Name: Preparación de muestras de plantas para la medición del contenido de nucleósidos/nucleótidos con una HPLC-MS/MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprende a preparar muestras de plantas para cuantificar nucleósidos y nucleótidos mediante HPLC-MS/MS. Este método rápido y reproducible permite analizar 10 a 20 muestras en dos días.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (KJQN202060), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31900907), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (BK20190528), el Centro Internacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (CRP/CHN20-04_EC) a M.C., y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (LGZD202004) a X.L.

1 Crecimiento de planta y colección de materiales
<ol><li>Asegúrese de que las semillas de Arabidopsis se esterilizan en etanol al 70% durante 10 min y se siembran en las placas de agar, que se prepararon con nutrientes Murashige y Skoog de media fuerza.</li>
	<li>Incubar las placas que contienen semillas de Arabidopsis bajo la oscuridad a 4 °C durante 48 h, y luego transferirlas a una cámara de crecimiento controlado bajo 16 h de luz de 55 μmol m-2 s-1 a 22 °C y 8 h de oscuridad a 20 °C.</li>
	<li>Cosechar 100 mg de plántulas de 2 semanas (peso fresco) y congelar nitrógeno líquido para la extracción de metabolitos. PRECAUCIÓN: Los investigadores deben usar apropiadamente guantes, gafas protectoras y una bata de laboratorio para evitar la contaminación de tejido humano durante la recolección de materiales.</li>
</ol>2 Extracción de nucleósidos/nucleótidos
<ol><li>Molido 100 mg de tejidos vegetales congelados con 7-8 perlas de acero en un molino mezclador pre-frío durante 5 min a una frecuencia de 60 Hz.</li>
	<li>Prepare la solución de extracción, que contiene metanol, acetonitrilo y agua en una proporción de 2:2:1.</li>
	<li>Resuspend los materiales homogeneizados (incluyendo la mayoría de los metabolitos pero no las proteínas) con 1 mL de solución de extracción.</li>
	<li>Centrifugar la solución resultante a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Transferir 0,5 mL de la suspensión a un nuevo tubo de 1,5 mL y congelar el nitrógeno líquido.</li>
	<li>Evaporar la muestra congelada en un congelador y resuspend en 0,1 mL de acetonitrilo al 5% y 95% de agua.</li>
	<li>Centrifugar la solución resultante (0,1 mL) a 40.000 x g durante 10 min a 4 °C. Cargue el sobrenadante en un vial para la medición de LC-MS/MS.</li>
</ol>3 Medición LC-MS/MS
<ol><li>Preparar un tampón de acetato de amonio de 10 mM disolviendo 1,1 g de acetato de amonio en 2 L de agua doblemente desionizada (fase móvil A). Ajuste el pH a 9.5 por 10% de ácido de amonio y acetato.</li>
	<li>Preparar 2 L de ultrapuro 100% metanol (Fase móvil B1) para la medición de nucleósidos. Además, prepare 2 L de ultrapuro 100% acetonitrilo (fase móvil B2) para la medición de nucleótidos.</li>
	<li>Inyecte 0,02 mL de extracción de metabolitos pre-tratados de cada muestra del paso 2,7 en un sistema de HPLC con bombas binarias (LC) junto con un espectrómetro de masas triple cuadrupolo (MS). PRECAUCIÓN: El sistema hplc emplea una columna C18 (50 x 4,6 mm, tamaño de partícula 5 μm; trabajando a 25 °C) buffering con fase móvil A y B1 (Figura 1A) para la separación de nucleósidos y utilizar una columna de carbono grafítico poroso (PGC) (50 x 4,6 mm, tamaño de partícula 5 μm; trabajando a 25 °C) con fase móvil A y B2 (Figura 1B) para la separación de nucleótidos. Cada muestra fue inyectada tres veces para la replicación técnica.</li>
	<li>Programe el método como se muestra en la tabla 1 para la columna C18, y el método como se muestra en la tabla 2 para la columna PGC. Establecer un caudal de 0,65 mL min-1. NOTA: Las transiciones de masa (Tabla 3) fueron monitoreadas por espectrómetro de masas. Las condiciones de análisis del espectro de masas de ocho nucleósidos y cinco nucleótidos que contienen canónicos y modificados se enumeran en la Tabla 3.</li>
	<li>Registrar las áreas máximas de cada compuesto objetivo (Figura 1).</li>
</ol>4 Generación de las curvas estándar de la calibración
<ol><li>Agrupar seis extracciones de muestras juntas, que se produjeron siguiendo la descripción en la sección 2, y vórtice. Luego, alícuota a seis extracciones (mismo volumen) de nuevo para obtener cada fondo.</li>
	<li>Añadir seis concentraciones diferentes de cada estándar a estas seis extracciones, respectivamente, e inyectarlas una por una siguiendo el paso 3.3.</li>
	<li>Registre las áreas de pico de cada estándar en diferentes concentraciones a través de las transiciones de masa como se describe en los pasos 3.4 y 3.5.</li>
	<li>Trace el área de pico contra la concentración nominal de cada estándar para generar una curva de seis puntos. NOTA: Las áreas de pico de nucleósidos/nucleótidos registrados en el paso 3.5 deben estar dentro del rango de curvas de calibración estándar.</li>
	<li>Calcular la ecuación de una línea recta para cada compuesto estándar: Y = aX + b</li>
</ol>5 Cuantificación de metabolitos
<ol><li>Calcular el contenido de metabolitos utilizando la zona de cresta registrada en el paso 3.5 y la ecuación del paso 4.5.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+deoxyribonucleotide+metabolites+and+embryonic+cell-cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control.</a> Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).</li>
<li>Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+and+purine+biosynthesis+and+degradation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).</li>
<li>Witte, C. -P., Herde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+metabolism+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide metabolism in plants.</a> Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).</li>
<li>Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+the+nine+cytidine+deaminase-like+genes+in+Arabidopsis%2C+eight+are+pseudogenes+and+only+one+is+required+to+maintain+pyrimidine+homeostasis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((m6A+RNA+degradation+products+are+catabolized+by+an+evolutionarily+conserved+N6-methyl-AMP+deaminase+in+plant+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells.</a> The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).</li>
<li>Chen, M., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinase+and+a+glycosylase+catabolize+pseudouridine+in+the+peroxisome+to+prevent+toxic+pseudouridine+monophosphate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation.</a> The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).</li>
<li>Dahncke, K., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+purine+nucleoside+catabolism+employs+a+guanosine+deaminase+required+for+the+generation+of+xanthosine+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 25 (10), (2013).</li>
<li>Jung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine-ribohydrolase+is+a+key+regulator+in+the+uridine+degradation+pathway+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).</li>
<li>Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nucleoside+hydrolases+involved+in+intracellular+and+extracellular+degradation+of+purines%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines.</a> Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).</li>
<li>Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+nucleosidase+mutants+provide+new+insights+into+nucleoside+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation.</a> New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).</li>
<li>Zrenner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+analysis+of+the+pyrimidine+catabolic+pathway+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis.</a> New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).</li>
<li>Hauck, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+accumulation+in+an+Arabidopsis+urate+oxidase+mutant+impairs+seedling+establishment+by+blocking+peroxisome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance.</a> The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).</li>
<li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+nucleosides%2C+nucleobases%2C+and+amino+acids+in+different+parts+of+Angelicae+Sinensis+Radix+by+ultra+high+performance+liquid+chromatography+coupled+to+triple+quadrupole+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry.</a> Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).</li>
<li>Zong, S. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+simultaneous+determination+of+13+nucleosides+and+nucleobases+in+Cordyceps+sinensis+by+UHPLC-ESI-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS.</a> Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).</li>
<li>Moravcová, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+nucleobases%2C+nucleosides%2C+and+nucleotides+using+two+zwitterionic+silica-based+monolithic+capillary+columns+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+ultra-high+performance+liquid+chromatography+coupled+with+triple+quadrupole+mass+spectrometry+for+determination+of+nucleotides%2C+nucleosides+and+nucleobases+in+Ziziphus+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants.</a> Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).</li>
<li>Seifar, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+free+nucleotides+in+complex+biological+samples+using+ion+pair+reversed+phase+liquid+chromatography+isotope+dilution+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).</li>
<li>Baccolini, C., Witte, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP+and+GMP+catabolism+in+Arabidopsis+converge+on+xanthosine%2C+which+is+degraded+by+a+nucleoside+hydrolase+heterocomplex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex.</a> The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Los organismos contienen varios nucleósidos/nucleótidos, incluyendo los canónicos y aberrantes. Sin embargo, el origen y los puntos finales metabólicos de ellos, especialmente nucleósidos modificados, son todavía obscuros. Además, la comprensión actual de la función y la homeostasis del metabolismo de nucleósidos/nucleótidos sigue siendo explorada y ampliada. Para investigarlos, es necesario emplear un método preciso y de referencia para la identificación y cuantificación de estos metabolitos. Aquí, se describió un proto...

Los nucleósidos/nucleótidos son componentes metabólicos centrales en todos los organismos vivos, que son los precursores de los ácidos nucleicos y muchas coenzimas, como el dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD), e importantes en la síntesis de macromoléculas como fosfolípidos, glicolípidos y polisacáridos. Estructuralmente, el nucleósido contiene una nucleobase, que puede ser una adenina, guanina, uracilo, citosina o timina, y una mitad de azúcar, que puede ser una ribosa o una desoxirribosa1,2. Los nucleótidos tienen hasta tres grupos fosfato que se une a la posición de 5 carbonos de la mitad azucarada de los nucleósidos3. El metabolismo de los nucleótidos en las plantas es esencial para la germinación de las semillas y el crecimientode las hojas 4,5,6. Para comprender mejor sus funciones fisiológicas en el desarrollo de las plantas, deben establecerse los métodos para la cuantificación absoluta de diferentes nucleósidos/nucleótidos in vivo.
Uno de los enfoques más comúnmente utilizados para medir nucleósidos /nucleótidos emplea una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) junto con un detector ultravioleta-visible (UV-VIS)4,7,8,9,10,11. En 2013, utilizando HPLC, Dahncke y Witte cuantificaron varios tipos de nucleósidos en Arabidopsis thaliana7. Identificaron un contenido mejorado de guanosina en un mutante de inserción de ADN T dirigido en el gen de la guanosina desaminasa en comparación con la planta de tipo salvaje. Otro nucleósido de pirimidina, la citidina, también se detectó cuantitativamente en plantas que empleaban este método, lo que resultó en la identificación de un gen de buena fe de la citidina desaminasa4. Basado en el detector UV, este método, sin embargo, no puede distinguir fácilmente los nucleósidos que tienen espectros y tiempos de retención similares, por ejemplo, guanosina o xantosina. El límite de detección del método de HPLC es relativamente alto, por lo tanto, se utiliza con frecuencia para la medición del alto contenido de nucleósidos in vivo, como citidina, uridina y guanosina.
Además, la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (GC-MS) también se puede utilizar en la medición de nucleósidos. Beneficiándose de ella, Hauck et al. al. detectaron con éxito uridina y ácido úrico, que es un metabolito aguas abajo de la vía catabólica de nucleósidos, en las semillas de A. thaliana12. Sin embargo, gc se utiliza normalmente para separar compuestos volátiles, pero no es adecuado para las sustancias térmicamente lábiles. Por lo tanto, una cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS) es probablemente una técnica analítica más adecuada y precisa para la identificación in vivo, separación y cuantificación de los nucleósidos/nucleótidos13,14. Varios estudios previos informaron que una columna HILIC puede ser utilizada para la separación de nucleósidos y nucleótidos15,16 y se emplearon estándares internos marcados isotópicamente para la cuantificación de compuestos17. Sin embargo, ambos componentes son relativamente caros, especialmente los estándares comerciales etiquetados con isótopos. Aquí, se presenta un enfoque de LC-MS / MS económicamente aplicable para la medición de nucleósidos / nucleótidos. Este método ya se ha utilizado con éxito para la cuantificación de diversos nucleósidos / nucleótidos, incluyendo ATP, N6-metil-AMP, AMP, GMP, uridina, citidina y pseudouridina1,5,6,18,en plantas y Drosophila. Por otra parte, el método que divulgamos aquí se puede utilizar en otros organismos también.

<table><tbody><tr><td>acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1000291000</td><td></td></tr><tr><td>adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251-1G</td><td></td></tr><tr><td>acetato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>73594-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01930-5G</td><td></td></tr><tr><td>CMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1006-500MG</td><td></td></tr><tr><td>citidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C122106-1G</td><td></td></tr><tr><td>GMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8377-500MG</td><td></td></tr><tr><td>guanosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6752-1G</td><td></td></tr><tr><td>columna Hypercarb</td><td>Thermo Fisher Scientific GmbH</td><td>35005-054630</td><td></td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57510-5G</td><td></td></tr><tr><td>inosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125-1G</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>N1-metiladenosina</td><td>Carbosynth</td><td>NM03697</td><td></td></tr><tr><td>O6-metilguanosina</td><td>Carbosynth</td><td>NM02922</td><td></td></tr><tr><td>Medio Murashige y Skoog</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0255.005</td><td></td></tr><tr><td>columna Polaris 5 C18A</td><td>Agilent Technologies</td><td>A2000050X046</td><td></td></tr><tr><td>pseudouridina</td><td>Carbosynth</td><td>NP11297</td><td></td></tr><tr><td>UMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6375-1G</td><td></td></tr><tr><td>uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de muestras de plantas para la medición del contenido de nucleósidos/nucleótidos con una hplc-ms/ms

Plant Sample Preparation for Nucleoside/Nucleotide Content Measurement with An HPLC-MS/MS

Los nucleósidos/nucleótidos son bloques de construcción de ácidos nucleicos, partes de cosubstratos y coenzimas, moléculas de señalización celular y portadores de energía, que están involucrados en muchas actividades celulares. Aquí, describimos un método rápido y confiable para la calificación absoluta del contenido de nucleósidos / nucleótidos en plantas. Brevemente, se extrajeron 100 mg de material vegetal homogeneizado con 1 mL de tampón de extracción (metanol, acetonitrilo y agua en una proporción de 2:2:1). Más tarde, la muestra se concentró cinco veces en un liofilizador y luego se inyectó en una HPLC-MS / MS. Los nucleótidos se separaron en una columna de carbono grafítico poroso (PGC) y los nucleósidos se separaron en una columna C18. Las transiciones de masa de cada nucleósido y nucleótido fueron monitoreadas por espectrometría de masas. El contenido de los nucleósidos y nucleótidos se cuantificó contra sus estándares externos (ESTDs). Usando este método, por lo tanto, los investigadores pueden cuantificar fácilmente nucleósidos/nucleótidos en diferentes plantas.

Aquí, mostramos la identificación y cuantificación de N1-metiladenosina, un nucleósido modificado conocido, en 2 semanas de edad Arabidopsis tipo salvaje (Col-0) plántulas como un ejemplo. El perfil de espectrometría de masas indicaque los iones producto generados a partir del estándar N 1-metiladenosina son 150 m/z y 133 m/z(Figura 2A),y el mismo perfil también se observa en la extracción de Col-0(Figura 2B...

Un método preciso y reproducible para la cuantificación in vivo de nucleósidos/nucleótidos en plantas se describe aquí. Este método emplea una HPLC-MS/MS.

Preparación de muestras de plantas para la medición del contenido de nucleósidos/nucleótidos con una HPLC-MS/MS

Nucleosides/nucleotides are building blocks of nucleic acids, parts of cosubstrates and coenzymes, cell signaling molecules, and energy carriers, which ...

Los nucleósidos y nucleótidos son componentes metabólicos centrales en todos los organismos vivos. El metabolismo de ellos es necesario para el desarrollo celular. Este enfoque proporciona una poderosa herramienta para la cuantificación de estos metabolitos.Este método permite la cuantificación rápida y precisa de nucleósidos y nucleótidos en plantas. Los pre-tratamientos completos de la muestra y los análisis lc-ms/ms toman cerca de dos días para un conjunto de 10 a 20 muestras. Este método se puede aplicar a todas las plantas e incluso a otros organismos.Demostrando el procedimiento estará Changhua Zhu, profesor asociado del Laboratorio Chen. Para cultivar las plantas, asegúrese de que las semillas de Arabidopsis se esterilicen en etanol al 70% durante 10 minutos y se sembran en placas de agar con nutrientes Murashige y Skoog de 1/2 fuerza. Incubar las placas en la oscuridad a cuatro grados Celsius durante 48 horas, luego transferirlas a una cámara de crecimiento controlado bajo 16 horas de luz a 22 grados Celsius y ocho horas de oscuridad a 20 grados Celsius.Cosechar 100 miligramos de plántulas de dos semanas y congelarlos en nitrógeno líquido para la extracción de metabolitos. Moler 100 miligramos de tejidos vegetales congelados con siete a ocho perlas de acero en un molino mezclador preenfriado durante cinco minutos a una frecuencia de 60 Hertz. Prepare la solución de extracción, que contiene metanol, acetonitrilo y agua en una proporción de dos a dos a uno.Resuspend los materiales homogeneizados con un mililitro de la solución de extracción. Centrifugar la solución resultante a 12, 000 XG durante 15 minutos a cuatro grados Celsius, luego transferir 0.5 mililitros de la suspensión a un nuevo tubo de 1.5 mililitros y congelarlo en nitrógeno líquido. Evaporar la muestra congelada en un liofilizador y resuspend en 0,5 mililitros de acetonitrilo al 5% y 95% de agua.Centrifugar la solución resultante a 4,000 XG durante 10 minutos a cuatro grados Centígrados. Cargue el sobrenadante en un vial para la medición de LC-MS/MS. Prepare un tampón de acetato de amonio de 10 milimolares disolviendo 1,5 gramos de acetato de amonio en dos litros de agua doblemente desionizada.Ajuste el pH a 9,5 con ácido de amonio y acetato al 10%. Prepare dos litros de ultrapuro 100% metanol para la medición de nucleósidos, luego prepare dos litros de acetonitrilo ultrapuro para la medición de nucleótidos. Inyecte 0,02 mililitros de la extracción de metabolitos pretratados de cada muestra previamente preparada en un sistema de HPLC con bombas binarias junto con un espectrómetro de masas triple cuádruple.Para generar las curvas de calibración estándar, aglutico las extracciones de seis muestras y vórtice la mezcla, luego alícuota a seis extracciones de nuevo para obtener cada fondo. Agregue seis concentraciones diferentes de cada estándar a estas seis extracciones respectivamente e inyéctelas una por una en el sistema de HPLC. Registre las áreas pico de cada estándar en diferentes concentraciones a través de las transiciones de masa.Este protocolo fue utilizado para identificar y para cuantificar N1-methyladenosine, un nucleósido modificado sabido, en el salvaje-tipo dos-semana-viejos plántulas del Arabidopsis. El perfil de espectrometría de masas indicó que los iones del producto generados a partir del estándar N1-metiladenosina están en proporciones de 150 y 133 MZ. Y el mismo perfil se observó en la extracción cero de Colombia.Debido a la alta abundancia del ion del producto de 150 MZ, la transición total de 282,1 a 150 fue seleccionada para la identificación de N1-methyladenosine. El tiempo de retención del pico objetivo fue de 7,05 minutos. Igual que el tiempo de retención de N1-metiladenosina estándar.Una serie de la concentración de estándares de N1-methyladenosine fue agregada en seis extracciones de la muestra. Las muestras estándar fueron inyectadas en el LC-MS/MS y las áreas máximas crecientes de N1-methyladenosine fueron trazadas contra las concentraciones nominales de los estándares. Las seis extracciones de fondo iguales son importantes para hacer una curva de calibración precisa y repetible para la cuantificación.Nuestro método se puede aplicar para explorar las vías metabólicas en las plantas. Mediante la comparación de los perfiles de metabolitos entre mutantes de tipo salvaje y pérdida de función, el flujo metabólico podría ser dibujado.

plant-sample-preparation-for-nucleosidenucleotide-content-measurement

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Se describe un protocolo para identificar proteínas RNA-que atan y mapa de sus regiones de unión de ARN en células vivas usando photocrosslinking mediada por la UV y espectrometría de masas.

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Describimos en detalle dos protocolos basados en químicos para el cultivo de células madre embrionarias de ratón. Este nuevo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidación mediada por Tet (vitamina C) y reprimiendo la síntesis de novo de la 5-METILCITOSINA (por PD0325901) para mantener el hypomethylation de la DNA y pluripotencia de células madre embrionarias de ratón.

Un método de cultura alternativa para mantener la hipometilación genómica de células madre embrionarias del ratón usando MEK inhibidor PD0325901 y vitamina C

Aquí, presentamos un protocolo para una purificación eficiente solo paso del humano sin etiquetar activo desplazamiento de diez-once-2 (TET2) 5-METILCITOSINA dioxygenase utilizando cromatografía de intercambio iónico y su ensayo con una masa líquida de la cromatografía-tandem Espectrometría (LC-MS/MS)-enfoque basado en.

Eficiente purificación y desarrollo análisis LC-MS/MS-based para diez-once 2 desplazamiento 5-METILCITOSINA dioxigenasa

Describimos aquí métodos para la cuantificación sensible y precisa de las lesiones 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-dado) y 1,n2- etheno-2'-desoxyguanosine (1,N2-DGUO) en el ADN. Los métodos se aplicaron a la evaluación de los efectos de las partículas finas ambientales (PM2,5) en los tejidos (pulmón, hígado y riñón) de ratones expuestos A/J.

Cuantificación de tres lesiones de ADN por espectrometría de masas y evaluación de sus niveles en los tejidos de los ratones expuestos a la materia particulada fina ambiental

Aquí, describimos un protocolo detallado para un método de secuenciación basado en LC-MS que se puede utilizar como método directo para secuenciar ARN corto (&lt;35 nt por ejecución) sin un intermedio de ADNc, y como método general para secuenciar diferentes modificaciones de nucleótidos en un solo estudio con precisión de una sola base.

2D-HELS MS Seq: Un método general basado en LC-MS para la secuenciación directa y de novo de mezclas de ARN con diferentes modificaciones de nucleótidos

En este protocolo, presentamos un flujo de trabajo optimizado, que combina una preparación de muestras eficiente y rápida de muchas muestras. Además, proporcionamos una guía paso a paso para reducir las variaciones analíticas para la evaluación de alto rendimiento de los estudios metabólicos GWAS.

Estudios de asociación multiómica a gran escala de todo el genoma (Mo-GWAS): Directrices para la preparación y normalización de muestras

Las modificaciones post-transcripcionales del ARN representan una capa poco estudiada de regulación de la traducción que recientemente se ha relacionado con la plasticidad del sistema nervioso central. Aquí, se describe la preparación de muestras y el enfoque de cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem para la caracterización simultánea de numerosas modificaciones de ARN en neuronas individuales.

Caracterización de modificaciones de ARN en neuronas individuales mediante espectrometría de masas

Aprende a preparar muestras de plantas para cuantificar nucleósidos y nucleótidos mediante HPLC-MS/MS. Este método rápido y reproducible permite analizar 10 a 20 muestras en dos días.

Preparación de muestras de plantas para la medición del contenido de nucleósidos/nucleótidos con una HPLC-MS/MS

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