng/ml de SCF22. Como la concentración de TPO es mucho mayor que la del suero humano (~100 pg/mL), las condiciones utilizadas en este protocolo pueden estar perdiendo factores específicos para apoyar la supervivencia de los HSC humanos. FLT3 se expresa en HSC humanos24. La adición de su ligando FLT3LG disminuye ligeramente el requisito de TPO para mantener los HSC22.
Los HSC humanos requieren mayores concentraciones de colesterol en comparación con los HSC de murina, presumiblemente debido a la incapacidad de inducir la expresión de enzimas sintetizadoras de colesterol y susceptibilidad a la lipotoxicidad bajo altas concentraciones (>400 μg/ml) de ácidos grasos22. Aunque sólo se probó la combinación de ácidos palmíticos, oleicos, linoleicos y esteáricos, que se encuentran abundantemente en el suero humano, otras combinaciones de lípidos deben evaluarse para reducir la lipotoxicidad y mejorar la tasa de mantenimiento de HSC funcionales.
Aunque la actividad de repoblación de HSC humanos cultivados en ratones inmunodeficientes después de dos semanas de cultivo se ha confirmado22,este sistema de cultivo no recapitula completamente las funciones de nicho de HSC in vivo. Se ha informado de que la expresión de CD45RA aumenta y la capacidad de repoblación es inferior a la de los HSC22recién ordenados. Sin embargo, las concentraciones de nutrientes, como glucosa, aminoácidos, piruvato e insulina, que se añaden al medio a niveles suprafisiológicos, se pueden optimizar. Los contaminantes en BSA también pueden comprometer el mantenimiento de HSC18,25. Además, algunas células cultivadas sufren la muerte celular, mientras que otras sufren división celular; por lo tanto, el mantenimiento del número total de celdas puede no indicar el estado de reposo de cada celda.
A pesar de estas limitaciones, las condiciones de cultivo descritas en el protocolo desarrollado en este estudio ayudarán a avanzar en la investigación e ingeniería de HSC, particularmente en condiciones casi fisiológicas. Las condiciones de cultivo que mantienen los HSC con una mínima diferenciación y actividad ciclista serían adecuadas para probar compuestos biológicos y químicos que actúan específicamente sobre HSC, manipular HSC a través de la transducción de lentivirus o la edición del genoma sin la pérdida de tallo, y dilucidar el paso inicial de transformación inducido por genes asociados a la leucemia.

Las células madre hematopoyéticas (HSC) y las células progenitoras multipotentes (MPPs) forman coordinadamente un reservorio para la reposición continua de células diferenciadas para mantener la hematopoyesis a lo largo de la vida en humanos1. La reposo del ciclo celular es una característica destacada de los HSC, diferenciándolos de los MPP2. Convencionalmente, se cree que los HSC residen en el ápice de la jerarquía del sistema hematopoyético, produciendo todas las células sanguíneas diferenciadas. Este modelo jerárquico se dedujo principalmente de los experimentos de trasplante3. Sin embargo, estudios recientes indicaron que la dinámica de los HSC difiere in vivo en comparación con las de los experimentos de trasplante4,5,6,7. Los experimentos de rastreo de linaje utilizando varios sistemas de código de barras revelaron que los HSC fenotípicos murinos no son un tipo de célula único que contribuye a la hematopoyesis de estado estacionario, y los MPPs, que muestran una actividad limitada de auto-renovación en entornos de trasplante, suministran continuamente células sanguíneas maduras4,5,8. Por el contrario, la contribución de los HSC a las células maduras se mejora después de la lesión de médula ósea4. Esto puede atribuirse a alteraciones drásticas en el microambiente después de la ablación de médula ósea, incluido el trasplante de médula ósea. Aunque aplicar el trazado de linaje de células murinas a células humanas es difícil, el análisis filogenético que combina el aislamiento de colonias derivadas de una sola célula y la secuenciación del genoma completo revelaron una propiedad similar del sistema hematopoyético, en el que tanto los HSC como los MPPs son responsables de la producción diaria de células maduras7. Por lo tanto, aunque el trasplante es esencial para examinar la actividad de la HSC murciana o humana, se necesitan otros modelos experimentales para entender los comportamientos de los HSC en condiciones fisiológicas.
Los métodos de cultivo para HSC se han estudiado en detalle para comprender sus aplicaciones clínicas y características. Los HSC humanos se pueden ampliar in vitro utilizando una combinación de citoquinas, reconstitución de matrices extracelulares, eliminación de antagonistas de autorretración, co-cultivo con células mesenquimales o endoteliales, adición de albúmina o su reemplazo, transducción de factores de transcripción de autorretración, y adición de compuestos de moléculas pequeñas9,10. Algunos de estos métodos, incluyendo la adición de compuestos pequeños SR111 y UM17112, han sido probados en ensayos clínicos con resultados prometedores9. Teniendo en cuenta la naturaleza repososcente de los HSC in vivo, mantener los HSC con ciclo celular mínimo es fundamental para recapitular el comportamiento HSC in vitro. Los HSC quiescentes y proliferadores exhiben la entrada diferencial del ciclo celular13,el estado metabólico14y la tolerancia contra múltiples tensiones15. Los métodos utilizados para mantener la reposo de los HSC humanos in vitro son limitados.
Imitando el microambiente de la médula ósea (hipoxica y rica en lípidos) y optimizando la concentración de citoquinas, los HSC humanos se pueden mantener indiferenciados y en reposo bajo el cultivo. Recapitular la naturaleza reposonte de los HSC in vitro mejorará la comprensión de las propiedades de estado estacionario de los HSC y permitirá la manipulación experimental de HSC.

<table><tbody><tr><td>Células progenitoras CD34+ de médula ósea humana</td><td>Lonza</td><td>2M-101C</td><td></td></tr><tr><td>NOD / Shi-scid, IL-2R &gamma;KO Jic</td><td>In-Vivo Science Inc.</td><td></td><td></td>https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html</tr><tr><td>Anti-humano CD34-FITC (clon: 581)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 560942; RRID: AB_10562559</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD38-PerCP-Cy5.5&nbsp;</td><td>BD biociencias Cat</td><td># 551400; RARO: AB_394184</td><td></td></tr><tr><td>Antihumano CD45RA-PE</td><td>BD biociencias Cat</td><td># 555489; RRID: AB_395880</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD90-PE-Cy7 (clon: 5E10)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 561558; RRID: AB_10714644</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD13-PE (clon: WM15)</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 301703; RRID: AB_314179</td><td></td></tr><tr><td>CD33-PE antihumano (clon: WM53)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 561816; RRID: AB_10896480</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD19-APC (clon: SJ259)</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 363005; RRID: AB_2564127</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD3-APC-Cy7 (clon: SK7)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 561800; RRID: AB_10895381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD45-BV421 (clon: HI30)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 563880; RRID:AB_2744402</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón CD45-PE-Cy7 (clon: 30-F11)</td><td>BioLegend</td><td>Cat# 103114; RRID: AB_312979</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón Ter-119-PE-Cy7 (clon: TER-119)</td><td>BD biosciences</td><td>Cat# 557853; RRID: AB_396898</td><td></td></tr><tr><td>Fc-block (anti-ratón CD16/32) (clon: 2.4-G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 553142; RRID: AB_394657</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Nacalai Tesque Cat</td><td># 14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medio</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific Cat# 11320-033</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat#</td> 51500056 <td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Meiji Seika</td><td></td><td></td>PGLD755</tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Meiji Seika</td><td>SSDN1013</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Palmitoto de sodio</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>Cat# P0007</td><td></td></tr><tr><td>Oleato de sodio</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>Cat# O0057</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>Cat# C0318</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 017-2995</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de hidrógeno de sodio</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 191-01305</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 2Na</td><td>Fujifilm</td><td>Cat# 345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Na</td><td>MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO.,&nbsp;LTD.</td><td>Gato# 224122557</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>Fujifilm</td><td>Gato# 193-17791</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano</td><td>Nacalai Tesque Gato</td><td>#&nbsp; 10927-54</td><td></td></tr><tr><td>SCF humano recombinante</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO humano recombinante</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-18</td><td></td></tr><tr><td>ligando Flt3 humano recombinante</td><td>PeproTech</td><td>Cat# 300-19</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Life Technologies</td><td>Cat# P3566</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosferas de control de flujo</td><td>Beckman Coulter</td><td>Cat# 7547053</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo versión 10</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria3u</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VELVO-CLEAR VS-25 (sonicador)</td><td>VELVO-CLEAR</td><td>N/A Bombona</td><td></td></tr><tr><td>de gas nitrógeno</td><td>KOIKE SANSHO CO., LTD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Regulador de gas</td><td>Astec</td><td>Cat# IM-055</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora multigás</td><td>Astec</td><td>Cat# SMA-30DR</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidrio, 16 mL</td><td>Maruemu corporation</td><td>N-16</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidrio, 50 mL</td><td>Maruemu corporation</td> Unidad de filtro de jeringa <td>NX-50</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP, 0,22 pulgadas; y micro; m, polietersulfona, 33&nbsp; mm, esterilizado con rayos gamma</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGPR33RS</td><td></td></tr></tbody></table>

un método de cultivo para mantener las células madre hematopoyéticas humanas quiescentes

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Las células madre hematopoyéticas humanas (HSC), al igual que otros HSC de mamíferos, mantienen hematopoyesis de por vida en la médula ósea. Los HSC permanecen in vivo en reposo, a diferencia de los progenitores más diferenciados, e ingresan al ciclo celular rápidamente después de la quimioterapia o la irradiación para tratar lesiones de médula ósea o cultivo in vitro. Imitando el microambiente de médula ósea en presencia de abundantes ácidos grasos, colesterol, baja concentración de citoquinas e hipoxia, los HSC humanos mantienen la reposo in vitro. Aquí se describe un protocolo detallado para mantener los HSC funcionales en el estado de reposo in vitro. Este método permitirá estudios sobre el comportamiento de los HSC humanos en condiciones fisiológicas.

Después de 7 días de culturizar los HSC purificados, hasta el 80% de las células mostraron fenotipos de marcadores de CD34+CD38- (Figura 4A). El número total de células dependía de la concentración de citoquinas (Figura 4B). Mayores concentraciones de SCF y TPO indujeron la entrada en el ciclo celular, proliferación y diferenciación (Figura 4B). El número de HSC fenotípicos caracterizados por los fenotipos marcadores de CD34+CD38-CD90+CD45RA- aumentó en proporción a las concentraciones de SCF o TPO (Figura 4B), mientras que la frecuencia entre las células totales disminuyó (Figura 4C). Los números de celda totales fueron iguales en las combinaciones SCF de 1,5 ng/mL y TPO de 4 ng/mL y 3 combinaciones de TPO SCF 3 y 2 ng/mL, lo que sugiere que los HSC son en reposo durante la activación mínima del ciclo celular. Dadas las diferencias individuales, se recomienda la valoración de citoquinas para cada donante de médula ósea.
Después de 3 meses de trasplante de HSC de médula ósea adulta cultivada, la reconstitución puede evaluarse como su frecuencia en la sangre periférica de las células CD45+ murina CD45- Ter119- humanas. Tres linajes, incluyendo células CD19+ B, células mieloides CD13/CD33+ y células T CD3+ fueron reconstituidas en ratones NOG trasplantados con HSC recién descongelados o HSC cultivados(Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig01.jpg"> Figura 1. Descripción general del procedimiento. El resumen gráfico del procedimiento implicó la clasificación, la cultura y el análisis de células madre hematopoyéticas humanas (HSC). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig02.jpg"> Figura 2. Procedimiento para evaporar el metanol de la solución lipídica. A) Cilindro de gas nitrógeno con regulador de gas. B) Procedimiento para pasar gas nitrógeno a través de la solución lipídica disuelta en metanol. C) Lípidos adheridos a la parte inferior del tubo de vidrio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig03.jpg"> Figura 3. Estrategia de Gating para ordenar HSC. Las parcelas muestran celdas cerradas CD34+CD38-CD90+CD45RA- . Aproximadamente 10% de CD34+ células eran HSC fenotípicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig04.jpg"> Figura 4. Números de celda representativos después de 7 días de culto. A) Parcela de clasificación de células activada por fluorescencia representativa después de cultivar los HSC en SCF (3 ng/mL) y TPO (2 ng/mL). La fracción 1 se enriqueció para las células vivas, la fracción 2 se enriqueció para las células muertas y la fracción 3 se enriqueció para los escombros. Los números coloreados en rosa indican la frecuencia (%) de la fracción cerrada. B) Número de todos los HSC, CD34+CD38- celdas, y CD34+CD38-CD90+CD45RA- células después de cultivar 600 HSC bajo las condiciones de citoquinas indicadas. Las líneas discontinuas rojas indican el número inicial de celdas de entrada. S: SCF, T: TPO. Media ± desviación estándar, n = 4. Los números siguientes a S y T indican la concentración (ng/ml) de cada citoquina. C) Frecuencia de CD34+CD38- y CD34+CD38-CD90+CD45RA- células bajo las condiciones de citoquinas indicadas. S: SCF, T: TPO. Media ± desviación estándar, n = 4. Las barras de error para las celdas cultivadas en SCF (1 ng/mL) y TPO (0 ng/mL) se omitieron debido a sus valores altos (37,7 y 47,9, respectivamente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61938/61938fig05.jpg"> Figura 5. El representante FACS planea de ratones donantes después de 3 meses de trasplante. Un total de 5000 HSC cultivados (3 ng/mL SCF y 3 ng/mL TPO; paneles inferiores) fueron trasplantados en ratones NOG. hCD19 marca las células B humanas, hCD13 y hCD33 marcan las células mieloides humanas, y hCD3 marca las células T humanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61938/61938fig05large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo permite el mantenimiento de células madre hematopoyéticas humanas en reposo in vitro imitando el microambiente de médula ósea utilizando abundantes ácidos grasos, colesterol, concentraciones más bajas de citoquinas e hipoxia.

Un método de cultivo para mantener las células madre hematopoyéticas humanas quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

La reposo del ciclo celular es una característica clave de las células madre hematopoyéticas. Este protocolo ayuda a entender el comportamiento de los HSC humanos en reposo in vitro en condiciones fisiológicas cercanas. Utilizando este protocolo, los investigadores pueden probar el efecto de varios compuestos, nutrientes o proteínas que regulan el estado del ciclo celular, así como la diferenciación de los HSC de una manera escalable sin utilizar modelos animales.Los medicamentos contra el cáncer tienen efectos variables en la supervivencia de los HSC en reposo y los progenitores del ciclismo. Este protocolo permite encontrar agentes que perdonen los HSC o agentes que dañan selectivamente las células madre leucémicas quiescentes. Demostrando que el procedimiento será Hiroshi Kobayashi, un investigador senior del Laboratorio Takubo.Para empezar, disolver 16 miligramos por mililitro de palmitato sódico, 30 miligramos por mililitro de oleato de sodio y cuatro miligramos por colesterol mililitro en metanol en tubos de vidrio. Almacene las soluciones lipídicas a 30 grados centígrados negativos y descongelarlas antes de usarlas. En un tubo de vidrio fresco, mezcle las soluciones lipídicas para obtener la concentración final de 100 microgramos por mililitro de palmitato, 100 microgramos por oleato de mililitro y 20 microgramos por colesterol mililitro.Evaporar el metanol pasando gas nitrógeno a través de la solución lipídica. Evapore completamente el metanol restante calentando el tubo de vidrio en un baño de agua a 37 grados Centígrados. Preparar dmem / F-12 medio con HEPES y glutamina.Agregue sulfato de penicilina y estreptomicina para una concentración final de 50 unidades y 50 microgramos por mililitro respectivamente. El medio se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante al menos dos meses. Añadir 4% de BSA a DMEM / F-12 medio con HEPES y glutamina, a continuación, ajustar el pH del medio a 7.6 utilizando solución de hidróxido de sodio.Agregue el medio al tubo de vidrio con los lípidos. Disolver completamente los lípidos por sonicación. Si el medio es opaco después de la sonicación, amplíe el tiempo de sonicación.Cuando se disuelven la BSA y los lípidos, las muestras deben almacenarse a 80 grados centígrados negativos y utilizarse en un plazo de dos meses. Agregue 0,001X de insulina, transferrina, selenita sódica y mezcla de amina de etanol al DMEM/F-12 y luego filtre el medio mixto usando un filtro de 0,22 micrómetros. Antes de su uso, agregue el factor de células madre humanas o SCF y trombopoietina humana o TPO a los medios de cultivo a una concentración final de tres nanogramos por mililitro cada uno.Transfiera 200 microlitros de los medios de cultivo preparados previamente con citoquinas a placas planas de 96 pozos. Para evitar la evaporación del medio, llene todos los pozos no utilizados con 100 a 200 microlitros de PBS. Resuspend las células madre hematopoyéticas ordenadas o HSC en medios de cultivo sin citoquinas a 60 células por microlitro.Aliquot 600 células en cada pozo. Menos de 300 células conducirán a una mayor variación técnica y la culturización de más de 1.000 células en un solo pozo debe evitarse debido a la privación de nutrientes o acumulación de citoquinas o quimioquinas desfavorables. Culta las células de una incubadora de múltiples gases humidificada a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono del 5% y 1% de oxígeno.Después de siete días de culturizar los HSC purificados, hasta el 80% de las células mostraron el marcador CD34 positivo y los fenotipos negativos CD38. El número total de células dependía de la concentración de citoquinas. Mayores concentraciones de SCF y TPO indujeron la entrada en el ciclo celular, proliferación y diferenciación.El número de HSC fenotípicos caracterizados por el marcador CD34 positivo, CD38 negativo, CD90 positivos y CD45 RA fenotipos negativos aumentó en proporción a las concentraciones de SCF o TPO, mientras que la frecuencia entre las células totales disminuyó. Después de tres meses de trasplante de HSC de médula ósea adulta cultivada, la reconstitución puede evaluarse en función de su frecuencia en la sangre periférica de la murina positiva CD45 humana, células negativas ter119 negativas CD45. Tres linajes, incluyendo células B positivas CD19, CD13 negativos, células mieloides positivas CD33 y células T positivas CD3 fueron reconstituidas en ratones NOG trasplantados con HSC recién descongelados o cultivados.Tras el cultivo, los HSC pueden someterse a perfiles de expresión génica, como la secuenciación de PCR y ARN en tiempo real. También se puede realizar una validación funcional mediante el trasplante en ratones inmunodeficientes. Los investigadores pueden comparar directamente el ciclismo y los HSC en reposo en condiciones definidas ajustando las concentraciones de citoquinas.Esto ayudará a entender los programas de auto-renovación específicos de HSC, mecanismos de resistencia al estrés y propiedades metabólicas, que son difíciles de probar en entornos vivos.

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