Name: Microdisección del cerebro del ratón en regiones funcional y anatómicamente diferentes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprende a realizar microdisección cerebral en ratón para aislar regiones anatómicas y funcionales específicas. Este protocolo sistemático preserva la integridad molecular del tejido para análisis transcriptómicos de alta calidad en neurociencia.

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Agradecemos a la Sra. Seshmalini Srinivasan, al Sr. Stephen Butler y a la Sra. Pamela Spellman por su asistencia experimental y a la Sra. Dana Youssef por editar el manuscrito. Se agradece el apoyo financiero de USAMRDC. La Fundación de Ginebra contribuyó a este trabajo y fue apoyada por fondos de la Dirección III del Área de Investigación de Medicina Militar y Operacional a través de la Oficina de Investigación del Ejército de los Estados Unidos.
Renuncia:
El material ha sido revisado por el Instituto de Investigación del Ejército Walter Reed. No hay objeción a su presentación y/o publicación. Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son opiniones privadas del autor, y no deben interpretarse como oficiales, o como reflejando verdaderas opiniones del Departamento del Ejército o el Departamento de Defensa. La investigación se llevó a cabo bajo un protocolo aprobado de uso de animales en una instalación acreditada por AAALAC en cumplimiento con la Ley de Bienestar Animal y otros estatutos y regulaciones federales relacionados con animales y experimentos con animales y se adhiere a los principios establecidos en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, Publicación NRC, edición 2011.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El cerebro de los mamíferos es un órgano complejo compuesto por una serie de células morfológicamente distintas y funcionalmente únicas con diversas firmas moleculares y múltiples regiones que realizan funciones especializadas y discretas. El procedimiento de disección que se informa aquí puede tener varios objetivos dependiendo de los requisitos del laboratorio. En nuestro laboratorio evaluamos la transcripción en múltiples regiones cerebrales recolectadas de ratones expuestos al TEPT como el estrés16<...

El cerebro, junto con la médula espinal y la retina, comprende el sistema nervioso central que ejecuta comportamientos complejos, controlados por tipos de células especializadas, posicionadas con precisión e interactivas en todo el cuerpo1. El cerebro es un órgano complejo con miles de millones de neuronas interconectadas y glía con circuitos precisos que realizan numerosas funciones. Es una estructura bilateral con dos lóbulos distintos y diversos componentes celulares2. La médula espinal conecta el cerebro con el mundo exterior y está protegida por hueso, meninges y líquido cefalorraquídeo y enruta mensajes hacia y desde el cerebro 2,3,4. La superficie del cerebro, la corteza cerebral, es desigual y tiene pliegues distintos, llamados giros, y surcos, llamados surcos, que separan el cerebro en centros funcionales5. La corteza es lisa en mamíferos con un cerebro pequeño 6,7. Es importante caracterizar y estudiar la arquitectura del cerebro humano para comprender los trastornos relacionados con las diferentes regiones cerebrales, así como sus circuitos funcionales. La investigación en neurociencia se ha expandido en los últimos años y se están utilizando una variedad de métodos experimentales para estudiar la estructura y función del cerebro. Los desarrollos en los campos de la biología molecular y de sistemas han marcado el comienzo de una nueva era de exploración de la compleja relación entre las estructuras cerebrales y el funcionamiento de las moléculas. Además, la biología molecular, la genética y la epigenética se están expandiendo rápidamente, lo que nos permite avanzar en nuestro conocimiento de los mecanismos subyacentes involucrados en cómo funcionan los sistemas. Estos análisis se pueden llevar a cabo de forma mucho más localizada, para ayudar a orientar la investigación y el desarrollo de terapias más efectivas.
El cerebro de los mamíferos se define estructuralmente en regiones discretas claramente identificables; Sin embargo, las complejidades funcionales y moleculares de estas estructuras discretas aún no se comprenden claramente. La naturaleza multidimensional y de múltiples capas del tejido cerebral hace que este paisaje sea difícil de estudiar a nivel funcional. Además, el hecho de que múltiples funciones sean realizadas por la misma estructura y viceversa complica aún más la comprensión del cerebro8. Es vital que el enfoque experimental ejecutado para la caracterización estructural y funcional de las regiones cerebrales utilice metodologías de investigación precisas para lograr consistencia en el muestreo para correlacionar la arquitectura neuroanatómica con la función. La complejidad del cerebro se ha explicado recientemente utilizando la secuenciación de células individuales 9,10, como el giro temporal del cerebro humano, que se compone de 75 tipos de células distintas 11. Al comparar estos datos con los de una región análoga del cerebro del ratón, el estudio no solo revela similitudes en su arquitectura y tipos de células, sino que también presenta las diferencias. Por lo tanto, para desentrañar los complejos mecanismos, es importante estudiar diversas regiones del cerebro con total precisión. Las estructuras y funciones conservadas entre un cerebro humano y de ratón permiten el uso de un ratón como sustituto preliminar para dilucidar la función cerebral humana y los resultados conductuales.
Con el avance de los enfoques de biología de sistemas, la obtención de información de regiones cerebrales discretas en roedores se ha convertido en un procedimiento clave en la investigación de la neurociencia. Mientras que algunos protocolos, como la microdisección por captura láser12, pueden ser costosos, los protocolos mecánicos son económicos y se realizan utilizando herramientas comúnmente disponibles13,14. Hemos utilizado múltiples regiones cerebrales para ensayos transcriptómicos15 y hemos desarrollado un procedimiento práctico y rápido para diseccionar regiones cerebrales de ratón de interés paso a paso en poco tiempo. Una vez disecadas, estas muestras pueden almacenarse inmediatamente en condiciones frías para preservar los ácidos nucleicos y las proteínas de estos tejidos. Nuestro enfoque se puede realizar más rápido, lo que lleva a una alta eficiencia y permite menos posibilidades de deterioro de los tejidos. En última instancia, esto aumenta las posibilidades de generar experimentos reproducibles y de alta calidad utilizando tejidos cerebrales.

<table><tbody><tr><td>Brain Removal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Deaver</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6762</td><td>5.5" rectas afiladas/afiladas</td></tr><tr><td>Tijeras Deaver</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6763</td><td>5.5" curvadas afiladas/afiladas</td></tr><tr><td>Tijeras de operación delicadas</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6703</td><td>4.75" curvadas afiladas/afiladas</td></tr><tr><td>Tijeras de operación delicadas</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6702</td><td>4.75" rectas afiladas/afiladas</td></tr><tr><td>Tijeras de operación ligeras</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6753</td><td>5" curvadas Afiladas/Afiladas</td></tr><tr><td>Micro espátula, radio y extremos</td><td></td><td></td> planos cónicos <td>acabado de espejo de acero inoxidable</td></tr><tr><td>Tijeras de operación 6.5"</td> <td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6846</td><td>curvadas afiladas/afiladas</td></tr><tr><td>Pinza de tejido</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-8160</td><td>4.5" 1X2 dientes 2mm de ancho de punta</td></tr><tr><td>Rongeur (opcional)</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-8321 muchos estilos para elegir</td><td>Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm</td></tr><tr><td><fuerte>Disección pituitaria</fuerte></td>Mango de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bisturí</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-9843</td><td>Mango de bisturí #3 Sólido 4"</td></tr><tr><td>y cuchillas</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-9801-11</td><td>Hojas de bisturí estéril:#11 Caja 100 pinzas</td>superfinas de 40 mm</tr><tr><td>Inox</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-4955 tamaño de</td><td>la punta 0,025 X 0,005 mm</td></tr><tr><td>Brain Dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A visor de aumento</td><td>Penn Tool Col</td><td>40-178-6</td><td>2,2x Aumento de lente exterior y 3,3x interior, Lupa rectangular</td></tr><tr><td>Placa fría de disección</td><td>Cellpath.com</td><td>JRI-0100-00A</td><td>Placa fría iceberg y base</td></tr><tr><td>Pinzas Graefe, curva completa extra delicada</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-5138</td><td>0.5 mm Punta 4" (10 cm) de largo</td></tr><tr><td>Tijeras de operación ligeras</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6753</td><td>5" curvo afilado/afilado</td></tr><tr><td>Mango de bisturí</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-9843 (repetido arriba)</td><td>Mango de bisturí #3 Sólido de 4"</td></tr> <tr><td>y cuchillas (especialmente #11)</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-9801-11 (repetido arriba)</td><td>Hojas de bisturí estériles:#11 Caja 100</td></tr><tr><td>Espátula</td><td>de</td> 40 mm Amazon <td>MS-SQRD9-4</td><td>Espátula de doble extremo cuadrado Y pinza de tejido de extremo redondo</td></tr><tr><td></td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-8160 (repetido arriba)</td><td>4.5 "1X2 dientes</td></tr></tbody></table>

microdisección del cerebro del ratón en regiones funcional y anatómicamente diferentes

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

El cerebro es el centro de mando del sistema nervioso de los mamíferos y un órgano con una enorme complejidad estructural. Protegido dentro del cráneo, el cerebro consiste en una cubierta externa de materia gris sobre los hemisferios conocida como corteza cerebral. Debajo de esta capa residen muchas otras estructuras especializadas que son esenciales para múltiples fenómenos importantes para la existencia. La adquisición de muestras de regiones específicas del cerebro macroscópico requiere pasos de disección rápidos y precisos. Se entiende que a nivel microscópico, existen muchas subregiones y probablemente cruzan los límites regionales arbitrarios que imponemos con el propósito de esta disección.
Los modelos de ratón se utilizan rutinariamente para estudiar las funciones y enfermedades del cerebro humano. Los cambios en los patrones de expresión génica pueden limitarse a áreas específicas del cerebro dirigidas a un fenotipo particular dependiendo del estado de enfermedad. Por lo tanto, es de gran importancia estudiar la regulación de la transcripción con respecto a su organización estructural bien definida. Una comprensión completa del cerebro requiere estudiar distintas regiones cerebrales, definir conexiones e identificar diferencias clave en las actividades de cada una de estas regiones cerebrales. Una comprensión más completa de cada una de estas regiones distintas puede allanar el camino para tratamientos nuevos y mejorados en el campo de la neurociencia. Aquí, discutimos una metodología paso a paso para diseccionar el cerebro del ratón en dieciséis regiones distintas. En este procedimiento, nos hemos centrado en la extirpación y disección del cerebro C57Bl / 6J (6-8 semanas de edad) en ratones machos en múltiples regiones utilizando puntos de referencia neuroanatómicos para identificar y muestrear regiones cerebrales discretas funcionalmente relevantes y relevantes para el comportamiento. Este trabajo ayudará a sentar una base sólida en el campo de la neurociencia, lo que llevará a enfoques más centrados en la comprensión más profunda de la función cerebral.

Nuestra comprensión de la compleja estructura y función del cerebro está evolucionando y mejorando rápidamente. El cerebro contiene múltiples regiones distintas y la construcción de un mapa molecular puede ayudarnos a comprender mejor cómo funciona el cerebro. En este documento de método, hemos discutido la disección del cerebro del ratón en múltiples regiones distintas (Tabla 1). En este protocolo, las estructuras se identifican en función de los puntos de referencia críticos y se logra manteniendo el t...

Presentamos un protocolo práctico, paso a paso, rápido para la extracción del cerebro del ratón y la disección de regiones discretas del tejido cerebral fresco. La obtención de regiones cerebrales para el análisis molecular se ha convertido en una rutina en muchos laboratorios de neurociencia. Estas regiones cerebrales se congelan inmediatamente para obtener datos transcriptómicos de alta calidad para el análisis a nivel de sistema.

Microdisección del cerebro del ratón en regiones funcional y anatómicamente diferentes

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

El estudio de distintas regiones cerebrales es un trampolín hacia la comprensión de la complejidad molecular y estructural del cerebro. Este protocolo describe una disección sistemática del cerebro del ratón para aislar distintas regiones cerebrales. En la perspectiva de la anatomía del cerebro, es un enfoque de arriba hacia abajo que se puede reproducir fácilmente.Las ventajas de este protocolo son dobles. En primer lugar, este enfoque brinda la oportunidad de comprender los fundamentos moleculares de regiones cerebrales pequeñas pero críticas. En segundo lugar, todo este proceso de disección es lo suficientemente corto como para garantizar la preservación de la integridad molecular, un requisito previo crítico de los ensayos moleculares y de espalda.Este procedimiento implica práctica y manejo delicado. El momento es muy crucial aquí para mantener los hitos estructurales, y se puede lograr con la capacitación y la práctica adecuadas. Demostrando el procedimiento de extracción de cerebro de ratón estará Seid Muhie, un químico investigador y bioinformático de nuestro laboratorio.Demostrando aún más el procedimiento de disección cerebral de ratón estará James Meyerhoff, un neurocientífico de nuestro laboratorio. Para empezar, limpia y retira la piel para un buen agarre. Sujete el maxilar de la cabeza decapitada con un hemostático y use una gasa para reflejar el cuero cabelludo rostralmente.Inserte las finas tijeras curvas en el foramen magnum para separar las meninges adheridas. Luego inserte las tijeras en la abertura de la base del cráneo donde pasa la médula espinal con la hoja apuntando verticalmente, pero paralela y presionando contra la superficie interior del hueso de la placa basal, girando la hoja 45 grados hacia el lado izquierdo y luego hacia el lado derecho. Extirpar el hueso occipital en el hueso intraparietal para exponer el cerebelo.Avance las tijeras rostralmente a lo largo de la sutura sagital media hasta el bregma, y córtela levantándola hacia arriba para evitar la laceración de las cortezas cerebrales. A medida que se levantan los huesos parietales, identifique y corte los accesorios meníngeos restantes. Realiza dos cortes paralelos en el plano sagital y retira los fragmentos del hueso frontal, evitando lacerar la superficie cerebral.Mientras corta las uniones meníngeas y los nervios craneales, invierta el cráneo para permitir que la gravedad ayude a extraer el cerebro en una pequeña taza precargada con solución salina. Mantenga la bulla auditiva intacta para que la anatomía pituitaria sea identificable. Haga un corte parasaggital extremadamente pequeño en ambos lados en la cresta de la tienda membrana que sostiene la hipófisis en su lugar, y levante el lóbulo posterior de la hipófisis con pinzas ultra finas.Haga un corte sagital entre los márgenes laterales del lóbulo anterior de la hipófisis en el nervio trigémino más cercano, luego levante el lóbulo anterior de la hipófisis. Dirija la fuente de luz blanca sobre el tejido. Coloque el cerebro en un bloque de acero inoxidable preenfriado y mantenga el bloque frío rodeándolo con hielo en una solución salina helada.Humedezca periódicamente el tejido con solución salina helada para preservar las estructuras. Coloque el cerebro de tal manera que las cortezas cerebrales estén mirando hacia arriba. Con pequeños fórceps curvos, retire el cerebelo.Usando el enfoque dorsal, deslice las cuchillas cerradas de un pequeño fórceps curvo debajo del cuerpo calloso y extiéndalo suavemente para retraer el neocórtex bilateralmente para preservar los puntos de referencia de la línea media críticamente sobresalientes. Eventualmente, con el lado hacia arriba, estructuras como el quiasma óptico, el hipotálamo, los bulbos olfativos, el bulbo raquídeo, la culata pituitaria y el puente pontino serían visibles. Intenta separar los hemisferios.Voltee el sitio ventral del cerebro hacia arriba y haga un corte sagital medio comenzando desde el dorso entre los bulbos olfatorios en los hemisferios cerebrales. Retire la médula y luego separe suavemente los dos hemisferios. A continuación, haga un corte coronal en el margen interior de los estanques para obtener el cerebro posterior y separe la médula en el margen posterior de los estanques.Voltea el tejido cerebral para una separación cuidadosa de los dos hemisferios cerebrales. Retire la bombilla olfativa en este paso. Hacer un corte coronal un milímetro anterior al genu del cuerpo calloso, y retirar los bulbos olfatorios accesorios, seguido de separar la corteza prefrontal medial y lateral.Corte parcial horizontal o coronal a través de la porción transversal de la comisura anterior desde la línea media debajo del asta anterior del ventrículo lateral para liberar el núcleo septal dorsalmente y el cuerpo estriado ventral. Retire la pequeña cantidad de la corteza de la superficie lateral para eliminar la sucumbición del núcleo y el tubérculo olfativo. Separe la porción rostral del cuerpo estriado de la corteza suprayacente a través de un corte de bisturí curvo justo fuera de la cápsula externa.Identifique los núcleos septales o tabique y aíslelos de esta sección. Haga un corte curvo para separar el hipotálamo en este paso. Esto se hará utilizando un corte coronal parcial posterior a los cuerpos mamilares que se extiende solo lateralmente hasta el surco hipotalámico.Luego libere la sección transversal del hipotálamo con un corte parasagital a lo largo del surco hipotalámico. Evert el ventrículo lateral para revelar conexiones intralímbicas adicionales en los componentes restantes del sistema límbico. En la parte interior de la corteza interna, se observa una estructura en forma de abanico después de abrir el ventrículo.Use la estructura en forma de abanico en la corteza entorrinal para definir los márgenes con el propósito de la disección, luego identifique y elimine la amígdala, la corteza entorrinal, la corteza cingulada posterior y el hipocampo. Confirmar la identificación del tálamo mediante la visualización de la estría medular en su superficie dorsal que se extiende en el plano cortical rostral de la línea media. Separe el tálamo completamente del cerebro medio mediante un corte coronal.Este protocolo se puede utilizar para la extracción inmediata del cerebro del cráneo, seguido de la disección. Los tejidos disecados pueden ser preservados y procesados posteriormente dependiendo de los requerimientos del estudio. El ARN extraído de múltiples tejidos diseccionados se puede ensayar para la expresión génica.Los resultados representativos se obtuvieron utilizando cerebros cosechados que se almacenaron a menos 80 grados centígrados durante varios meses antes de la extracción de ARN. Se recopilaron distintas regiones cerebrales junto con datos de peso bajo el modelo de estrés social expuesto al agresor del estudio. Las concentraciones de ARN y las lecturas espectrofotométricas se muestran aquí.Al seguir este protocolo, asegúrese de que los tejidos estén fríos en todo momento manteniendo el cerebro en un bloque de acero helado y rociando periódicamente el tejido con solución salina helada. Una vez que los tejidos se recolectan y se congelan inmediatamente, se pueden usar para ensayos como transcriptómica, metabolómica y proteómica en un momento posterior.

microdissection-mouse-brain-into-functionally-anatomically-different

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

El perfilado de la expresión de ARN en regiones cerebrales discretas del ratón requiere una estrategia precisa y reproducible de recolección de tejido. Aquí se describe un protocolo que utiliza tanto la sección coronal del cerebro como la microdisección asistida por punzón tisular. El rendimiento y la calidad del ARN total obtenido a partir de las muestras resultantes confirman la utilidad del método descrito.

Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

Este video muestra la reticulación de proteínas de superficie neuronal usando suberato de bis-sulfosuccinimidil o BS3. El cerebro de ratón aislado y enfriado se secciona coronalmente. La región deseada se extrae de las secciones, se pica y se trata con BS3. BS3 se entrecruza con proteínas de superficie como los receptores GABA, dejando inalteradas las proteínas internas. La reacción se apaga con glicina antes de procesar las muestras para su posterior análisis.

Reticulación de proteínas de superficie neuronal en el cerebro de ratón mediante un ensayo de reticulación química

Este video muestra un protocolo detallado paso a paso para preparar secciones de tejido cerebral de ratón congelado para análisis posteriores.

Procesamiento del cerebro de un ratón para su análisis posterior

En este artículo se describe el procedimiento experimental completo para reconstruir, con alta resolución, la anatomía del cerebro multa de cerebros de ratón marcados con fluorescencia. El protocolo descrito incluye la preparación de muestras y el desmonte, la muestra de montaje para imágenes, datos post-procesamiento y visualización multi-escala.

Micron escala Resolución óptica tomografía de cerebro de ratón enteras con Hoja confocal Microscopía de Luz

Se describe un protocolo para generar un sistema de cocultivo compuesto por neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), neuronas corticales primarias y astrocitos. Este sistema de cocultivo permite detectar la formación de contactos sinápticos y circuitos entre nuevas neuronas derivadas de iPSC y neuronas corticales preexistentes que expresan canalrodopsina-2.

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

El uso de múltiples ángulos para cortar el cerebro pup ratón, mejoramos sobre una rebanada cerebral agudo descrito previamente-que captura las conexiones entre la mayoría de las principales estructuras del mesencéfalo y el prosencéfalo auditivas.

Modificación de un Colliculo-tálamo-cortical del ratón Cerebro Loncha, incorporación de la impresión 3-D de la Cámara Componentes e Imagen óptica multi-escala

Este procedimiento describe la recolección de regiones cerebrales congeladas discretas para obtener proteínas y ARN de alta calidad utilizando herramientas baratas y comúnmente disponibles.

Colección de regiones cerebrales de roedores congelados para análisis posteriores

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales de un SNC de ratón. Este método permite la segregación de microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos para estudiar los fenotipos de cada uno en una variedad de sistemas de cultivo.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

Se ha implicado que diferentes regiones cerebelosas desempeñan un papel en distintos resultados conductuales, sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes siguen siendo desconocidos. Este trabajo describe un método para diseccionar de manera reproducible y rápida la corteza cerebelosa de los hemisferios, las regiones anterior y posterior del vermis y los núcleos cerebelosos profundos con el fin de sondear las diferencias moleculares mediante el aislamiento del ARN y la prueba de las...

Disección regional cerebelosa para análisis molecular

La disección crioseccional permite la preparación fresca y congelada del nicho neurogénico más grande en el cerebro murino para un análisis profundo del proteoma cuantitativo. El método es preciso, eficiente y causa una perturbación tisular mínima. Por lo tanto, es ideal para estudiar el microambiente molecular de este nicho, así como otros órganos, regiones y especies.

Disección crioseccional de la zona subependimaria adulta para un análisis cuantitativo preciso y profundo del proteoma

El plexo coroideo (PC), un tejido poco estudiado en neurociencia, desempeña un papel clave en la salud y la enfermedad del sistema nervioso central. Este protocolo describe una técnica de microdisección para aislar el PC y el uso de microscopía electrónica de barrido para obtener una visión global de su estructura celular.

Microdisección y microscopía electrónica de barrido de montaje completo Visualización del plexo coroideo del ratón

Aprende a realizar microdisección cerebral en ratón para aislar regiones anatómicas y funcionales específicas. Este protocolo sistemático preserva la integridad molecular del tejido para análisis transcriptómicos de alta calidad en neurociencia.

Microdisección del cerebro del ratón en regiones funcional y anatómicamente diferentes

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