Microdisección del cerebro del ratón en regiones funcional y anatómicamente diferentes

El estudio de distintas regiones cerebrales es un trampolín hacia la comprensión de la complejidad molecular y estructural del cerebro. Este protocolo describe una disección sistemática del cerebro del ratón para aislar distintas regiones cerebrales. En la perspectiva de la anatomía del cerebro, es un enfoque de arriba hacia abajo que se puede reproducir fácilmente.

Las ventajas de este protocolo son dobles. En primer lugar, este enfoque brinda la oportunidad de comprender los fundamentos moleculares de regiones cerebrales pequeñas pero críticas. En segundo lugar, todo este proceso de disección es lo suficientemente corto como para garantizar la preservación de la integridad molecular, un requisito previo crítico de los ensayos moleculares y de espalda.

Este procedimiento implica práctica y manejo delicado. El momento es muy crucial aquí para mantener los hitos estructurales, y se puede lograr con la capacitación y la práctica adecuadas. Demostrando el procedimiento de extracción de cerebro de ratón estará Seid Muhie, un químico investigador y bioinformático de nuestro laboratorio.

Demostrando aún más el procedimiento de disección cerebral de ratón estará James Meyerhoff, un neurocientífico de nuestro laboratorio. Para empezar, limpia y retira la piel para un buen agarre. Sujete el maxilar de la cabeza decapitada con un hemostático y use una gasa para reflejar el cuero cabelludo rostralmente.

Inserte las finas tijeras curvas en el foramen magnum para separar las meninges adheridas. Luego inserte las tijeras en la abertura de la base del cráneo donde pasa la médula espinal con la hoja apuntando verticalmente, pero paralela y presionando contra la superficie interior del hueso de la placa basal, girando la hoja 45 grados hacia el lado izquierdo y luego hacia el lado derecho. Extirpar el hueso occipital en el hueso intraparietal para exponer el cerebelo.

Avance las tijeras rostralmente a lo largo de la sutura sagital media hasta el bregma, y córtela levantándola hacia arriba para evitar la laceración de las cortezas cerebrales. A medida que se levantan los huesos parietales, identifique y corte los accesorios meníngeos restantes. Realiza dos cortes paralelos en el plano sagital y retira los fragmentos del hueso frontal, evitando lacerar la superficie cerebral.

Mientras corta las uniones meníngeas y los nervios craneales, invierta el cráneo para permitir que la gravedad ayude a extraer el cerebro en una pequeña taza precargada con solución salina. Mantenga la bulla auditiva intacta para que la anatomía pituitaria sea identificable. Haga un corte parasaggital extremadamente pequeño en ambos lados en la cresta de la tienda membrana que sostiene la hipófisis en su lugar, y levante el lóbulo posterior de la hipófisis con pinzas ultra finas.

Haga un corte sagital entre los márgenes laterales del lóbulo anterior de la hipófisis en el nervio trigémino más cercano, luego levante el lóbulo anterior de la hipófisis. Dirija la fuente de luz blanca sobre el tejido. Coloque el cerebro en un bloque de acero inoxidable preenfriado y mantenga el bloque frío rodeándolo con hielo en una solución salina helada.

Humedezca periódicamente el tejido con solución salina helada para preservar las estructuras. Coloque el cerebro de tal manera que las cortezas cerebrales estén mirando hacia arriba. Con pequeños fórceps curvos, retire el cerebelo.

Usando el enfoque dorsal, deslice las cuchillas cerradas de un pequeño fórceps curvo debajo del cuerpo calloso y extiéndalo suavemente para retraer el neocórtex bilateralmente para preservar los puntos de referencia de la línea media críticamente sobresalientes. Eventualmente, con el lado hacia arriba, estructuras como el quiasma óptico, el hipotálamo, los bulbos olfativos, el bulbo raquídeo, la culata pituitaria y el puente pontino serían visibles. Intenta separar los hemisferios.

Voltee el sitio ventral del cerebro hacia arriba y haga un corte sagital medio comenzando desde el dorso entre los bulbos olfatorios en los hemisferios cerebrales. Retire la médula y luego separe suavemente los dos hemisferios. A continuación, haga un corte coronal en el margen interior de los estanques para obtener el cerebro posterior y separe la médula en el margen posterior de los estanques.

Voltea el tejido cerebral para una separación cuidadosa de los dos hemisferios cerebrales. Retire la bombilla olfativa en este paso. Hacer un corte coronal un milímetro anterior al genu del cuerpo calloso, y retirar los bulbos olfatorios accesorios, seguido de separar la corteza prefrontal medial y lateral.

Corte parcial horizontal o coronal a través de la porción transversal de la comisura anterior desde la línea media debajo del asta anterior del ventrículo lateral para liberar el núcleo septal dorsalmente y el cuerpo estriado ventral. Retire la pequeña cantidad de la corteza de la superficie lateral para eliminar la sucumbición del núcleo y el tubérculo olfativo. Separe la porción rostral del cuerpo estriado de la corteza suprayacente a través de un corte de bisturí curvo justo fuera de la cápsula externa.

Identifique los núcleos septales o tabique y aíslelos de esta sección. Haga un corte curvo para separar el hipotálamo en este paso. Esto se hará utilizando un corte coronal parcial posterior a los cuerpos mamilares que se extiende solo lateralmente hasta el surco hipotalámico.

Luego libere la sección transversal del hipotálamo con un corte parasagital a lo largo del surco hipotalámico. Evert el ventrículo lateral para revelar conexiones intralímbicas adicionales en los componentes restantes del sistema límbico. En la parte interior de la corteza interna, se observa una estructura en forma de abanico después de abrir el ventrículo.

Use la estructura en forma de abanico en la corteza entorrinal para definir los márgenes con el propósito de la disección, luego identifique y elimine la amígdala, la corteza entorrinal, la corteza cingulada posterior y el hipocampo. Confirmar la identificación del tálamo mediante la visualización de la estría medular en su superficie dorsal que se extiende en el plano cortical rostral de la línea media. Separe el tálamo completamente del cerebro medio mediante un corte coronal.

Este protocolo se puede utilizar para la extracción inmediata del cerebro del cráneo, seguido de la disección. Los tejidos disecados pueden ser preservados y procesados posteriormente dependiendo de los requerimientos del estudio. El ARN extraído de múltiples tejidos diseccionados se puede ensayar para la expresión génica.

Los resultados representativos se obtuvieron utilizando cerebros cosechados que se almacenaron a menos 80 grados centígrados durante varios meses antes de la extracción de ARN. Se recopilaron distintas regiones cerebrales junto con datos de peso bajo el modelo de estrés social expuesto al agresor del estudio. Las concentraciones de ARN y las lecturas espectrofotométricas se muestran aquí.

Al seguir este protocolo, asegúrese de que los tejidos estén fríos en todo momento manteniendo el cerebro en un bloque de acero helado y rociando periódicamente el tejido con solución salina helada. Una vez que los tejidos se recolectan y se congelan inmediatamente, se pueden usar para ensayos como transcriptómica, metabolómica y proteómica en un momento posterior.