Name: Ensayo funcionalizado de síntesis y citotoxicidad del heterociclo espirocíclico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Aprenda a sintetizar heterociclos espirocíclicos mediante síntesis en fase sólida y evalúe su citotoxicidad en células COS7 utilizando el ensayo MTT. Este método aporta información valiosa para la investigación oncológica y el desarrollo de fármacos.

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Este trabajo fue financiado por una subvención del Consejo de Investigación de la Facultad a K.S.H. (Oficina de Investigación y Subvenciones, Azusa Pacific University-USA). A.N.G. y J.F.M. son beneficiarios de la beca Scholarly Undergraduate Research Experience (SURE). S.K.M. y B.M.R. son beneficiarios de las becas de investigación STEM (Center for Research in Science, Azusa Pacific University-USA). Agradecemos al Dr. Matthew Berezuk y al Dr. Philip Cox por su orientación sobre los bioensayos.

NOTA: Varios productos químicos y reactivos biológicos utilizados en este protocolo son tóxicos y cancerígenos. Consulte las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de su uso. Use equipos de protección personal apropiados (gafas de seguridad aprobadas por la Administración de Seguridad y Salud Ocupacional, guantes adecuados, batas de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados) antes de comenzar el experimento. Además, adoptar prácticas de seguridad adecuadas al realizar síntesis y manipular productos químicos tóxicos y reactivos (campana extractora).
1. Síntesis en fase sólida de heterociclos espirocíclicos 6 y 7
NOTA: La síntesis se basó en trabajos publicados previamente11,12. El protocolo actualizado revela que la abertura del anillo catalizada por fluoruro de tetrabutilamonio del heterociclo tricíclico no era necesaria y, por lo tanto, su eliminación acorta el procedimiento sintético.
<ol><li>Realizar la adición de furfurilamina de Michael al enlazador REM (duración: 25 min de configuración + 24 h de tiempo de reacción).<ol><li>Agregue 1 g (1 equivalente [equiv.]) de resina REM, 20 ml (20 equiv.) de dimetilformamida (DMF) y 2.4 ml de furfurilamina a un recipiente de reacción en fase sólida de 25 ml. Agitar el recipiente de reacción a temperatura ambiente durante 24 h después del inicio de la reacción. NOTA: Asegúrese de mezclar bien para que la resina no se asiente en el fondo del recipiente.</li>
		<li>Lave la resina con DMF 1x después de que se complete la reacción. Luego, lave 4x, alternando entre diclorometano (DCM) y metanol. Seque bien la resina en el recipiente de reacción después de los lavados.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar adición de Michael en tándem / cicloadición 1,3-dipolar (duración: configuración de 25 min + tiempo de reacción de 48 h).<ol><li>A la resina seca, agregue 1.48 mL (5 equiv.) de trietilamina (TEA), 0.637 g (2 equiv.) de nitro-olefina y 10 mL de tolueno seco al recipiente de reacción.</li>
		<li>Luego, agregue 1.085 ml (4 equiv.) de cloruro de trimetilsilil (TMSCl) al recipiente de reacción en una campana extractora bien ventilada. NOTA: Como esta reacción produce gas HCl, no tapar el recipiente de reacción hasta que el gas se haya liberado debajo de una campana extractora.</li>
		<li>Tapar firmemente el recipiente de reacción y agitar a temperatura ambiente durante 48 h. NOTA: Asegúrese de mezclar completamente la resina con los reactivos.</li>
		<li>Use 5 ml de metanol para apagar la reacción.</li>
		<li>Drene el recipiente para eliminar la solución y luego lave 4x, alternando entre DCM y metanol. Seque bien la resina en el recipiente de reacción después de los lavados.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar N-alquilación del heterociclo unido a resina para formar la amina cuaternaria (duración: 10 min de configuración + 24 h de tiempo de reacción).<ol><li>A la resina seca en el recipiente de reacción, agregue 5 mL de DMF y 10 equivalentes de haluro de alquilo, y agite a temperatura ambiente durante 24 h. NOTA: Asegúrese de mezclar bien los reactivos con la resina.</li>
		<li>Lave la resina con DMF 1x después de que se complete la reacción. Luego, use DCM y metanol alternativamente para lavar 4x. Seque la resina en el recipiente de reacción después de los lavados.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar β eliminación de la amina cuaternaria para la escisión del soporte del polímero (duración: configuración de 15 min + tiempo de reacción de 24 h).<ol><li>A la resina seca en el recipiente de reacción, agregue 3 ml de DCM y 1,49 ml (5 equivalentes) de TEA para separar el heterociclo del soporte del polímero.</li>
		<li>Agitar la mezcla de reacción durante 24 h para asegurar una mezcla completa de la resina con la solución. Lavar 4x, alternando entre DCM y metanol. Recoger la elución de todos los lavados y concentrar por evaporación rotatoria.</li>
		<li>Triturar con metanol para purificar la oxima espirocíclica. Seque bien la resina en el recipiente de reacción después de los lavados para su reutilización en futuros experimentos.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ensayo de citotoxicidad utilizando MTT 14
<ol><li>Prepare 20 ml de una solución MTT de 5 mg/ml utilizando solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS, NaCl al 0,9% en agua) como diluyente. Filtrar y conservar a -20 °C. Luego, prepare una dilución 1: 1 de la solución MTT del paso 2.1 en medio de cultivo celular libre de suero (DMEM).</li>
	<li>Preparar 1 ml de soluciones madre en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml de 100 mM, 10 mM, 1 mM, 100 μM, 10 μM, 1 μM, 0,1 μM y 0,01 μM de compuestos problema en dimetilsulfóxido (DMSO). Conservar a -20 °C. Preparar 200 μL por dosis de las soluciones de trabajo de los compuestos problema diluyendo las concentraciones madre 1:1000 en medio libre de suero en tubos de 1,5 ml.</li>
	<li>En la campana de cultivo de tejidos, sembrar células COS-7 (células de riñón de mono verde africano, riñón de Cercopithecus aethiops ) en medio completo [DMEM con 10% de suero bovino fetal (FBS)] en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo de tejidos de fondo plano a una concentración de 4 × 103 células/200 μL por pocillo utilizando un pipetor multicanal. Se eligieron células COS-7 porque (1) son células de uso común para ensayos de citotoxicidad y (2) ya estaban disponibles en la institución.</li>
	<li>Incubar células COS-7 durante 24 h a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% deCO2.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante de los pocillos con una pipeta de vidrio Pasteur conectada a una bomba de vacío. Dosificar las células por triplicado con los compuestos problema utilizando las soluciones de trabajo preparadas en el paso 2.2 (véase el cuadro 1). Incubar las células como se describe en el paso 2.4.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante de los pozos. Agregue 200 μL de solución MTT a cada pocillo. Incubar a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% deCO2 durante 4 h.</li>
	<li>Aspirar suavemente el sobrenadante de los pocillos sin alterar los cristales de formazan púrpura. Añadir 200 μL de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales de formazán púrpura. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
	<li>Mida la absorbancia a 590 nm14 o 600 nm para cada pocillo utilizando un lector de placas de 96 pocillos. Utilice pocillos sin celdas como fondo y promedie el valor de absorbancia. Reste el valor de fondo de absorbancia promedio del valor de absorbancia de cada pocillo tratado. Normalice los datos como un porcentaje del valor promedio de dosis cero (promedio de los tres valores de dosis cero). Trazar datos en el eje y: lineal (% de viabilidad relativa de la celda); Eje X: log (concentración). Trazar cada serie como una curva individual (por ejemplo, los datos triplicados deben tener 3 curvas)</li>
</ol>

<ol><li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function%3A+a+novel+approach+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+%28MDM2+inhibitors%29+in+clinical+trials+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li>
<li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li>
<li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li>
<li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li>
<li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li>
<li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MDM2-p53+pathway+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li>
<li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li>
<li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li>
<li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li>
<li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li>
<li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+%5B4.4%5Dspirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).</li>
<li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Combinatorial+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li>
<li>MTT assay protocol. , Modified procedure from 
 .
 (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La síntesis de los compuestos espirocíclicos se basó en investigaciones previas realizadas por este laboratorio, pero con algunas modificaciones (Figura 1)11,12. El progreso de cada paso de reacción fue monitoreado por espectroscopia IR. La adición de Michael del enlazador REM 1 con furfurilamina proporcionó 2 unido al polímero (IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1).<s...

Se sabe que la inhibición de moléculas pequeñas de la interacción del homólogo de doble minuto 2 del ratón ubiquitina-ligasa E3 (MDM2) con p53 restaura la inducción mediada por p53 de la apoptosis de células tumorales 1,2,3. MDM2 es un regulador negativo de la vía p53 y a menudo se sobreexpresa en las células cancerosas 4,5,6,7,8,9. Estudios cristalográficos y bioquímicos recientes han revelado que moléculas pequeñas que contienen un marco espirocíclico pueden inhibir eficazmente las interacciones MDM2-p5310. El marco espirocíclico (Figura 1, sombreado en azul) se considera un motivo privilegiado ya que la derivatización de este sistema de anillos ortogonales rígidos ha llevado al descubrimiento de nuevos fármacos terapéuticos. Acceder a esta interesante arquitectura plantea un desafío cuando se utilizan técnicas tradicionales de síntesis orgánica. Aunque se han investigado los efectos terapéuticos de las moléculas espirocíclicas en los sistemas biológicos, la síntesis de estas moléculas sigue siendo un proceso engorroso. Los productos secundarios no deseados, el uso de condiciones adversas y los metales de transición peligrosos a menudo son problemáticos.
El uso potencial del motivo espirocíclico en el desarrollo de fármacos condujo al desarrollo de un protocolo que utiliza la síntesis en fase sólida para generar una biblioteca de moléculas con el motivo además de otros grupos funcionales intercambiables11,12. La separación de productos y reactivos entre los pasos podría lograrse simplemente utilizando un enlazador REM conectado a un cordón de resina y un recipiente de filtro de fase sólida. Esto reduciría los escalones y potencialmente aumentaría los rendimientos. Este enfoque sintético podría producir una gran variedad de posibles candidatos a fármacos. Sin embargo, la efectividad de estas moléculas en un sistema biológico requeriría más investigación.
Para determinar la citotoxicidad de estos compuestos espirocíclicos, se empleó el ensayo MTT13,14. Este método mide la viabilidad celular y se puede utilizar para determinar indirectamente la citotoxicidad celular. Se agregaron diferentes concentraciones de los inhibidores a las células cultivadas en una placa de 96 pocillos, y la proporción de células vivas se midió mediante análisis colorimétrico del grado de reducción de MTT amarillo por deshidrogenasas mitocondriales al compuesto formazán púrpura (Figura 2). La actividad se informa con mayor frecuencia como un valor IC 50, la concentración en la que el crecimiento celular se inhibe en un50% en relación con un control no tratado. Este artículo describe el protocolo para el ensayo MTT y los resultados preliminares de estas nuevas moléculas espirocíclicas.

<table><tbody><tr><td><CÉLULAS > FUERTES</células ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COS-7 fuertes (ATCC CRL-1651)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>Células de riñón de mono verde africano</td></tr><tr><td><PRODUCTOS QUÍMICOS > FUERTES</</td>1-bromooctano fuerte > <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152951</td><td>Alilbromuro de haluro de alquilo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>337528</td><td>Haluro de alquilo</td></tr><tr><td>Bencilbromuro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B17905</td><td>Haluro de alquilo</td></tr><tr><td>Cisplatino</td><td>Cayman Chemical</td><td>13119</td><td>Control de citotoxicidad</td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td>disolvente</td></tr><tr><td>Dimetilformamida (DMF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td>disolvente</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>Disolvente</td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, con L-glutamina</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500 Medios de</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>FBS (Suero fetal bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>Furfurilamina</td><td>Acros Organics</td><td></td><td>119800050 reactivo&nbsp;</td></tr><tr><td>Yodometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td>haluro de alquilo</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>MTT ((3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazolio Bromuro)</td><td>EMD Millipore</td><td>Calbiochem 475989-1GM</td><td>Reactivo</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507 Medios de</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>Resina REM</td><td>Nova Biochem</td><td>8551010005</td><td>Soporte de polímeros; 0,500 mmol/g cargando</td></tr><tr><td>trans-&beta;-nitroestireno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N26806</td><td>Reactivo de nitroolefina</td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>Disolvente</td></tr><tr><td>Trietilamina (TEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td>Reactivo para la eliminación beta</td></tr><tr><td>Cloruro de trimetisilil (TMSCl)</td><td>Reactivo de 386529 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>; PRECAUCIÓN: altamente volátil; crea gas HCl</td></tr> <tr><td><fuerte>CRISTALERÍA/INSTRUMENTACIÓN</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL recipiente de reacción en fase sólida</td><td>Chemglass</td><td>CG-1861-02</td><td>Cristalería con filtro</td></tr><tr><td>96 Lector de placas de pocillos</td><td>Promega (Turner Biosystems)</td><td>9310-011</td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>Espectrómetro AVANCE III NMR Bruker</td><td></td><td>N/A</td><td>Instrumento; 300 MHz; Disolventes: CDCl3 y CD3OH</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nicole iS5</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td><td>Instrumento</td></tr> de <tr><td>acción de muñeca</td><td>Burrell Scientific</td><td></td><td>757950819 Instrument</td></tr></tbody></table>

ensayo funcionalizado de síntesis y citotoxicidad del heterociclo espirocíclico

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

Recientemente se ha informado en la literatura que los heterociclos espirocíclicos son fármacos potenciales para el tratamiento del cáncer. La síntesis de estos novedosos sistemas de anillos ortogonales es un desafío. Recientemente se publicó una metodología eficiente para sintetizar estos compuestos que describía la síntesis en fase sólida en cuatro pasos en lugar de los cinco pasos previamente informados. La ventaja de esta síntesis más corta es la eliminación del uso de reactivos tóxicos. Se descubrió que la resina basada en enlazadores de baja carga Regenerating Michael (REM) era crucial en la síntesis, ya que las versiones de alta carga evitaban la adición de reactivos que contenían cadenas laterales voluminosas de fenilo y aromáticas. El ensayo colorimétrico de bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) se utilizó para examinar la citotoxicidad de las concentraciones micromolares de estas nuevas moléculas espirocíclicas in vitro. MTT está fácilmente disponible comercialmente y produce resultados relativamente rápidos y confiables, lo que hace que este ensayo sea ideal para estos heterociclos espirocíclicos. Se probaron estructuras de anillos ortogonales, así como furfurilamina (un precursor en el método de síntesis que contiene un motivo de anillo similar de 5 miembros).

Las oximas espirocíclicas 6 y 7 se sintetizaron utilizando un protocolo modificado (Figura 1). La adición de furfurilamina de Michael a un enlazador REM 1b proporcionó resina 2 unida a polímeros. El progreso de la reacción fue monitoreado por espectroscopia infrarroja (IR) detectando la desaparición del éster α,β-insaturado a 1722 cm-1 (Figura 3). La resina 4 unida a espirocíclicos se formó a partir de 2 a través de un intermedio transitorio 3. La hid...

Aquí, describimos un bioensayo utilizando bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) para probar oximas espirocíclicas previamente sintetizadas.

Ensayo funcionalizado de síntesis y citotoxicidad del heterociclo espirocíclico

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

Este protocolo utiliza un método reciclable y modificado en la producción de compuestos espirocíclicos. El ensayo MTT ayuda a responder la pregunta relacionada con la citotoxicidad de estas nuevas moléculas. Esta técnica produce nuevas moléculas modificables utilizando un material de partida regenerador.El ensayo MTT proporciona resultados biológicos relativamente rápidos y fáciles de analizar Comience realizando la síntesis en fase sólida de los ciclos hetero espirocíclicos seis y siete, como se demostró anteriormente. Prepare 20 mililitros de una solución MTT de cinco miligramos por mililitro utilizando PBS estéril como diluyente. Filtre y almacene la solución a menos 20 grados centígrados.Luego, prepare una dilución uno a uno de la solución MTT en DMEM. Prepare un mililitro de soluciones madre en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros de compuestos de prueba en DMSO. Guárdelos a menos 20 grados centígrados.Preparar 200 microlitros por dosis de las soluciones de trabajo de los compuestos problema diluyendo las concentraciones madre. Uno a 1000 en medio libre de suero. En las semillas de cultivo de tejidos, COS siete células en medio completo sobre cultivo de tejido de fondo plano trataron 96 placas de pocillos a una concentración de 4, 000 células por 200 microlitros por pocillo.Utilizando un pipeter multicanal. Incubar las células durante 24 horas a 37 grados centígrados en una atmósfera que contenga 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, aspire el sobrenadante de los pozos con una pipeta de vidrio para pasto conectada a una bomba de vacío.Dosificar las células por triplicado con los compuestos problema utilizando las soluciones de trabajo previamente preparadas. Luego devuelva las células a la incubadora. Después de 24 horas, aspire el sobrenadante de los pocillos y agregue 200 microlitros de solución MTT a cada pocillo.Incubar el plato durante cuatro horas. Aspirar suavemente el sobrenadante de los pocillos sin alterar los cristales de formazane púrpura. Agregue 200 microlitros de DMSO a cada pocillo para disolver los cristales.Luego incubar el plato a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mida la absorbancia de cada pocillo a 590 o 600 nanómetros utilizando un lector de placas de 96 pocillos. Utilice pocillos sin celdas como fondo y promedie el valor de absorbancia.Las costuras espirocíclicas seis y siete de gox se sintetizaron utilizando un protocolo modificado. El progreso de la reacción fue monitoreado mediante la detección de la desaparición de la alfa beta insaturada Esther mediante espectroscopia infrarroja. El ensayo MTT se utilizó para determinar la viabilidad celular.El cisplatino, que se sabe que induce la muerte celular a altas concentraciones, sirvió como un control positivo. Como era de esperar, cuanto mayor es la concentración de cisplatino, menor es la viabilidad celular. El ensayo MTT se utilizó para probar los compuestos espirocíclicos seis y siete y furfurilamina.La furfurilamina y la costura espirocíclica del gox seis mostraron una citotoxicidad similar. Sin embargo, la toxicidad del compuesto espirocíclico siete fue notablemente mayor que la de furfurilamina y seis. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que se encontró que la N-alquilación realizada con haluros de acilo voluminosos reduce la tasa de eliminación beta, lo que reduce el rendimiento del producto.

functionalized-spirocyclic-heterocycle-synthesis-cytotoxicity

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Investigación

JoVE Journal

Biology

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Los compuestos de tiofenesulfonamida son inhibidores potentes y específicos de los reguladores de detección LuxR /HapR que bloquean su actividad in vivo, evitando así la transcripción de genes de virulencia, motilidad y biopelículas. Este protocolo detalla cómo se sintetizan, modelan in silico y analizan in vivo estos compuestos para determinar su actividad frente a LuxR/HapR.

Síntesis y ensayo de inhibidores de detección de quórum Vibrio

Aquí presentamos un protocolo para el diseño guiado por la estructura de la interacción de unión proteína-ligando entre la sangliferina A y la ciclofilina A/Ganoderiol-F, esencial para descubrir nuevos fármacos. La estabilidad del complejo ligando-receptor se evaluó mediante simulación de dinámica molecular.

Diseño y desarrollo guiados por la estructura de nuevos inhibidores de la ciclofilina A y derivados de ganoderiol-F: un enfoque in-silico

Este protocolo introduce una metodología de cribado fluorométrico optimizada para identificar inhibidores naturales de productos o pequeñas moléculas en la síntesis de proteínas. Su viabilidad la hace adecuada tanto para la enseñanza de grado en técnicas de descubrimiento de fármacos como para su implementación en campañas de química medicinal.

Un protocolo basado en fluorescencia para el cribado preliminar de inhibidores de síntesis de proteínas de fuentes naturales

Aquí presentamos un protocolo para identificar posibles candidatos a fármacos antituberculosos mediante cribado fenotípico, que abarca la síntesis química de un compuesto de 4-aminoquinolina, la determinación de su concentración inhibitoria mínima frente a Mycobacterium tuberculosis y la evaluación de su citotoxicidad en líneas celulares de mamíferos.

Identificación de posibles candidatos anti-TB: Guía paso a paso para la síntesis, determinación de la CIM y evaluación de citotoxicidad en células mamíferas

Aprenda a sintetizar heterociclos espirocíclicos mediante síntesis en fase sólida y evalúe su citotoxicidad en células COS7 utilizando el ensayo MTT. Este método aporta información valiosa para la investigación oncológica y el desarrollo de fármacos.

Ensayo funcionalizado de síntesis y citotoxicidad del heterociclo espirocíclico

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