Síntesis De Pirazol Dependiente De pH, Imidazol, Y Fluoróforos De Isoindolona Dipirorina Usando Un Enfoque De Condensación De Claisen-Schmidt

La reacción de condensación de Claisen-Schmidt es una reacción antigua, siendo reportada por primera vez por Claisen y Schmidt simultáneamente en 1881. Consiste en la adición de enolato asistido por la base de una cetona o aldehído, que se muestra en azul, en un aldehído aromático, que se muestra en rojo. Inicialmente, la adición del enolato resulta en la formación de un alcohol, como se muestra en los corchetes.

Sin embargo, una deshidratación posterior produce en última instancia un enone. Dado que el aro-aldehído no contiene un hidrógeno alfa, no puede formar un enolato. Como resultado, a menudo las bases débiles, como el hidróxido, se pueden utilizar para generar el enolato.

La condensación de Claisen-Schmidt se ha utilizado para generar una serie de compuestos a lo largo de los años. Sin embargo, se ha utilizado ampliamente para unir los sistemas de anillos aromáticos de los chalcones y flavanones, que se muestran en rojo y azul. La porción azul indica que derivada del enolato y el rojo es de la porción aromática.

Los chalcones y las flavanonas son núcleo esencial para una gama de moléculas biológicamente activas que poseen una gama de actividades, tales como antibacteriano, antifúngico, antiinflamatorio, y antitumores, dependiendo del patrón de la substitución. Otra amplia clase de moléculas generadas a partir de la reacción de condensación de Claisen-Schmidt son los compuestos puenteados con metina de los que damos ejemplos en este estudio. Nuestro laboratorio está interesado en los componentes fluorescentes del pigmento bilirrubina, que es naturalmente produce un producto de degradación de heme.

La síntesis de bilirrubina y muchos de sus componentes gira en torno a la condensación tipo Claisen-Schmidt, que puede visualizarse en las estructuras mostradas por el enolato azul y los componentes de aldehído aromático rojo. Típicamente, los componentes directos de la bilirrubina, tales como dipyrrinones, son no fluorescentes. Sin embargo, si uno une los dos grupos de nitrógeno con un grupo metileno o carbonilo, las moléculas resultantes se vuelven altamente fluorescentes, como en el caso de los xantooglows.

Normalmente, las dipiromonas absorben la luz UV o azul, lo que resulta en un proceso de isomerización de Z a E. Al igual que las dipiromonas no abreviadas, la N en las dipiromonas puenteadas también absorben la luz UV o azul, pero se diferencian en que se relajan en un estado excitado a través de la fluorescencia. Recientemente hemos descubierto una serie de derivados de la dipironrina que en realidad fluorescen sin un puente covalente que une los dos grupos de nitrógeno.

En cambio, un enlace de hidrógeno parece estar disuasondo el proceso de isomerización de Z a E, lo que lleva a un modo de fluorescencia. Además, se hizo un descubrimiento imprevisto de que estas moléculas pueden deprotonarse en medios básicos, lo que lleva a espectros de emisión de absorción al rojo corridos al rojo en los estados deprotonados. En consecuencia, estas moléculas pueden tener valor como sondas ratiométricas de pH.

Se utilizan los derivados fluorescentes de dipirorinana, generando una ligera adaptación en la reacción de condensación tradicional de Claisen-Schmidt. Este protocolo se desvía de la reacción tradicional de condensación de Claisen-Schmidt en que un enolato vinilogoo derivado de una pirrolinona o isoindolona es la fuente nucleófila. El enolato vinilogoo se añade a un pirazol o aldehído imidazol para generar una pequeña biblioteca de análogos de dipirorina.

El procedimiento que se utiliza para crear esta biblioteca se ilustra en el vídeo. Sin embargo, se pueden utilizar pasos análogos para llevar a cabo la reacción tradicional de Claisen-Schmidt. Si bien la reacción de Claisen-Schmidt ha sido y sigue siendo una reacción sintética ampliamente utilizada, este es el primer recuento de video de este método, del que somos conscientes.

Para prepararse para la síntesis de un análogo fluorescente de la dipironrina vía la condensación del aldol, pese los equivalentes iguales del nucleófilo y del electrófilo elegidos. A continuación, añádalos a un matraz inferior redondo de 25 mililitros que contenga una barra de agitación magnética. Mida cinco mililitros de etanol usando un cilindro graduado.

A continuación, añadir el etanol al matraz inferior redondo. Mida 2,4 mililitros de hidróxido de potasio molar previamente preparado de 10 molares utilizando un cilindro graduado. A continuación, añadir el hidróxido de potasio al matraz.

Para fijar el matraz hasta el reflujo, aplique una cantidad suficiente de grasa de vacío a la junta de vidrio esmerilado de un condensador de reacción para evitar la incautación de las juntas de vidrio esmerilado. Conecte el condensador a un suministro de agua fría y, a continuación, conecte la junta engrasada del condensador al matraz inferior redondo. Luego coloque el matraz en un baño de aceite o en un bloque de calefacción de aluminio que pueda mantener una temperatura constante a través de un par térmico con un agitador de placa caliente.

Calor a temperatura de reflujo mientras permite que la reacción se revuelva. La mezcla de reacción debe controlarse mediante cromatografía de capa delgada a las una, tres, seis, 12 y 24 horas para medir la velocidad de reacción y comprobar el consumo completo de los materiales de partida. Deje que el matraz se enfríe a temperatura ambiente, luego evapore el disolvente de etanol usando un evaporador rotatorio.

Coloque el matraz en un baño de hielo y deje que el matraz se equilibre a la temperatura del baño de hielo en el transcurso de cinco minutos. Neutralice cualquier hidróxido de potasio restante en el matraz añadiendo 1,7 mililitros de ácido acético en una sola porción. Si la formación de cristales se produjo después de la neutralización, siga el procedimiento de purificación de filtración al vacío.

Si no se observó ninguna formación cristalina, siga el procedimiento de purificación de cromatografía de columna de flash. Coloque un trozo redondo de papel de filtro en la parte superior del embudo y moje ligeramente el papel con agua desionizada para adherirlo al embudo. Para prepararse para la filtración al vacío de cristales, coloque un embudo Hirsch o Buchner en un matraz de brazo lateral utilizando un adaptador de goma ajustado.

Para evitar la obstrucción del papel de filtro que puede impedir la filtración, utilizamos un embudo hirsch o buchner más grande de lo que es típico para procesos de filtración a escala similar. Vierta el contenido del matraz inferior redondo sobre el papel de filtro y deje que la mezcla se filtre. Enjuague los cristales durante el proceso de filtración con 10 mililitros de agua desionizada helada.

Después de la filtración, transfiera los cristales a un matraz de fondo redondo de 25 mililitros. Aplique una capa ligera de grasa de vacío a un adaptador de vidrio de línea de vacío de alta potencia y, a continuación, conecte el adaptador al matraz inferior redondo. Asegure la junta de vidrio con un clip Keck.

Para preparar el vacío de alta potencia para secar los cristales de cualquier disolvente residual, enfríe adecuadamente la trampa de vacío de vidrio con una mezcla de hielo seco y acetona. Conecte una línea de vacío de alta potencia al adaptador de vidrio conectado al matraz inferior redondo. Encienda la bomba de vacío de alta potencia y deje que los cristales se sequen durante al menos una hora.

Una vez que los cristales se hayan secado suficientemente al vacío, apague la bomba de vacío y suelte el sello de vacío para eliminar el matraz inferior redondo. Pesar los cristales secos para informar el rendimiento porcentual de reacción. Para prepararse para la purificación a través de cromatografía de columna flash, agregue la mezcla tratada con ácido que no formaron cristales del procedimiento de síntesis a un embudo separador.

Mida 10 mililitros de diclorometano usando un cilindro graduado y utilícela para diluir la mezcla tratada con ácido en el embudo separador. Cierre y agite suavemente el embudo separador mientras se asegura de ventilar con frecuencia. Después de esto, dos capas separadas deben ser visibles en el embudo separador.

Extraiga la capa acuosa utilizando cinco mililitros adicionales de diclorometano. Complete este paso dos veces más. Combina todas las fracciones orgánicas y añade una cantidad suficiente de sulfato de sodio anhidro para secar las fracciones orgánicas.

Transfiera las fracciones orgánicas secas a un matraz de fondo redondo y retire el diclorometano utilizando un evaporador rotatorio. Diluir el residuo restante con cinco mililitros adicionales de diclorometano. Prepare una columna usando aproximadamente 75 gramos de gel de sílice y utilícelo para realizar cromatografía de columna flash en la muestra, usando 10% de metanol en diclorometano como el eluente.

Evapore el eluente de las fracciones recogidas utilizando un evaporador rotatorio. Prepare la bomba de vacío de alta potencia y la trampa de solvente de vidrio, como se describió anteriormente en el procedimiento de purificación de filtración al vacío, y permita que el sólido recolectado se seque a alto vacío durante al menos una hora. Una vez que los cristales se han secado lo suficiente al vacío, pesar los cristales secos para informar el rendimiento porcentual de reacción.

Para confirmar la estructura de cada uno de los análogos del dipyrrinone en la biblioteca, varios métodos espectroscópicos fueron utilizados en la combinación, incluyendo espectroscopia de resonancia magnética nuclear, espectroscopia infrarroja, y espectrometría de masas de alta resolución. UV-Vis y la espectroscopia fluorescente fueron utilizados en la caracterización fotofísica de los análogos fluorescentes del dipyrrinone. Usando la reacción de condensación de Claisen-Schmidt, pudimos sintetizar una pequeña biblioteca de 10 compuestos, incluyendo el de un compuesto de control que no puede participar en enlaces de hidrógeno intermoleculares.

Los rendimientos de los análogos de dipirorina variaron de aproximadamente el 40% a casi cuantitativos y se enumeran debajo de cada molécula. Los compuestos con los mayores rendimientos cuánticos, tanto en las formas protonadas como deprotonadas, se derivaron del 2-formylimidazol y se muestran en cajas rosadas. El compuesto de control, que no fluoresce, está en una caja cian.

Los derivados de la dipirorinana bajo una lámpara estándar de longitud de onda larga de 365 nanómetros dan la fluorescencia observada. Uno puede observar visualmente la fluorescencia corrida al rojo que resulta de la deprotonación. A través del color de los viales, pasan de azul a cian en color.

Para obtener datos más cuantitativos sobre las propiedades fotofísicas y otras propiedades físicas de los derivados de la dipirorina, dirigimos a los espectadores a la tabla dos en la parte escrita del manuscrito. En general, la reacción de condensación de Claisen-Schmidt proporciona acceso a una gama de compuestos aromáticos bicíclicos ligados a la metina. Sin embargo, hay algunas limitaciones.

La reacción depende del uso de un nucleófilo enolizable y de un electrófilo no enolizable del aldehído, tal como un aro-aldehído, para experimentar la condensación acertada. Al no cumplir este requisito básico, los intentos de realizar esta reacción probablemente resultarán en la incapacidad de conectar los sistemas de anillos y/o la generación de productos secundarios competidores. Otra consideración es que se utilizan condiciones básicas para generar el nucleófilo enolado que puede crear incompatibilidades con grupos funcionales que son susceptibles a reacciones con hidróxido.

En tales casos, es posible sustituir el hidróxido con bases nitrogenadas o carbonato que se ha logrado con DBU, trietilamina, piperidina, base de Hunig y carbonato de sodio. Simplemente elegimos usar hidróxido de potasio debido a su disponibilidad y gasto relativo. A pesar de estas limitaciones, el método descrito en el protocolo puede proporcionar un medio de acoplamiento de anillos aromáticos para numerosos sistemas a través de una reacción de un solo paso procedimentalmente simple y rentable.

En el caso de los análogos de dipirorinano que hemos sintetizado, la condensación de Claisen-Schmidt ha permitido una de las rutas más accesibles a los fluoróforos dependientes del pH descritos hasta la fecha. Sin embargo, los diseños futuros de análogos de dipironrina se desarrollarán utilizando el procedimiento descrito para generar compuestos fluorescentes con una mayor capacidad de enlace de hidrógeno intermolecular y valores de pKa más bajos. Anticipe que estas sondas mejoradas dependientes del pH poseerán mayores rendimientos cuánticos al tiempo que permitirán la visualización de las fluctuaciones de pH para una gama más amplia de eventos intracelulares.