Aislamiento de miocitos aurículas y ventriculares murinas de alta calidad para mediciones simultáneas de transitorios de Ca2+ y corriente de calcio tipo L

Los experimentos de pinza de parche e imágenes de calcio requieren mucha mano de obra, requieren mucho tiempo y son desafiantes. Este protocolo proporciona un método conveniente para aislar cardiomiocitos auriculares y ventriculares murinos de alta calidad, adecuado para experimentos de pinza de parche y pruebas de calcio realizadas simultáneamente. La principal ventaja de este protocolo es que podemos obtener cardiomiocitos auriculares y ventriculares del mismo animal.

El aislamiento de los cardiomiocitos auriculares murinos es especialmente difícil y ha sido un factor limitante para experimentos anteriores. Comience por llenar previamente el aparato de Langendorff con tampón de perfusión y asegurarse de que esté libre de aire. Fije una cánula aórtica bajo el microscopio de disección y conéctela con una jeringa de un mililitro llena de tampón de perfusión.

Después de extraer el corazón del ratón sacrificado, coloque el corazón en un tampón de perfusión a temperatura ambiente y canula la aorta con una aguja roma bajo el microscopio lo más rápido posible. Ate firmemente el corazón a la aguja con un trozo de seda suturadora y desconecte la jeringa. Después de la canulación aórtica, conecte inmediatamente el corazón canulado al aparato de Langendorff, evitando que entre aire en el sistema.

Perfundir el corazón con tampón de perfusión durante un minuto a exactamente 37 grados centígrados y una tasa de perfusión de cuatro mililitros por minuto. Cambie de tampón de perfusión a tampón de digestión y perfunda durante exactamente nueve minutos a una temperatura de 37 grados centígrados y una tasa de perfusión de cuatro mililitros por minuto. Cuando termine, transfiera el corazón digerido a una placa de Petri con suficiente tampón de digestión para mantenerlo completamente cubierto.

A continuación, diseccione cuidadosamente las aurículas y los ventrículos bajo el microscopio. Transfiera las aurículas a una placa de Petri con 1,5 mililitros de tampón de digestión y los ventrículos a otra placa de Petri con tres mililitros de tampón de digestión. Separe las aurículas en pedazos pequeños con cuidado, pero rápidamente, con pinzas romas.

Disuelva el tejido pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con una punta de pipeta de 1000 microlitros que se cortó previamente para ensanchar la abertura de la punta. Transfiera la solución a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y agregue una cantidad equivalente de tampón de parada pipeteando el costado del tubo. Pase los tres mililitros de la solución a través de una malla de nailon de 200 micrómetros para eliminar los trozos de tejido más grandes restantes que no se hayan digerido por completo.

Para realizar la disección ventricular, corte el tejido ventricular en pedazos pequeños con tijeras o pinzas de disección, y pipetee hacia arriba y hacia abajo con otra punta de pipeta de 1000 microlitros para disolver. Transfiera la solución de célula y tejido a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y agregue una cantidad equivalente de tampón de parada pipeteándolo cuidadosamente por el costado del tubo para finalizar la reacción. Pase los seis mililitros de solución de células y tejidos a través de una malla de nailon de 200 micrómetros para eliminar los trozos más grandes que no se hayan digerido por completo.

Deje las suspensiones de células auriculares y ventriculares en el banco a temperatura ambiente durante seis minutos para que se asienten. A continuación, centrifuga los tubos a 5G durante dos minutos. Deseche los sobrenadantes con una pipeta Pasteur de plástico y vuelva a suspender cuidadosamente los gránulos celulares en 10 mililitros de solución Tyrode sin calcio.

Deje las células auriculares y ventriculares durante ocho minutos para la sedimentación. Centrifugar las células auriculares a 5G durante un minuto. A continuación, deseche los sobrenadantes de ambas muestras celulares y vuelva a suspender cuidadosamente los gránulos en 10 mililitros de solución de Tyrode con 100 micromolares de calcio.

Deje las células durante ocho minutos para la sedimentación, luego repita la centrifugación de las células auriculares. Deseche los sobrenadantes y vuelva a suspender cuidadosamente los gránulos celulares en 10 mililitros de solución de Tyrode con 400 micromolares de calcio. Repita este proceso una vez más, resuspendiendo las células en la solución de Tyrode con un milimolar de calcio.

Todas las células auriculares son pequeñas, con capacitancias que oscilan entre aproximadamente 35 y 100 picofaradios. Aquí se muestra una célula típica del miocardio que funciona en la auricular. Los miocitos ventriculares tienen más forma de bastón y son más grandes, con capacitancias celulares que oscilan entre 100 y alrededor de 400 picofaradios.

Aquí se muestran ejemplos de mediciones de corriente de calcio tipo L con transitorios citosólicos simultáneos de calcio de un miocito auricular y un miocito ventricular. Antes de intentar esta técnica, asegúrate de practicar la sustracción de órganos. Es crucial que el paso se realice rápidamente y que todos los cortes de tejido se realicen en los lugares correctos.

Cuando la extracción de órganos se realiza con una calidad reproducible, tómese un tiempo para perfeccionar la canulación. Las celdas aisladas con este protocolo son adecuadas para mediciones de pinza de parche. Además, se pueden cargar con tintes fluorescentes, lo que permite una amplia gama de experimentos de imagen.