Name: Esferoides cardíacos como tejidos cardíacos bioingeniería in vitro para estudiar la fisiopatología cardíaca humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Aprende a fabricar esferoides cardíacos tridimensionales mediante co-cultivo de miocitos, fibroblastos y células endoteliales en gotas colgantes. Este modelo in vitro permite estudiar la cardiotoxicidad de doxorrubicina y evaluar terapias potenciales para la insuficiencia cardíaca humana.

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Un agradecimiento especial a Nat Johnston por la grabación y edición del vídeo.
Poonam Sharma fue apoyado por la Universidad de Newcastle con las becas UNIPRS y UNRS Central & Faculty School (UNRSC5050). Carmine Gentile fue apoyado por un UTS Seed Funding, Catholic Archdiocese of Sydney Grant for Adult Stem Cell Research y una Beca de Investigación de Cirugía Cardiotorácica de la Fundación De medicina de Sídney.

NOTA: los hiPSC-CM utilizados para este protocolo están disponibles comercialmente. Por favor, busque la aprobación del comité institucional de ética humana antes de comenzar este trabajo si es necesario.
1. Fibroblasto cardíaco humano y endotelial de cultivo y crecimiento
<ol><li>Descongelar crioviales que contienen HCF y HCAEC en un baño de agua a 37 oC durante un minuto.</li>
	<li>Mueva los crioviales bajo un gabinete de bioseguridad de flujo laminar estéril clase 2.</li>
	<li>Recoger 1 ml de suspensión celular de los crioviales utilizando una punta de pipeta de 1000 l y añadir en un tubo de 15 ml que contiene 7 ml de medio de fibroblasto cardíaco humano para los HCF y 7 ml de medio de crecimiento de Meso Endo humano para HCAEC. NOTA: Para recoger la mayoría de las células de cada criovial, enjuáguelas dos veces con 1 ml de medio de cultivo del mismo tubo de 15 ml.</li>
	<li>Mezcle suavemente las suspensiones celulares.</li>
	<li>Transfiera las suspensiones celulares a matraces de cultivo T75 separados utilizando una pipeta serológica de 10 ml.</li>
	<li>Incubar células a 37oC con 5% de CO2.</li>
	<li>Después de 18 h, aspirar el medio de ambos matraces de cultivo y enjuáguelos una vez con solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) para eliminar las células medias y muertas heladas.</li>
	<li>Sustituya PBS por 7 ml de medio de cultivo adecuado por cada matraz de cultivo e incubar a 37oC.</li>
	<li>Examine la expansión celular y la viabilidad regularmente y reemplace los medios cada dos días hasta que las células alcancen el 80-90% de confluencia.</li>
</ol>2. Revestimiento y crecimiento de cultivo iCM
<ol><li>Precubrir dos matraces de cultivo T25 con 2 ml de PBS que contengan 40 g/ml de fibronectina (FN) e incubar a 37oC, 5% CO2 durante al menos 4 horas.</li>
	<li>Después de 4 horas, recoger un criovial que contenga iCM y colocarlo en un baño de agua a 37 oC durante 4 min.</li>
	<li>Mueva el criovial bajo un gabinete de bioseguridad de flujo laminar estéril clase 2.</li>
	<li>Transfiera suavemente los iCM del criovial a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml utilizando una punta de pipeta de 1 ml.</li>
	<li>Enjuague el criovial vacío de iCM con 1 ml de medio de chapado a temperatura ambiente para recuperar las células residuales. Transfiera los 1 ml de enjuague del medio de chapado de la gota crioovial durante 90 s al tubo centrífugo de 50 ml que contiene la suspensión celular iCM. NOTA: Gire suavemente el tubo mientras agrega el medio para mezclar completamente la solución y disminuir el choque osmótico en las células descongeladas.</li>
	<li>Añadir lentamente 8 ml de temperatura ambiente Plating Medium al tubo centrífugo de 50 ml. Agregue la primera gota de 1 ml sobre 30 - 60 s. A continuación, agregue el volumen restante en los próximos 30 s. Gire suavemente el tubo de centrífuga mientras añade el medio de chapado. Mezclar suavemente el contenido del tubo centrífugo de 50 ml invirtiendo de 2 a 3 veces (evitando sacudimientos o vórtices vigorosos).</li>
	<li>Realice inmediatamente el recuento celular utilizando un hemocitociómetro y determine la densidad celular viable (en células/ml).</li>
	<li>Tome los matraces T25 pre-recubiertos FN y aspire la solución FN-PBS sin dejar que los matraces se sequen. A esto añadir el volumen de siembra de iCM (1,6 x 106 iCM viables en medio de chapado a temperatura ambiente de 8 ml).</li>
	<li>Cultivo iCM en la incubadora durante 48 h a 37oC, 5% CO2.</li>
	<li>Descongelar el medio de mantenimiento durante la noche a 4 oC al día antes de su uso.</li>
	<li>Equilibrar el medio de mantenimiento en un baño de agua a 37 oC y utilizar inmediatamente.</li>
	<li>Después de 2 días, mueva los matraces iCM T25 debajo del gabinete de bioseguridad.</li>
	<li>Lave suavemente las células muertas y los desechos pipeteando suavemente el medio de chapado hacia arriba y hacia abajo 5 veces.</li>
	<li>Aspirar el medio de chapado y sustituirlo por los 8 ml del medio de mantenimiento precalegado. Vuelva a colocar los matraces T25 en la incubadora. Sustituya el medio de mantenimiento cada dos días y examine la confluencia con regularidad.</li>
</ol>3. Aislamiento celular y conteo
<ol><li>Comience por recopilar los primeros HCAEC y HCF, y luego iCM siguiendo los pasos 3.2-3.12.</li>
	<li>Preparar el medio de cultivo CS mezclando 10 ml de iCM Medio de Mantenimiento, 5 mL de Fibroblasto Cardíaco Humano Medio y 5 mL de Meso Endo Growth Medium.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo de cada matraz de tejido que contenga HCF y HCAEC y enjuague una vez con 5 ml de PBS para matraces T75. Retire PBS.</li>
	<li>Añadir 5 ml de solución EDTA de trippsina al 0,25% a cada matraz T75 e incubar durante 5 min a 37oC, 5% CO2.</li>
	<li>Una vez que las células se desprenden, neutralice inmediatamente la solución EDTA de trippsina con 5 ml de medio de cultivo.</li>
	<li>Transfiera las suspensiones celulares a un tubo de 15 ml y a células centrífugas a 300 x g durante 4 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante cuidadosamente de cada tubo. Añadir 1 ml de medio CS a cada pellet celular y resuspendarlos. Mantenga el tubo en hielo y cuente las células usando Trypan Blue y un hemociclomekil.</li>
	<li>Retire el medio de mantenimiento de los matraces de tejido que contengan iCM y enjuague una vez con 3 ml de PBS.</li>
	<li>Añadir 1 ml de solución EDTA de trippsina al 0,25% a cada matraz T75 e incubar a 37oC, 5% CO2. Revise las celdas cada minuto hasta que se desprenda.</li>
	<li>Una vez que las células se desprenden, neutralice inmediatamente la solución EDTA de trippsina con 4 ml de medio de cultivo.</li>
	<li>Transfiera las suspensiones celulares a un tubo de 15 ml y centrifugarlas a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante cuidadosamente de cada tubo. Añadir 1 ml de medio de cultivo al pellet celular y resuspendlo. Mantenga el tubo en hielo y cuente las células usando Trypan Blue y un hemociclomekil.</li>
</ol>4.CS generación y crecimiento
<ol><li>Mezclar iCM, HCF y HCAEC en relación 2:1:1 mediante el recubrimiento de 10.000 iCM, 5.000 HCF y 5.000 HCAEC por cultivo colgante de gota que contiene 20 l de CS medio. Ajuste al volumen final para el número total de CS.</li>
	<li>Pipetear 20 l de suspensión celular en cada poc de la placa HDC de 384 pocillos manualmente o mediante el uso de una pipeta multicanal robótica para el manejo automatizado de líquidos.</li>
	<li>Pipetear 1,5 ml de PBS estéril en cada lado del canal alrededor de la placa colgante para evitar el secado de CSs. Incubar la placa HDC a 37 oC.</li>
	<li>Examine la formación de CS a diario hasta que se observe un esferoide completamente formado en la mayoría de los pozos. Añadir 7,5 l de medio CS a cada pocero cada dos días hasta que se forme una CS.</li>
</ol>5.CS incrustar en geles de colágeno
<ol><li>Recoger CS con una punta de pipeta de 1 ml. NOTA: Es necesario cortar la punta de la pipeta alrededor de 0,2 cm del borde antes de su uso con una superficie afilada estéril (ya sea un bisturí o una tijera) para evitar cualquier daño gel incrustado esferoides durante su colección.</li>
	<li>Recoger la suspensión CS en un tubo de 50 ml sobre hielo.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min. NOTA: el pellet obtenido debe mantenerse sobre hielo hasta su uso.</li>
	<li>Preparar una solución de gel de colágeno (100 l/pozo para 30 pocillos de placa de 96 pozos) sobre hielo utilizando colágeno de cola de rata y CS medio en una proporción de 3:7.</li>
	<li>Retire el sobrenadante del tubo que contiene CS.</li>
	<li>Mezclar los CS peletados dentro de la solución de gel de colágeno.</li>
	<li>Añadir 1 l/ml de hidróxido de sodio de 5 mM a la suspensión del gel de colágeno CS y mezclar suavemente.</li>
	<li>Transfiera 100 l de gel CS-colágeno a un fondo plano transparente de 96 biens de microplaca negra de poliestireno e incubar a 37 oC durante 30 min.</li>
</ol>6. Mediciones de viabilidad y toxicidad de las CS tratadas con DOX
<ol><li>Después de 30 min recoger el plato de 96 pozos de la incubadora</li>
	<li>Preparar un DOX de 10 m (basado en el protocolo previamente establecido para la muerte celular en las CS14). NOTA: Para probar potencialmente otros agentes que pueden proteger contra HF en CS, genere soluciones que contengan DOX + Agente A, B, etc.</li>
	<li>Añadir 100 l de soluciones que contengan DOX y/u otros agentes a cada pocól. Las referencias culturales de control contienen medios sin ningún DOX.</li>
	<li>Incubar la placa durante 18 h a 37oC, 5% CO2.</li>
	<li>Al día siguiente, recoja las soluciones de stock de reactivos de tinción Live/Dead y permítales descongelar sobre hielo en la oscuridad en un gabinete de bioseguridad.</li>
	<li>Preparar una solución que contenga la mancha de Hoechst, 4 m de homodimero de etidium y calceína-AM de 2 m.</li>
	<li>Añadir 100 l de tinción de Hoechst, solución de homodimer calcein-AM/ethidium en cada pocómo.</li>
	<li>Mida la fluorescencia en cada pocódi a 645 nm para el homodimero de etitio y a 530 nm para la calceina-AM, respectivamente, utilizando el lector de microplacas multimodo.</li>
	<li>Transfiera mediciones de fluorescencia a Graphpad PRISM (o un software equivalente para el análisis estadístico).</li>
	<li>Utilice el software GraphPad Prism para el análisis de datos y las estadísticas.</li>
	<li>Para el control de calidad, compruebe bajo un microscopio de epifluorescencia la tinción de núcleos, junto con calceina-AM y ethidium homodimer.</li>
</ol>7.CS evaluación de la función contráctil
<ol><li>Recoja la microplaca según lo preparado en el paso 5.8.</li>
	<li>Encienda el ordenador que contiene el software IonOptix para una detección de bordes basada en vídeo, la interfaz de asistencia de fluorescencia y el estimulador de campo MyoPacer.</li>
	<li>Coloque un nuevo resbalón de cubierta en la plataforma del soporte de tejido y ensamble el baño de agua con electrodos.</li>
	<li>Recoger suavemente los CS de los geles de colágeno utilizando una punta de pipeta de 1 ml cortada a 0,5 mm del borde y transferirlos a un tubo de halcón. Añadir medios a CS para evitar el secado de CS. Transferencia CS (uno a la vez) con unos pocos l de medios en el escenario del sistema IonOptix.</li>
	<li>Seleccione el CS que se analizarán mediante la configuración de picos en el lado izquierdo y derecho de CS utilizando el software IonOptix.</li>
	<li>Utilice el analizador de movimiento basado en ordenador para realizar un seguimiento del movimiento de los bordes CS. NOTA: Normalmente, la contractilidad se mide en el acortamiento de la célula % o en el acortamiento fraccionado %. En este caso, medimos % de acortamiento esferoide.</li>
	<li>Estabilice tanto el umbral de ajuste de picos como las opciones de borde del ordenador.</li>
	<li>Exponga los CD a diferentes frecuencias (0,3, 0,6, 1, 2 y 3 Hz) y a tensiones (1, 2, 3 y 5 V) utilizando el estimulador de campo Myopacer.</li>
	<li>Registre el acortamiento del esferoide a medida que la longitud de la CS cambia de CS tratada y no tratada.</li>
</ol>8. Microscopía de CS: fijación e inmunoetiquetado
<ol><li>Recoger la placa de 96 pozos después de 30 min (como se prepara en el paso 5.8) y fijar CSs en 4% de paraformaldehído (PFA) durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire la PFA y enjuague tres veces con PBS que contenga 0,01% de azida sódica (PBSA).</li>
	<li>Retire PBSA.</li>
	<li>Añadir 200 l de PBSA que contenga 0,02% de Tritón-X-100 a cada pocóyo durante 30 minutos en una coctelera. NOTA: Este paso permeabilizes CS para una mejor infiltración de anticuerpos.</li>
	<li>Añadir 200 l de albúmina sérica bovina al 3% en solución de PBSA durante 60 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Este paso bloquea la unión de anticuerpos inespecíficos en las CS.</li>
	<li>Preparar una solución que contenga 10 g/ml de anticuerpos antihumanos primarios de ratón contra CD31 diluidos en solución de bloqueo.</li>
	<li>Añadir 100 l de solución primaria de anticuerpos a cada pocótemo e incubar durante la noche a 4oC en un agitador.</li>
	<li>Enjuague la placa tres veces con PBSA durante 20 minutos a temperatura ambiente en una placa de balanceo.</li>
	<li>Preparar una solución que contenga la mancha de ADN de Hoechst y 10 g/ml de anticuerpo antiratón secundario conjugado Cy3 diluido en la solución de bloqueo.</li>
	<li>Añadir 100 l de solución de anticuerpos secundarios que contengan la mancha de Hoechst a cada pocóptil e incubar durante la noche a 4oC en una coctelera. NOTA: Cubra la placa con papel de aluminio a partir de este momento.</li>
	<li>Enjuague la placa tres veces durante 20 minutos con PBSA a temperatura ambiente en una placa de balanceo.</li>
	<li>Añadir 100 l de medio de montaje Vectashield a cada pocól.</li>
	<li>CS de imagen bajo un microscopio confocal de escaneo láser. Realice secciones ópticas a lo largo del eje Z y contraiga las imágenes en un único plano focal utilizando el software ImageJ.</li>
</ol>

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</ol>

En el desarrollo, la formación adecuada de la red vascular es fundamental para la generación de tejidos funcionales, incluyendo el corazón humano10,12,23,24,25,26. La consideración de la vascularización adecuada de los tejidos 3D permite el intercambio de oxígeno, factores de crecimiento, moléculas de señalización y nutrientes, evitando el desarrollo de necrosis celular dentro de cualquier tejido más grueso que 200 m6,10,12,17,24,25,26,27,28. Actualmente disponibles modelos cardíacos 3D in vitro que presentan una red vascular presentan principalmente redes vasculares desorganizadas de tamaño capilar y carecen de la vascularización ramificada compleja jerárquica observada in vivo6,8,29. El enfoque alternativo para desarrollar una compleja red de células endoteliales cardíacas descrita en este manuscrito presenta una mejor viabilidad y función celular en comparación con los modelos existentes (Figura 1)14,22. Las CS in vitro 3D modelan el corazón humano recapitulando mejor su microambiente in vivo, incluyendo sus componentes moleculares, celulares y extracelulares14,22. La generación de CS a partir de células derivadas de células madre en las gotas colgantes permite sus cultivos en condiciones definidas (por ejemplo, tipos de células y relación, formación adecuada de tejidos). Las co-culturas de iCM junto con HCF y HCAEC dentro de las CS definen la interferencia molecular y celular que regula la fisiopatología cardíaca, incluyendo su función contráctil y la respuesta a los fármacos a las concentraciones encontradas en el torrente sanguíneo del paciente14. Debido a estas características únicas, CS se han utilizado para modelar la fibrosis cardíaca, una consecuencia grave del infarto de miocardio y la insuficiencia cardíaca21. Nuestros estudios previos mostraron cómo la presencia de células endoteliales y fibroblastos es fundamental para la recapitulación del microambiente vascular en el corazón humano, permitiendo la deposición óptima de proteínas ECM derivadas de fibroblastos, como laminina, fibronectina y colágeno tipo IV, localizados en proximidad de una red de células enhelial en desarrollo14,21.
DOX es un fármaco cardiotóxico bien conocido que puede desarrollar insuficiencia cardíaca en pacientes con cáncer incluso 17 años después de su tratamiento30. Sin embargo, sigue siendo un medicamento de elección para el tratamiento de la leucemia y el linfoma en pacientes pediátricos y cáncer de mama en mujeres30. El tratamiento DOX en CS se ha utilizado para modelar la insuficiencia cardíaca (HF) in vitro para estudiar tanto los mecanismos que regulan la toxicidad en miocitos cardíacos, células endoteliales y fibroblastos14 como para modelar la fibrosis cardíaca inducida por HF21. La viabilidad celular se redujo estadísticamente en las CS tratadas con DOX en un plazo de 24 h cuando se expuso al medicamento a la concentración que se encuentra en el torrente sanguíneo de los pacientes con cáncer (entre 5 y 10 m)14 (Figura 2). Estudios previos en nuestro laboratorio también demostraron los efectos tóxicos del DOX tanto en células endoteliales cardíacas como fibroblastos a través de óxido nítrico endotelial sintasa (eNOS) utilizando inhibidores genéticos y químicos de esta vía de señalización14. El uso de antagonistas genéticos (NOS3 shRNA) y químicos (N5-(1-iminoethyl)-L-ornitina, dihidrocloruro o L-NIO) de la vía de señalización eNOS como objetivo aguas abajo del DOX impidió sus efectos tóxicos tanto en células endoteliales cardíacas como en fibroblastos14.
La actividad contráctil dentro de las CS también se ha medido gracias al acoplamiento eléctrico de las células cardíacas cuando se expone a la estimulación potencial de campo. Encontramos que las CS cultivadas con medios de control (DOX 0-M) se contraen espontánea y homogéneamente a una velocidad de superación que puede ser acelerada por la estimulación de campo dentro de 1 y 3 Hz, comparable con un corazón humano sano. Por otro lado, las CS tratadas con DOX no siguen la estimulación eléctrica, ya que no pueden contraerse. Junto con las mediciones de viabilidad celular y toxicidad utilizando calceina-AM y ethidium homodimer, este ensayo funcional para la función contráctil CS permite la evaluación del escenario complejo típico del corazón humano in vitro, actualmente no alcanzable con otros modelos. En comparación con las mediciones de actividad contráctil de células cardíacas individuales que utilizan el mismo sistema, no somos capaces de visualizar y medir la sarcomere en CSs. Por lo tanto, estamos limitados a mediciones de % de acortamiento de esferoides con el tiempo, un ensayo que tuvimos que desarrollar dentro de nuestro laboratorio. A medida que controlamos el número de células, co-cultivamos en cada CS y, por lo tanto, el tamaño de cada CS, utilizamos CS con un tamaño similar que de hecho presentan una función contráctil homogénea. Sin embargo, incluso en caso de que generamos CS de diferentes tamaños, su actividad contráctil no cambió.
También es importante informar que la naturaleza multicelular de los CS los hace lo suficientemente pesados como para localizarlos en la parte inferior del cubreobjetos en el sistema Ion-Optix, incluso en caso de que estén superfundidos. Basándonos en el hecho de que los CS se sientan solos en una posición específica, no necesitamos que se adhieran al coverlip, al contrario de lo que se hace comúnmente con células cardíacas individuales en la mayoría de los laboratorios.
El análisis microscópico de CSs manchados con anticuerpos contra troponina cardiaca T, CD31/PECAM y PECAM (como marcadores para iCM, HCAEC y HCF, respectivamente) mostró la formación de una red celular endotelial(Figura 1, azul). Para excluir completamente la necrosis en la parte interna de las CS, la evaluación espacial de la viabilidad celular se realizó en nuestro laboratorio mediante el análisis confocal de los SISTEMAS de cultivo teñidos de calceína-AM/ethidium homodimer(datos no mostrados). Sin embargo, es importante reconocer que los desarrollos futuros en el campo de la biofabricación para recapitular mejor otras características complejas típicas del corazón humano in vivo, actualmente no están disponibles en el modelo existente. Estos incluyen: i) función contráctil típica de los cardiomiocitos adultos; ii) el flujo sanguíneo y las fuerzas de presión; iii) señalización paracrina; iv) respuesta inmunitaria, que será fundamental para mejorar este y otros modelos cardíacos in vitro6. Como cualquier otro modelo tiene como objetivo recapitular las principales características de un tejido sano o un estado de la enfermedad, el protocolo para la generación y el uso de CS descrito en este manuscrito tiene como objetivo ayudar al investigador a abordar preguntas específicas, que pueden no ser exhaustivas utilizando este enfoque. Por ejemplo, el uso potencial de células derivadas del paciente para la generación de CS proporcionaría herramientas para la medicina personalizada, actualmente no disponible utilizando ensayos de alto rendimiento comúnmente disponibles para la investigación cardiovascular.
En conclusión, demostramos una manera sencilla de recapitular mejor el microambiente del corazón humano utilizando células cardíacas. Los esferoides cardíacos presentan una red celular endotelial que recapitula mejor la presente en el corazón humano en comparación con los cultivos monocapa de células cardíacas. Dadas sus características únicas, representan herramientas avanzadas para pruebas in vitro para la investigación cardiovascular. Estudios futuros que utilizan células derivadas del paciente podrían proporcionar opciones para la medicina personalizada y terapias novedosas para prevenir y tratar mejor las enfermedades cardiovasculares.

El corazón humano tiene una capacidad regenerativa limitada, mientras que las enfermedades cardiovasculares (ECV) siguen siendo la principal causa de muerte en todo el mundo a pesar de los recientes avances en la ingeniería de tejidos y las tecnologías de células madre1. La necesidad de nuevas terapias, incluidos los enfoques moleculares y celulares, para reparar un corazón dañado o para evitar que un corazón falle es una de las principales necesidades clínicas actuales para los pacientes que sufren de enfermedades cardíacas2,3,4. El objetivo principal de la ingeniería de tejidos cardíacos es fabricar un tejido cardíaco tridimensional (3D) que presenta características moleculares, celulares y extracelulares típicas de un corazón humano, incluyendo su red vascular y la función contráctil fisiológica contráctil4,5,6.
Con el fin de bioingeniería y fabricar un tejido cardíaco humano funcional que imita el corazón humano para aplicaciones in vitro e in vivo, se han investigado varios enfoques incluyendo tejidos cardíacos de ingeniería (EHT), láminas celulares y cultivos esferoides7,8. Sin embargo, estos tejidos fallan en la recapitulación del microambiente 3D óptimo típico del corazón humano y su uso potencial para pacientes con ECV no puede traducirse directamente desde el banco a la cabecera7. Esto se debe a que no recapitulan la compleja biología, morfología y fisiología de los tejidos cardíacos in vivo9. Uno de los principales desafíos en la ingeniería de tejidos cardíacos incluye el desarrollo de una red vascular jerárquica dentro del tejido cardíaco bioingeniero, ya que cualquier tejido de más de 200 m de diámetro desarrolla la muerte celular a mediados de2,10. Una red vascular correctamente formada en un tejido cardíaco humano desempeña un papel importante en el suministro de sangre, oxígeno y nutrientes a las células cardíacas11. Durante el desarrollo embrionario, se forman capilares y arterias coronarias a través de vasculogénesis (formación de vasos sanguíneos de novo) y angiogénesis (generación de vasos sanguíneos a partir de los preexistentes) a partir de células progenitoras endoteliales8,12. Los fibroblastos cardíacos también desempeñan un papel importante en la formación adecuada de la red vascular al proporcionar la matriz extracelular óptima (ECM) y la composición de crecimiento13,14.
La red vascular 3D de tejidos cardíacos bioingenieros controla la supervivencia y la función celular mediante la creación de gradientes de oxígeno y nutrientes y señalización paracrina, tales como interacción celular homotípica, interacción celular heterotípica, interacción de células a través de proteínas solubles secretadas y de células a interacciones ECM3,10,15,16,17,18. Esto previene la muerte celular en el centro del tejido y promueve la viabilidad celular y la función fisiológica en los tejidos cardíacos bioingenieros16,18,19.
Los cultivos esferoides a partir de células madre han sido explorados recientemente como modelos in vitro del corazón humano20. Para mejorar aún más el microambiente cardíaco in vitro, han incluido el uso de todos los tipos de células principales que se encuentran en el corazón humano, como miocitos cardíacos, células endoteliales y fibroblastos. Los cultivos de esferoides presentan el soporte estructural 3D necesario para que las células crezcan y funcionen y se pueden utilizar para bioingeniero una red vascular14,20,21,22. En este contexto, nuestro laboratorio ha desarrollado esferoides cardíacos humanos (CS) mediante el co-cultivo de miocitos cardíacos, células endoteliales y fibroblastos en proporciones que se encuentran en el corazón humano14. Este modelo es una expansión del modelo de esferoides de células cardíacas ventriculares de rata, generado por el co-cultivo de células cardíacas en cultivos colgantes de gota, utilizado para modelar la fibrosis cardíaca21. Las CS humanas se pueden utilizar como ensayos de toxicidad tratándolos doxorubicina (DOX, un agente contra el cáncer utilizado para tratar la leucemia, el linfoma y el cáncer de mama), que es bien conocido por inducir fibrosis cardíaca e insuficiencia cardíaca (HF) incluso 17 años después de su somministración14.
En este manuscrito, describimos cómo generar CS humanas co-cultivando células madre derivadas de células madre inducidas por humanos (hiPSC-CM o iCM), fibroblastos cardíacos humanos (HCF) y células endoteliales de arterias coronarias humanas (HCAEC) en cultivos colgantes. Con el fin de utilizar e imagen CSs para pruebas in vitro, se incrustan en un gel de colágeno. El análisis confocal de las CS teñidas con anticuerpos contra CD31, un marcador de células endoteliales, mostró que estas células forman una red similar a la observada in vivo. Para inducir la IC y potencialmente probar agentes novedosos que pueden tratarla o prevenirla, se trataron CS con 10 m DOX (una concentración que se encuentra en el torrente sanguíneo de los pacientes con cáncer que reciben el medicamento). Cuando se tiñen con calceína-AM y ethidium homodimer (mancha de células vivas y muertas, respectivamente), las CS tratadas con DOX presentan una disminución significativa en la viabilidad en comparación con las CS que no recibieron el medicamento. Las CS también presentan una actividad contráctil homogénea cuando se aceleran utilizando la estimulación potencial de campo entre 1 y 3 Hz.

<table><tbody><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1933</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-ratón Anticuerpos secundarios</td><td>Jackson Immunological Research Labs, Inc.</td><td>715-165-150</td><td>Cianina Anticuerpo secundario conjugado con Cy3</td></tr><tr><td>Clorhidrato de doxorrubicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1515</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-1MG</td><td>de plasma bovino</td></tr><tr><td>Fibroblastos cardíacos humanos (HCF)</td><td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, EE. UU.</td><td>306AK-05a</td><td>5x10^5 Células (adultas), medianas y Reactivos de subcultivo</td></tr><tr><td>Células endoteliales de la arteria coronaria humana (HCAEC)</td><td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, EE. UU.</td><td>300K-05a</td><td>5x10^5 Células (adultas), medianas y Reactivos de subcultivo</td></tr><tr><td>Cardiomiocitos derivados de iPSC (iCM) humanosFujifilm</td> <td>Cellular Dynamics, Inc.</td><td>R1057</td><td>Kit de cardiomiocitos iCell, 01434</td></tr><tr><td>HCF Medio de crecimiento</td><td>Cell Applications, Inc., San Diego, CA, EE. UU</td><td>. 316-500</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento celular MesoEndo humano</td><td>Cell Applications Cell Applications, Inc., San Diego, CA, EE. UU</td><td>. 212-500</td><td></td></tr><tr><td>VIVO/MUERTO Kit de viabilidad/citotoxicidad</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU</td>. <td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Medio de mantenimiento (iCells)</td><td>Fujifilm Cellular Dinámica, Inc.</td><td>R1057</td><td>Kit de cardiomiocitos iCell, 01434</td></tr><tr><td>Ratón Monoclonal anti-humano CD31/PECAM</td><td>BD Pharmingen, San Diego, CA, EE. UU</td><td>. 566177</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo NucBlue Live ReadyProbe (Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU</td>. <td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Medio de recubrimiento (iCells)</td><td>Fujifilm Cellular Dynamics, Inc.</td><td>R1057</td><td>Kit de Cardiomiocitos iCell, 01434</td></tr><tr><td>Cola de Rata Colágeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Azida de Sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin&ndash; EDTA, 0,25 %</td><td>Gibco, Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano, 0,4 %</td><td>Gibco, Thermofisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo de tejidos (T25)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos Fondo plano transparente Polipoestireno negro Tratado con TC Microplacas Corning</td><td>, Nueva York, USA</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Placa colgante de 384 pocillos</td><td>3D Biomatrix, Ann Arbor, MI, EE. UU</td>. <td>HDP1385</td><td></td></tr></tbody></table>

esferoides cardíacos como tejidos cardíacos bioingeniería in vitro para estudiar la fisiopatología cardíaca humana

Cardiac Spheroids as in vitro Bioengineered Heart Tissues to Study Human Heart Pathophysiology

A pesar de varios avances en la ingeniería de tejidos cardíacos, uno de los principales desafíos a superar sigue siendo la generación de una red vascular totalmente funcional que comprende varios niveles de complejidad para proporcionar oxígeno y nutrientes dentro de los tejidos cardíacos bioingenieros. Nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo in vitro tridimensional del corazón humano, conocido como el "esferoide cardíaco" o "CS". Esto presenta características bioquímicas, fisiológicas y farmacológicas típicas del corazón humano y se genera mediante el co-cultivo de sus tres tipos de células principales, tales como miocitos cardíacos, células endoteliales y fibroblastos. Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC-CMs o iCM) se co-cultivan en proporciones que se aproximan a las que se encuentran in vivo con fibroblastos cardíacos humanos (HCF) y células endoteliales de arterias coronarias humanas (HCAEC) en placas de cultivo de gota colgante durante tres a cuatro días. El análisis confocal de las CCS manchadas con anticuerpos contra la troponina T, CD31 y vimentina cardíaca (marcadores para miocitos cardíacos, células endoteliales y fibroblastos, respectivamente) muestra que las CS presentan una compleja red celular endotelial, que se asemeja a la nativa que se encuentra en el corazón humano. Esto se confirma mediante el análisis de renderizado 3D de estas imágenes confocales. Las CS también presentan proteínas de matriz extracelular (ECM) típicas del corazón humano, como colágeno tipo IV, laminin y fibronectina. Por último, las CS presentan una actividad contráctil medida como contractilidad sincitial más cercana a la típica del corazón humano en comparación con las CS que contienen solo iCM. Cuando se trata con un agente cardiotóxico contra el cáncer, como la doxorubicina (DOX, utilizado para tratar la leucemia, el linfoma y el cáncer de mama), la viabilidad de los CS tratados con DOX se reduce significativamente a 10 M de inhibición genética y química de óxido nítrico endotelial sintasa, un objetivo aguas abajo de DOX en HCF y HCAEC, redujo su toxicidad en las EC. Dadas estas características únicas, los CS se utilizan actualmente como modelos in vitro para estudiar la bioquímica cardíaca, la fisiopatología y la farmacología.

El protocolo descrito en este manuscrito representa un enfoque alternativo para desarrollar una red compleja de células endoteliales cardíacas dentro de un tejido cardíaco bioingeniero con una mejor viabilidad celular y función en comparación con los modelos existentes (Figura 1). La recapitulación del microambiente cardíaco in vivo 3D dentro de las CS promovió su respuesta al DOX a la concentración que se encuentra en el torrente sanguíneo de los pacientes con cáncer (entre 5 y 10 M, Figura 2). Las CS tratadas con DOX presentaron una reducción estadísticamente significativa en la viabilidad celular en comparación con los CS de control (sin DOX) dentro de las 24 h(Figura 2),un efecto tóxico que se observa en pacientes con cáncer humano incluso 17 años después de su tratamiento con el medicamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61962/61962fig01.jpg"> Figura 1. Formación CS y Análisis de Vascularización. (A) Protocolo que muestra los pasos para la formación de una ESTRATEGIA a partir de la cocultura de iCM, HCAEC y HCF en gotas colgantes. Las imágenes de Brightfield en el lado derecho muestran la formación progresiva de esferoides a partir de células individuales en gotas colgantes. (B) Acumulaciones Z colapsadas de imágenes confocales de una EP manchada con anticuerpos contra la troponina cardiaca T (cTNT), PECAM y vimentina, tinción de miocitos cardíacos, células endoteliales y fibroblastos, respectivamente. Esta cifra ha sido modificada de14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61962/61962fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61962/61962fig02.jpg"> Figura 2. Viabilidad y toxicidad en CS. Análisis estadísticos de la fluorescencia de calceína-AM (A) y homodimero de etidium (B) de CS tratados en presencia de cualquiera de los medios solamente (DOX 0-M) o doxorubicina (10 oM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61962/61962fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo tiene como objetivo fabricar esferoides cardíacos 3D (CS) mediante el co-cultivo de células en gotas colgantes. Los CS incrustados en colágeno se tratan con doxorubicina (DOX, un agente cardiotóxico) a concentraciones fisiológicas para modelar la insuficiencia cardíaca. Las pruebas in vitro con CS tratadas con DOX se pueden utilizar para identificar nuevas terapias para pacientes con insuficiencia cardíaca.

Esferoides cardíacos como tejidos cardíacos bioingeniería in vitro para estudiar la fisiopatología cardíaca humana

Despite several advances in cardiac tissue engineering, one of the major challenges to overcome remains the generation of a fully functional vascular ...

Uno de los principales desafíos en la ingeniería de un tejido cardíaco humano incluye su vascularización. Nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo in vitro del corazón humano mediante el co-cultivo de células encontradas in vivo. Estos incluyen miocitos cardíacos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales cardíacas.En conjunto, estas células permiten la recapitulación del microambiente cardíaco humano, incluyendo sus componentes moleculares, celulares y celulares adicionales. Los usamos en nuestro laboratorio para probar diferentes fármacos en busca de ensayos de toxicidad de fármacos. Estos incluyen doxorubicina, un conocido fármaco cardiotóxico que afecta a los corazones humanos incluso años después de su tratamiento.Cultivamos fibroblastos cardíacos, células endoteliales y miocitos por separado antes de formar esferoides. Con el fin de crecer cardiomiocitos, recogemos el vial de menos 80 grados y lo calentamos a 37 grados durante cuatro minutos en un baño de agua. Luego rociamos el vial de crio con 70% de etanol y lo trasladamos a un gabinete de biosemaseidad.Recogemos suavemente la suspensión celular y la transferimos a un tubo Falcon de 15 mililitros. Recogemos un mililitro de medio de chapado precing, enjuagamos el vial de crio una vez y luego lo añadimos al tubo Falcon de 50 mililitros, una gota a la vez cada cuatro segundos. Mientras añade el medio de chapado, agite suavemente el tubo Falcon.Con una pipeta de celda, recoja siete mililitros de medio de chapado y agréguelo suavemente al tubo Falcon de 15 mililitros. Una vez añadido el volumen final del medio de chapado al tubo Falcon, transfiera la suspensión celular a los matraces de tejido codificado con fibronectina. Finalmente, mueva las células a una incubadora.Después de dos días, recogemos los matraces de tejido de la incubadora y comprobamos la confluencia celular bajo el microscopio. En este punto, movemos el matraz a un armario de biosemase y retiramos el medio de chapado. Enjuagamos suavemente las células con el mismo medio de chapado del matraz tisular cuatro o cinco veces.Lo reemplazamos por un nuevo medio de mantenimiento y los trasladamos a una incubadora durante uno o dos días adicionales. El día que creamos colgantes de cultivos, recogemos los tres tipos de células de la incubadora. Nos astillamos en las células quitando los medios.Los enjuagamos con tres mililitros de PBS. Y finalmente añadimos los chips a las celdas. Los frascos se trasladan a una incubadora y se incuban durante un máximo de cinco minutos.Con el fin de generar esferoides cardíacos, co-cultivamos 20.000 células por gota colgante. Estos incluyen 10.000 cardiomiocitos, mil fibroblastos cardíacos y 5.000 células interiores cardíacas. Estos son co-cultivados en gota colgante 384 placas de pozo.Están chapados usando nuestro sistema de manipulación de líquidos. También añadimos PBS en las paredes laterales de las placas colgantes para evitar que los cultivos se sequen en la incubadora. Mueva cuidadosamente la placa colgante que contiene las células a la incubadora.Entre tres y cuatro días, se formará esferoide. Recogemos la placa colgante de la incubadora y comprobamos que los esferoides se están formando dentro de cada pozo. Como se muestra en estas imágenes, tenemos un conjunto de esferoides dentro del centro de cada pozo.Una vez formados, recogemos esferoides y los incrustamos en geles de colágeno. Una punta de pipeta se corta en el interior para evitar daños en el esferoide. Los esferoides se recogen y se transfieren a un tubo Falcon de 50 mililitros donde se juntan.Giramos hacia abajo la suspensión del esferoide a 300 G durante cinco minutos para separarlos del medio. Utilizamos placas de 96 pozos de paredes oscuras para imaginar los esferoides, el medio se retira o se reemplaza con un gel de colágeno en un tubo Falcon. El hidróxido de sodio se añade a la suspensión de gel esferoide antes de que estén chapados en la placa de pared oscura.100 microlitro de suspensión de esferoides se añade en cada pozo y se incuba durante 30 minutos a 37 grados. Los medicamentos, incluyendo doxorubicina y otros agentes, se añaden a la placa esferoides y se incuban durante 24 horas. Al día siguiente, preparamos una solución que contiene calcio AM y e-tidio homodimer, etiquetado vivo bajo las células respectivamente.Esta solución se prepara en la adición de la moneda de diez centavos a esta placa de filtro. Los esferoides se incuban a 37 grados durante una hora. Utilizamos un lector de placas para medir la fluorescencia del calcio AM y su homodimero de etidium en la placa.Estas mediciones son utilizadas por nuestro software para realizar un análisis estadístico. Medimos la actividad contráctil de los esferoides tratados con los diferentes fármacos utilizando un sistema óptico iónico. Los esferoides se mueven al escenario entre dos electrodos.Esto permite controlar y medir la actividad contráctil por potencial de campo. De esta manera, podemos probar diferentes voltajes y rangos de frecuencia para estimular los esferoides. Un esferoide en ese momento se valora y se utiliza para esas mediciones.Los esferoides que no recibieron doxorubicina podrán construir después de la estimulación eléctrica. Por el contrario, los esferoides tratados con doxorubicina no se contraen. Para visualizar el formulario de red celular endotelial dentro de cada esferoide, los arreglamos con una solución de 4%paraformaldehído durante una hora a temperatura ambiente.Trasladamos la placa a una coctelera que permite la suave permeación de la solución a través del gel. El PFA se retira y enjuaga tres veces con una solución de PBS que contiene 0,01%óxido de sodio. Trajimos la movilización, por supuesto, añadiendo una solución del 0,02% de Tritón X en PVSA durante 20 minutos a temperatura ambiente.La solución de bloqueo contiene 3%BSA en PBC, que luego se añade a la placa durante una hora a temperatura ambiente. Una solución que contiene el anticuerpo primario contra el CD 31. Se añade un marcador para el endotelial a la placa que luego se incuba durante la noche a cuatro grados.Al día siguiente, se elimina la solución de anticuerpos primarios y la placa se enjuaga tres veces con una solución de PBS que contiene 0,01% de óxido de sodio. La solución de anticuerpos secundaria que contiene también la mancha hexagonal se añade a la placa que luego se incuba durante la noche a cuatro grados. Finalmente, se elimina la segunda solución de anticuerpos y la placa se enjuaga tres veces con una solución PBS que contiene 0,01% de óxido de sodio.Después de permanecer con anticuerpos primarios y secundarios, la placa se puede utilizar con nuestro microscopio confocal. Una red vascular adecuada es fundamental para la supervivencia y la función de las células cardíacas. Los esferoides cardíacos presentan una red celular endotelial que recapitula mejor la presente en el corazón humano en comparación con los cultivos monocapa de células cardíacas.Dadas las características únicas, los esferoides cardíacos representan herramientas avanzadas para pruebas in vitro para la investigación cardiovascular.

cardiac-spheroids-as-vitro-bioengineered-heart-tissues-to-study-human

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este manuscrito describe la creación de tejidos cardíacos de ingeniería definidos utilizando la expresión de marcadores de superficie y la clasificación de células. Los tejidos definidos se pueden utilizar en un biorreactor multitejido para investigar los mecanismos de la terapia celular cardíaca con el fin de proporcionar un sistema modelo funcional, pero controlado, del corazón humano.

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Este protocolo describe el procedimiento para secimiento y cultivo de rebanadas cardíacas humanas para pruebas de fármacos preclínicos y detalla el uso de mapeo óptico para registrar el voltaje transmembrano y las señales de calcio intracelular simultáneamente a partir de estas rebanadas.

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Aquí, describimos una metodología fácil de usar para generar matrices de microtejidos cardíacos autoensamblados en 3D compuestos por cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes prediferenciadas inducidas por humanos, fibroblastos cardíacos y células endoteliales. Esta técnica fácil de usar y de baja capacidad de células para generar microtejidos cardíacos se puede implementar para el modelado de enfermedades y las primeras etapas del desarrollo de fármacos.

Fabricación de matrices de microtejidos cardíacos 3D utilizando cardiomiocitos humanos derivados de iPSC, fibroblastos cardíacos y células endoteliales

El objetivo de este protocolo es explicar y demostrar el desarrollo de un modelo microfluídico tridimensional (3D) de tejido cardíaco humano altamente alineado, compuesto por cardiomiocitos derivados de células madre co-cultivados con fibroblastos cardíacos (CF) dentro de un hidrogel biomimético a base de colágeno, para aplicaciones en ingeniería de tejido cardíaco, detección de fármacos y modelado de enfermedades.

Desarrollo de tejido cardíaco humano organizado en 3D dentro de una plataforma microfluídica

Aquí, describimos un protocolo para crear organoides cardíacos humanos (hHO) relevantes para el desarrollo de manera eficiente utilizando células madre pluripotentes humanas por autoorganización. El protocolo se basa en la activación secuencial de señales de desarrollo y produce tejidos cardíacos humanos altamente complejos y funcionalmente relevantes.

Generación de organoides del corazón humano autoensamblables derivados de células madre pluripotentes

Aquí se presenta un conjunto de protocolos para la generación y criopreservación de esferoides cardíacos (CS) a partir de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos cultivados en un formato multidimensional de alto rendimiento. Este modelo tridimensional funciona como una plataforma robusta para el modelado de enfermedades, exámenes de detección de alto rendimiento y mantiene su funcionalidad después de la criopreservación.

Generación, detección de alto rendimiento y biobancos de esferoides cardíacos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

Los tejidos cardíacos tridimensionales biodiseñados con cardiomiocitos derivados de células madre han surgido como modelos prometedores para estudiar el miocardio humano sano y enfermo in vitro , al tiempo que recapitulan aspectos clave del nicho cardíaco nativo. Este manuscrito describe un protocolo para la fabricación y el análisis de tejidos cardíacos de ingeniería de alto contenido generados a partir de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas.

Diseño de un biorreactor para mejorar la adquisición de datos y el rendimiento del modelo de tejidos cardíacos diseñados

Los organoides cardíacos humanos autoensamblantes (hCOs) son un sistema emergente para modelar el desarrollo y las enfermedades cardíacas humanas. Aquí se proporciona una metodología para generar y dañar hCOs mediante hipoxia-reoxigenación y detalles de los resultados histológicos y funcionales esperados tras la lesión.

Un modelo de lesión por hipoxia-reoxigenación en cardioides humanos autoensamblantes

En este artículo se describen los procedimientos básicos para la realización de experimentos ópticos de asignación en el corazón de conejo Langendorff perfundidos con el sistema de imágenes panorámicas, y el doble (voltaje y calcio) modalidad de imagen.

Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos

Aprende a fabricar esferoides cardíacos tridimensionales mediante co-cultivo de miocitos, fibroblastos y células endoteliales en gotas colgantes. Este modelo in vitro permite estudiar la cardiotoxicidad de doxorrubicina y evaluar terapias potenciales para la insuficiencia cardíaca humana.

Esferoides cardíacos como tejidos cardíacos bioingeniería in vitro para estudiar la fisiopatología cardíaca humana

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