Name: Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprende a investigar infecciones urinarias recurrentes por E. coli en ratones usando un modelo que expone la vejiga a Gardnerella vaginalis. Este método permite estudiar la dinámica bacteriana y el desarrollo de reservorios intracelulares.

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Los autores agradecen a Lynne Foster por la asistencia técnica en experimentos de infección, a James Fitzpatrick en el Centro de Imágenes Celulares de la Universidad de Washington (WUCCI) por el acceso al SEM, a Scott Hultgren por la cepa UTI89kanR UPEC y a David Hunstad por la lectura crítica del manuscrito.
Este trabajo fue apoyado por la National Science Foundation (Graduate Research Fellowship to VPO#DGE - 1143954), por el Center for Women's Infectious Disease Research de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington (Pilot Research Award to NMG), por la American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) and #14POST20020011 (NMG), y por los Institutos Nacionales de Salud, NIAID: R01 AI114635 (ALL) y NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, proyecto II PI:ALL) y K01 DK110225-01A1 (NMG). Algunos de los estudios en animales se realizaron en una instalación apoyada por la subvención C06 RR015502 del NCRR. El Centro de Imágenes Celulares de la Universidad de Washington (WUCCI; donde se realizó SEM) y MSJ fueron apoyados por la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington, el Instituto de Descubrimiento De Niños de la Universidad de Washington y el Hospital de Niños de St. Louis (CDI-CORE-2015-505), la Fundación para el Hospital Barnes-Jewish (3770) y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NS086741). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses relacionados con este estudio.

El primer paso crítico en este modelo para identificar ratones que no han eliminado la bacteriuria UPEC durante la fase primaria de ITU. Estos ratones deben ser retirados del experimento, ya que de lo contrario confundirían las tasas de bacteriuria UPEC después de la exposición a G. vaginalis. Después de la inoculación inicial de UPEC, la orina debe recolectarse semanalmente para monitorear el aclaramiento bacteriano. Aproximadamente el 65-80% de los ratones C57BL / 6 eliminarán una infección por UTI89kanR dentro de las 4 semanas. Otras cepas de ratones endogámicos tienen diferentes propensiones para el aclaramiento de UPEC42,43 y la formación de reservorios y, por lo tanto, pueden no ser adecuadas para este modelo. El segundo punto crítico es que los estudios empíricos han determinado que dos inoculaciones secuenciales de G. vaginalis (ya sea a 12 h o 1 semana de distancia) son necesarias para desencadenar una aparición significativa de reservorios por encima de la emergencia espontánea de fondo que ocurre en ratones de control expuestos solo a PBS. No se han probado otras duraciones de tiempo entre las dos exposiciones secuenciales, pero podrían arrojar resultados similares. Es importante tener en cuenta que solo se observó una reducción en los títulos de vejiga de UPEC en el modelo en el que las exposiciones a G. vaginalis se administraron a 1 semana de diferencia39. Si bien se pueden administrar más de dos exposiciones, la evidencia empírica sugiere que el cateterismo repetido por sí solo aumenta la emergencia, lo que puede confundir la interpretación de los resultados o requerir un mayor número de animales para distinguir las diferencias entre los grupos de exposición y los controles. Finalmente, el método de fijación de la vejiga in situ tiene varios pasos críticos. Se requiere cierta habilidad para garantizar que el fijador permanezca dentro de las vejigas sujetas. Las vejigas desinfladas serán más difíciles de visualizar por SEM. También es esencial ser muy suave al inocular el fijador en la vejiga, ya que raspar el urotelio con el catéter que contiene fijador puede inducir la exfoliación urotelial independientemente de lo que desencadena G. vaginalis. Todas las concentraciones mencionadas en el cóctel fijador son concentraciones finales. Las proporciones inadecuadas de estos pueden resultar en una fijación insuficiente e hinchazón o contracción de las células. Los fijadores deben calentarse a temperaturas fisiológicas para evitar el choque de temperatura en las células y los tejidos. El calentamiento también proporciona una ligera mejora en la tasa de difusión de los fijadores a través de las membranas plasmáticas. Si bien la tinción de osmio a menudo se puede omitir para muestras preparadas para el análisis SEM, es un paso esencial en este protocolo para estabilizar los lípidos y prevenir el agrietamiento de las membranas celulares durante el secado en puntos críticos.
Este protocolo puede modificarse para probar otras cepas UPEC y/o G. vaginalis por su capacidad para formar reservorios y desencadenar su aparición, respectivamente. También se pueden agregar otros factores experimentales, como la exposición a otras bacterias vaginales (por ejemplo, Lactobacillus crispatus PVAS100) o G. vaginalis muerta por calor, ninguno de los cuales demuestra patología en este modelo39. Al seleccionar otras cepas bacterianas para probar, es importante demostrar un crecimiento consistente de tal manera que se pueda usar una concentración estándar de inóculo en todos los experimentos. El crecimiento de JCP8151BSmR se ha optimizado en una cámara anaeróbica. Esta cepa probablemente podría cultivarse en un sistema gaspak anaeróbico, pero esto requeriría optimización para garantizar un crecimiento bacteriano robusto. Finalmente, puede ser posible modificar el tiempo de ciertos pasos en el modelo. Por ejemplo, la orina se puede recolectar en puntos de tiempo más tempranos durante la fase de formación del reservorio DE UPEC para monitorear las respuestas de la UFC o del huésped. En este modelo no se ha observado un efecto adverso de la recolección de muestras de orina en puntos de tiempo tempranos (3, 6, 12 hpi) sobre la progresión de la infección o el establecimiento de reservorios. Se ha informado que la aparición de reservorios de UPEC ocurre después de dos dosis de JCP8151BSmR administradas a 12 h o 1 semana, pero aún no se han probado otros intervalos de tiempo. También puede ser posible reducir la duración total del modelo reduciendo la fase de formación del reservorio UPEC a 2 semanas (en lugar de 4 semanas), ya que muchos de los ratones eliminan la bacteriuria en este momento. Estudios previos que examinaron la aparición de UPEC después de la exposición de la vejiga a exfoliantes químicos utilizaron una fase17,18 de formación de reservorios de UPEC de 1 o 2 semanas. Sin embargo, la disminución de la cantidad de tiempo para la eliminación de la bacteriuria UPEC puede tener el costo de requerir que más animales sean sacrificados del experimento. Finalmente, el análisis SEM de la vejiga se puede realizar en puntos de tiempo adicionales para observar la duración del efecto de G. vaginalis en el urotelio.
Con respecto a la solución de problemas, hay algunas consideraciones importantes específicamente con respecto al análisis SEM de la vejiga. Dependiendo del fondo de ratón utilizado y la cantidad de inflamación presente, algunas vejigas se presentarán con paredes muy delgadas. Estas vejigas tienden a curvarse más durante el secado de puntos críticos y pueden dar lugar a una forma de concha de cowrie. Si esto ocurre, el mejor método es cortar la vejiga en forma de concha por la mitad a lo largo de la interfaz rizada y luego una segunda vez para eliminar la mayor parte del tejido colgante. El corte funciona mejor con una cuchilla de afeitar de doble filo recubierta de PTFE. El exceso de grasa a veces puede solubilizarse durante los pasos de tinción de osmio. Esto puede resultar en gotas de grasa insolubles no deseadas que pueden no lavarse durante los pasos de enjuague y deshidratación y que pueden asentarse en la superficie de la vejiga durante el secado posterior. Estas gotas pueden aparecer como pequeñas esferas o estructuras en forma de disco dispersas sobre la muestra (Figura 4D). Esto se puede mitigar asegurando que se elimine la mayor cantidad posible de tejido adiposo de alrededor de la vejiga. El platino puede ser sustituido por el recubrimiento de iridio, pero los espesores deben mantenerse al mínimo para reducir el enmascaramiento de los detalles estructurales finos. El uso de una etapa giratoria durante el recubrimiento es muy recomendable.
Una limitación de este modelo es que requiere un gran número de ratones. Solo el 65-80% de los ratones C57BL/6 eliminarán su bacteriuria UPEC y serán adecuados para la posterior inoculación de G. vaginalis o PBS (ver Figura 2C). Para obtener 10-12 ratones por grupo (inoculación de G. vaginalis vs. PBS), ~ 30 ratones deben estar infectados inicialmente con UPEC. Además, es probable que se requieran múltiples experimentos para lograr las réplicas biológicas necesarias para detectar la significación estadística. Cuando las exposiciones se administraron a 1 semana de diferencia, la emergencia de UPEC ocurrió en el 14% de los ratones expuestos a PBS (Figura 3B). Por lo tanto, la detección de un aumento significativo en upEC rUTI en ratones expuestos a G. vaginalis en relación con los controles de PBS (con una potencia de 0,8; alfa = 0,05 [un lado]) requiere probar un total acumulativo de al menos 40 ratones para cada grupo de exposición. Una consideración adicional es que estos experimentos son costosos y requieren mucha mano de obra. Los ratones deben ser monitoreados semanalmente para el aclaramiento de UPEC y el curso de tiempo experimental es de 4-5 semanas, dependiendo de si G. vaginalis se administra dos veces en un período de tiempo de 12 h o dos veces a 1 semana de distancia. SEM requiere mucha mano de obra y puede ser costoso, dependiendo de la disponibilidad del microscopio y los cargos por servicio. Preparar toda la vejiga para SEM proporciona abundante material para el análisis, pero el inconveniente es que analizar cada vejiga puede llevar mucho tiempo. Por lo tanto, es probable que solo un número limitado de vejigas pueda ser analizado por SEM en comparación con el mayor número de animales utilizados para los títulos de orina y tejido. Además, la obtención de imágenes de alta calidad de las superficies curvas de las "copas" de la vejiga requiere habilidad debido a las sombras que pueden impedir la visibilidad. Aunque el SEM de la vejiga es una herramienta útil para visualizar la exfoliación urotelial, este método es en gran medida cualitativo. Debido a que la muestra se fija en forma redonda, y debido al uso de glutaraldehído en el fijador, no es posible detectar bacterias que expresan fluorescentemente a través de microscopía de luz. La inmunotinción y los colorantes químicos son incompatibles con este proceso debido al uso de glutaraldehído que entrecruzará la mayoría de los antígenos y el osmio y que enmascarará los sitios de antígenos y oscurecerá el tejido. Dicho esto, la técnica SEM es útil para parámetros que pueden evaluarse cuantitativamente sin el uso de sondas adicionales, como el tamaño celular48,49.
Este modelo ofrece varias ventajas más allá de los métodos descritos anteriormente. Permite el examen de los mecanismos de UPEC rUTI causados por la emergencia de reservorios de la vejiga, en lugar de la reintroducción en la vejiga desde una fuente externa. Otros modelos de ITU debido a la aparición de reservorios vesicales utilizan agentes químicos (sulfato de protamina o quitosano) para causar exfoliación urotelial17,18, que no sería desencadenante de RUTI en mujeres. G. vaginalis es una bacteria urogenital prevalente que se ha detectado en la orina recogida directamente de la vejiga mediante cateterismo o aspiración suprapúbica en algunas mujeres23,26. Este hecho, junto con la asociación conocida entre la VB (en la que G. vaginalis crece demasiado en la vagina) y la ITU, sugiere que G. vaginalis es un desencadenante clínicamente plausible de la ITR. Finalmente, el método de fijación de la vejiga in situ preserva la ultraestructura de la vejiga y limita el daño, asegurando que las capas de la vejiga no se separen entre sí. Los métodos anteriores para visualizar el urotelio tradicionalmente hacen que el usuario recolecte asépticamente, biseque, estire y fije la vejiga en una bandeja de disección antes de sumergir la vejiga estirada en el fijador48. Este método da como resultado una muestra muy plana, pero no garantiza un estiramiento uniforme o natural del tejido y puede dar como resultado áreas que están demasiado y por debajo del estiramiento (lo que resulta en tejido altamente arrugado) y puede causar la separación de la capa de la vejiga. Además, estas manipulaciones físicas de la vejiga para estirar y fijar el tejido pueden causar daño, incluida la exfoliación urotelial. Otro método es sumergir las vejigas intactas en fijador antes de incrustarlas en parafina y adquirir secciones delgadas con un microtomo. Las secciones delgadas son invaluables para los experimentos de inmunohistoquímica para examinar la localización de bacterias y proteínas del huésped, pero una sección delgada no permite la visualización de la superficie urotelial. Este método SEM permite examinar la superficie de toda la vejiga a la vez.
Como se describe, las aplicaciones futuras de este modelo incluyen probar otras cepas de UPEC para determinar si forman reservorios intracelulares y probar otras cepas de G. vaginalis para evaluar si provocan la exfoliación y la aparición de UPEC para causar rUTI. También se pueden probar otras cepas de ratón más allá de los ratones C57BL / 6, aunque no se recomiendan ratones con una alta propensión a desarrollar cistitis crónica (como los ratones en el fondo C3H), ya que sería necesario seleccionar demasiados ratones del experimento. Una ventaja adicional de los ratones C57BL / 6 es que muchas cepas genéticas knockout están disponibles comercialmente. Tales cepas brindan una oportunidad para interrogar los factores del huésped involucrados en la formación y / o emergencia del reservorio.

Las infecciones del tracto urinario (ITU) imponen una carga sanitaria significativa en todo el mundo, afectando la calidad de vida de millones de personas cada año, especialmente las mujeres1. La Escherichia coli uropatógena (UPEC) es la causa más frecuente de ITU1. Muchos pacientes (aproximadamente 20-30%) que desarrollan ITU experimentarán una ITU recurrente (ITU) dentro de los 6 meses a pesar de la eliminación mediada por antibióticos de la infección inicial2. Desafortunadamente, hasta el 5% de las mujeres premenopáusicas sufren de 3 o más rUTI cada año 3,4. Los episodios secuenciales de ITU pueden ser causados por la persistencia de la misma cepa UPEC del caso índice 5,6,7,8. Los datos de muestras humanas y modelos de ratón sugieren que la ITU de la misma cepa podría ser causada por UPEC que reside dentro de reservorios inactivos en la vejiga. En humanos, se detectaron UPEC en células epiteliales y biopsias vesicales de pacientes con ITU 9,10,11,12,13. Los estudios en ratones C57BL/6 han demostrado que algunas cepas de UPEC pueden establecer reservorios intracelulares quiescentes en la vejiga, detectados por microscopía de fluorescencia y por homogeneización y cultivo de tejido vesical, que se mantienen durante meses después de la resolución de la bacteriuria 14,15,16. El tratamiento de la vejiga con agentes que inducen la exfoliación del epitelio vesical (urotelio), por ejemplo, sulfato de protamina17 o quitosano18, desencadenan la aparición de UPEC de los reservorios para causar ITU. Estos datos sugieren que en las mujeres que albergan reservorios de UPEC de la vejiga de una infección previa, las exposiciones de la vejiga que conducen a la exfoliación urotelial pueden desencadenar la ITU.
Cada vez hay más pruebas de que la microbiota vaginal contribuye a la infección del tracto urinario19,20. Gardnerella vaginalis es un miembro frecuente de la microbiota vaginal y urinaria 21,22,23,24,25,26,27,28,29. En la vagina, la presencia de altos niveles de G. vaginalis se asocia con una disbiosis microbiana conocida como vaginosis bacteriana (VB), que afecta a ~ 30% de las mujeres 30,31,32. Las mujeres con VB tienen un mayor riesgo de experimentar ITU en comparación con las mujeres con una comunidad vaginal dominada por Lactobacillus 33,34,35,36,37. En modelos de ratón, G. vaginalis causa exfoliación epitelial tanto en la vagina38 como en la vejiga39. En ratones C57BL/6 que albergan reservorios de vejiga DE UPEC, dos exposiciones secuenciales de la vejiga a G. vaginalis, pero no a PBS, resultan en el resurgimiento de UPEC de reservorios para causar ITU de UPEC. La aparición se evidencia por la aparición de títulos de UPEC en orina de ratones que habían resuelto previamente la bacteriuria de UPEC y una posterior disminución de los títulos homogeneizados de vejiga de UPEC en sacrificio en comparación con los animales de control expuestos a PBS39. Curiosamente, no hay una colonización duradera por G. vaginalis en la vejiga. En la gran mayoría de los casos, dos exposiciones cortas, cada una con menos de 12 (h) de G. vaginalis viable en la orina, son suficientes para provocar la exfoliación urotelial y promover la ITU.
Este protocolo describe un modelo de ratón de rUTI causada por UPEC que reside en reservorios de vejiga intracelular, utilizando la inoculación vesical de G. vaginalis para desencadenar la recurrencia. El avance logrado por este modelo es que G. vaginalis es un desencadenante biológico clínicamente relevante de rUTI en comparación con los agentes químicos utilizados anteriormente. Además, la supervivencia relativamente corta de G. vaginalis en el tracto urinario del ratón permite examinar el impacto de las exposiciones microbianas transitorias en el urotelio, como podría ocurrir después de la actividad sexual. Además de delinear el modelo rUTI, este protocolo también describe métodos para la citología de orina y la fijación de la vejiga in situ y la obtención de imágenes del urotelio mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).
Este protocolo de UPEC UTI recurrente inducida por G. vaginalis utiliza la cepa UPEC UTI89 que lleva un cassette de resistencia a la kanamicina (UTI89kanR)40. No todas las cepas de UPEC probadas fueron capaces de formar comunidades bacterianas intracelulares durante la etapa de infección aguda en ratones41 y aún no se sabe si todas las cepas de UPEC tienen la capacidad de formar reservorios intracelulares latentes. La formación del reservorio debe confirmarse antes del uso de otras cepas UPEC en el modelo. Este protocolo utiliza un aislado espontáneo de G. vaginalis resistente a la estreptomicina, JCP8151BSmR38. La inducción de rUTI por JCP8151BSmR requiere dos inoculaciones secuenciales de G. vaginalis , administradas con 12 h o 7 días (d) de diferencia39. Queda por determinar si otras cepas de G. vaginalis inducen o no la exfoliación y/o upec rUTI con este modelo. Es esencial usar cepas de UPEC y G. vaginalis con resistencia a los antibióticos conocida (como kanamicina o espectinomicina para UPEC y estreptomicina para G. vaginalis) porque se pueden agregar antibióticos a las placas de agar para prevenir el crecimiento de la microbiota endógena del ratón que de otro modo podría interferir con la enumeración de unidades formadoras de colonias (UFC) para monitorear la infección. Esto es especialmente importante para el cultivo de muestras de orina, porque la orina de ratón con frecuencia contiene otras bacterias que pueden crecer en exceso en las placas de cultivo sin antibióticos. El origen de estas bacterias endógenas en la orina de ratón es desconocido, pero probablemente refleja bacterias periuretrales y urogenitales recogidas durante la recolección de orina.
G. vaginalis es una bacteria anaeróbica facultativa y, por lo tanto, este protocolo describe el crecimiento de G. vaginalis JCP8151BSmR en una cámara anaeróbica. Si no se dispone de una cámara anaeróbica, se pueden utilizar otros métodos para mantener las condiciones de crecimiento anaeróbico (como una bolsa GasPak en un recipiente hermético). Alternativamente, algunas cepas de G. vaginalis (incluyendo JCP8151BSmR) crecerán en una incubadora estándar de cultivo de tejidos (5% co2). Así como el uso de cepas de G. vaginalis distintas de JCP8151BSmR requiere pruebas para garantizar que las bacterias se comporten de manera similar en este modelo, las condiciones de crecimiento cambiantes requieren la determinación empírica de duraciones ideales para el cultivo (en placas y en líquido) y la densidad óptica (OD) 600 equivalentes para lograr las concentraciones de inóculo viables deseadas. Además, no se sabe si las condiciones de crecimiento influyen en la patobiología de G. vaginalis.
Finalmente, al considerar si utilizar este modelo, los investigadores deben ser conscientes de que puede requerir un mayor número de animales por grupo que los modelos típicos de ratones UTI. Esto se debe en parte a que la inducción de rUTI requiere que los ratones resuelvan la bacteriuria UPEC causada por la infección inicial de la vejiga. Por lo tanto, cualquier ratón que no logre eliminar la bacteriuria (un fenotipo generalmente indicativo de infección renal en curso) no está incluido en la fase de ITU del protocolo. El número de ratones necesarios para impulsar estos estudios también está influenciado por la tasa de aparición "espontánea" de UPEC en la orina (12-14% en promedio). Finalmente, las diferentes cepas de ratón tienen diferentes propensiones a desarrollar bacteriuria crónica frente a la formación de reservorios intracelulares42,43. Si se utilizan cepas de ratón distintas de C57BL/6 en este modelo, debe confirmarse que los animales desarrollan reservorios intracelulares UPEC inactivos.

<table><tbody><tr><td>Agujas de 30G x 1/2</td><td>BD</td><td>305106</td><td>para catéteres</td></tr> 5 <tr><td>1/2" pinza recta hemostático</td><td>McKesson</td><td>487377</td><td>in situ fijación de vejiga</td></tr><tr><td>ACE 600 Máquina de recubrimiento por pulverización catódica</td><td>Leica</td><td>SEM Procesamiento de muestras</td>Leica <td></td></tr><tr><td>SEM Ted</td><td>Pella</td><td>16111</td><td>Procesamiento de muestras SEM</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>EMS</td><td>12340</td><td>in situ Fijación de la vejiga</td></tr><tr><td>Lengüeta adhesiva de carbono conductor&nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>16084-1</td><td>Procesamiento de muestras SEM Pintura</td></tr><tr><td>de plata conductora</td><td>Ted Pella</td><td>16034</td><td>Procesamiento de muestras</td></tr><tr><td>SEM CPD 300 Secador de puntos críticos</td><td>Leica</td><td></td><td>Procesamiento de muestras SEM</td></tr><tr><td>Pinza metálica de embudo de citomegalosión</td><td>Simport</td><td>M964B</td><td>Análisis de orina de citosinun</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>EMS</td><td>15050</td><td>Procesamiento de muestras SEM</td></tr><tr><td>Glucosa& nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>para NYCIII G. vaginalis</td></tr> medios <tr><td>de crecimiento glutaraldehído</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>in situ fijación de la vejiga</td></tr><tr><td>Hema 3 kit de tinción Hema 3</td><td>Fisher</td><td></td><td>23123869 cytospun análisis de orina</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>25-060-Cl</td><td>para NYCIII G. vaginalis</td></tr> medios de crecimiento <tr><td>iridio</td><td>Ted Pella</td><td>91120</td><td>SEM</td></tr> procesamiento de muestras <tr><td>anestesia</td><td>de ratón isofluorano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kanamicina</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>añadir a las placas selectivas UPEC LB (50 ug/mL)</td></tr><tr><td>Agar Luria-Bertani</td><td>BD</td><td>DF0445174</td><td>placas de</td></tr> <tr><td>crecimiento UPECCaldo Luria-Bertani</td><td>BD</td><td>DF0446173</td><td>UPEC sustrato</td></tr><tr><td>Merlin FE-SEM</td><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Purificador de agua Milli-Q</td><td>Millipore</td><td>IQ-7000</td><td>SEM procesamiento de muestras</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>para NYCIII G. vaginalis</td></tr><tr><td>medio de crecimiento Microscopio Olympus Vanox AHBT3</td><td>Olympus</td><td></td><td>cytospun para análisis de orina</td></tr><tr><td>tetróxido de osmio</td><td>EMS</td><td>19170</td><td>SEM procesamiento</td></tr><tr><td>de muestras paraformaldehído</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>in situ fijación de vejiga</td></tr><tr>tubo de<td>polietileno</td><td>Intramedic 427401</td><td></td><td>para catéteres</td></tr><tr><td>Proteose Peptona #3&nbsp;</td><td>Pescador&nbsp;</td><td>DF-122-17-4</td><td>para NYCIII G. vaginalis medios</td></tr><tr>de<td>crecimiento Hoja de afeitar de doble filo recubierta de PTFE</td><td>EMS</td><td>72000</td><td>vejigas de corte para SEM</td></tr><tr><td>Citocentrífuga de Shandon</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>A78300002</td><td>análisis de orina de citospun</td></tr>, filtro de <tr><td>embudo de Shandon, Simport</td><td></td><td>M965FWDV</td><td>análisis de orina de citospun</td></tr><tr><td>Shandon Doble embudo de cytoimport</td><td></td><td>M964-1D</td><td>para análisis de orina</td></tr> con <tr><td>citospun, Shandon con doble portaobjetos (recubiertos)</td><td>Thermo Scientific</td><td>5991055</td><td>para análisis de orina con citospun</td></tr>, <tr><td>cacodilato de sodio trihidrato</td><td>EMS</td><td>12310</td><td>in situ espectrofotómetro de fijación de la vejiga b</td></tr>) <tr><td></td><td>BioChrom</td><td>80-3000-45</td> de medición de la estreptomicina <td>OD600</td></tr><tr><td></td><td>bacteriana Gibco</td><td>11860038</td><td>añadir a G. vaginalis placas selectivas NYCIII (1 mg/mL)</td></tr><tr><td>tuberculina jeringa de punta deslizante</td><td>BD</td><td>309659</td><td>para catéteres</td></tr><tr><td>Extracto de levadura&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>DF0127-17-9</td><td>para medios de crecimiento NYCIII G. vaginalis</td></tr></tbody></table>

infección recurrente del tracto urinario por escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de gardnerella vaginalis en ratones

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Las infecciones recurrentes del tracto urinario (ITR) causadas por Escherichia coli uropatógena (UPEC) son comunes y costosas. Artículos anteriores que describen modelos de ITU en ratones machos y hembras han ilustrado los procedimientos para la inoculación bacteriana y la enumeración en orina y tejidos. Durante una infección inicial de la vejiga en ratones C57BL/6, la UPEC establece reservorios latentes dentro de las células epiteliales de la vejiga que persisten después de la eliminación de la bacteriuria de la UPEC. Este modelo se basa en estos estudios para examinar la ITU causada por la aparición de UPEC desde el interior de los reservorios de vejiga latente. La bacteria urogenital Gardnerella vaginalis se utiliza como desencadenante de la ITU en este modelo porque está frecuentemente presente en los tractos urogenitales de las mujeres, especialmente en el contexto de la disbiosis vaginal que se ha asociado con la ITU. Además, también se describe un método para la fijación de la vejiga in situ seguido del análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM) del tejido de la vejiga, con posible aplicación a otros estudios que involucren la vejiga.

Después de la inoculación, los títulos de UPEC son detectables en la orina (Figura 2B). La falta de placas de muestras de orina en medios selectivos que contengan kanamicina probablemente resultará en un crecimiento excesivo de la microbiota endógena del ratón que contamina la orina. El nivel de bacteriuria UPEC probablemente será alto el día 1 y puede aumentar durante la primera semana antes de disminuir en puntos de tiempo posteriores (Figura 2C). Aproximadamente el 65-80% de los ratones no tendrán UPEC detectable en la orina a 28 dpi (Figura 2C, círculo verde). Estos ratones se pueden utilizar en los pasos posteriores del modelo. Los ratones que permanecen bacteriúricos (Figura 2C, elipse roja) deben ser eliminados del experimento.
Dos exposiciones secuenciales a G. vaginalis administradas a 12 h (Figura 3A) o 1 semana de distancia (Figura 3B) dan como resultado la aparición de UPEC a partir de reservorios intracelulares para causar bacteriuria recurrente. Tanto el nivel de bacteriuria UPEC (prueba de Mann-Whitney) como la fracción de ratones que muestran UPEC rUTI (prueba exacta de Fisher) son significativamente más altos en ratones expuestos a G. vaginalis en comparación con el grupo de control de PBS. El análisis de citología de orina detecta PMN en orina de ratones expuestos a G. vaginalis que mostraron emergencia de UPEC (Figura 3C). En el modelo con dos exposiciones dadas a 1 semana de diferencia, los títulos de UPEC en el tejido de la vejiga son más bajos en ratones expuestos a G. vaginalis en comparación con PBS (Figura 3D), presumiblemente debido a la aparición de UPEC a partir de reservorios y el aclaramiento posterior.
La visualización del tejido vesical fijo in situ por SEM revela grandes células uroteliales paraguas superficiales que recubren la superficie de la vejiga en ratones de control expuestos solo a PBS (Figura 4A). La exfoliación urotelial se evidencia por una pérdida de células paraguas superficiales, revelando células epiteliales de transición subyacentes más pequeñas en ratones expuestos a G. vaginalis (Figura 4B). Temprano después de la inoculación de UPEC durante el establecimiento de reservorios intracelulares, los UPEC son visibles en el urotelio y el filamento de las células exfoliantes (Figura 4C).

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> Figura 2. Monitoreo de títulos de UPEC en orina durante la Fase 1 (formación de reservorios). (A) Esquema de recubrimiento de unidades formadoras de colonias (UFC). (B) Imagen representativa de los títulos de UPEC en orina en LB+kanamicina. Los círculos negros indican manchas de muestra de orina que deben contarse para calcular la UFC/ml. (C) Curso temporal de la bacteriuria UPEC en ratones C57BL/6. Cada línea representa un ratón individual, trazando los títulos de orina UPEC a lo largo del tiempo. La línea punteada indica el límite de detección (1000 UFC/ml). La elipse roja indica cuatro ratones (de 20) que no lograron resolver la bacteriuria UPEC y, por lo tanto, no se utilizarían para el modelo de ITU inducida por G. vaginalis. Por el contrario, el círculo verde indica ratones que resolvieron la bacteriuria UPEC y procedieron a las fases posteriores. D) Tabla de datos utilizados para generar el gráfico en el panel C. Ufc amarilla detectable; verde, sin UFC. (E) Aleatorización de ratones en grupos de exposición basados en el punto de tiempo en el que la UFC UPEC ya no se detectó en la orina ("Día resuelto"). Los números del mouse en la columna izquierda del panel D son los mismos números del mouse que se indican en el panel E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> Figura 3. G. vaginalis desencadena UPEC rUTI. Títulos de UPEC en la orina después de dos exposiciones secuenciales del tracto urinario a PBS (círculos) o G. vaginalis (Gvag; cuadrados) administradas con 12 h (A) o 1 semana (B) de diferencia. Cada símbolo representa un ratón individual. Se trazan los UPEC de UFC/ml más altos detectados en cada ratón entre 1-3 d después de la segunda exposición. Los ratones sin bacteriuria detectable se trazan en el límite de detección (línea punteada). (C) Análisis de citología de orina que muestra células UPEC (puntas de flecha) y polimorfonucleares (PMN) (flechas). Barra de escala = 20 μm. (D) Títulos de UPEC en tejidos de la vejiga recogidos 3 d después de dos exposiciones secuenciales del tracto urinario administradas a 1 semana de diferencia. Cada símbolo representa un ratón diferente y los ceros se trazan en el límite de detección (línea punteada). En A, B y D, las cajas están en el primer y tercer cuartil con la mediana marcada y los bigotes de min a max. Mann-Whitney U tests * P &lt; 0.05; ** P &lt; 0,01; P &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> Figura 4. Análisis SEM de vejigas fijadas in situ. Las vejigas se recogieron de ratones 3 h después de dos exposiciones (12 h de diferencia) a PBS (A) o G. vaginalis (C). Las líneas punteadas ilustran una sola célula epitelial urinaria, que es más pequeña en las vejigas expuestas a G. vaginalis porque las grandes células superficiales se han exfoliado revelando el epitelio de transición subyacente. (B) Vejiga recogida 6 h después de la inoculación inicial con UPEC, durante la Fase 1 del modelo, mostrando exfoliación urotelial y UPEC extracelular. (D) Ejemplo de gotas de grasa insolubles presentes en la superficie de la vejiga. Las barras de escala son de 20 μm en las imágenes principales y 2 μm en el recuadro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Se demuestra un modelo de ratón de inoculación transuretral uropatógena de E. coli (UPEC) para establecer reservorios latentes de vejiga intracelular y posterior exposición vesical a G. vaginalis para inducir itunica urinaria RECURRENTE de UPEC. También se ha demostrado la enumeración de bacterias, la citología de orina y la fijación y procesamiento de la vejiga in situ para la microscopía electrónica de barrido.

Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

Las infecciones urinarias recurrentes son un grave problema de salud. Este protocolo nos ayudará a comprender cómo las exposiciones de corta duración a las bacterias urogenitales provocan daño en la vejiga y desencadenan infecciones urinarias recurrentes por E. Coli. Una ventaja de este modelo es que la exfoliación de la vejiga y las infecciones urinarias recurrentes son desencadenadas por la bacteria urogenital Gardnerella vaginalis, que a menudo es abundante en las mujeres que experimentan infecciones urinarias recurrentes.Comience por hacer el ciclo de la cepa G. vaginalis de un caldo congelador de menos 80 grados Celsius a una cámara anaeróbica. Coloque las bacterias en una placa NYCIII sin antibióticos. Incubar la placa a 37 grados centígrados de forma anaeróbica durante 24 horas.En la cámara anaeróbica, inocule cinco mililitros de medio anaeróbico NYCIII con un circuito de un microlitro lleno de células de la placa NYCIII e incube el cultivo estáticamente a 37 grados centígrados en condiciones anaeróbicas durante 18 horas. No incluya antibióticos en el medio de crecimiento. Determine el OD600 del cultivo utilizando un espectrofotómetro.A continuación, centrifugar a 9.600 veces G durante un minuto y aspirar el medio. Vuelva a suspender el gránulo bacteriano en PBS a la concentración deseada y diluya en serie y coloque el inóculo en placas. Agregue 10 microlitros de orina a 90 microlitros de PBS en un casete de embudo con un filtro adjunto.Coloque los casetes en la citocentrífuga con una corredera y gírelos a 600 a 800 veces G durante seis minutos con alta aceleración. Después de retirar los portaobjetos y dejar que se sequen durante la noche, tiña los portaobjetos con un kit de tinción hematológica y analízalos mediante microscopía óptica para detectar la presencia de PMN y células epiteliales. Una vez que la jeringa de punta deslizante de tuberculina con fijador, coloque un catéter en el extremo, bisel orientado hacia el lado opuesto a las marcas de la jeringa.Corta el tubo sobrante a uno o dos milímetros del extremo de la aguja, teniendo cuidado de no exponer la punta de la aguja. Agite la jeringa para eliminar las burbujas y empuje el émbolo para eliminar el aire. Luego llene el catéter con fijador sobre un tubo de microcentrífuga Después de anestesiar y sacrificar al ratón, una vez que las patas estén aseguradas, abra el área pélvica del ratón con pinzas y un par de tijeras quirúrgicas para exponer la vejiga.Empuje con cuidado la grasa adyacente, pero deje la vejiga en su lugar. Sostenga la jeringa con la mano dominante con la aguja apuntando hacia abajo. Sumerja la punta del catéter en lubricante estéril y coloque la punta del catéter en la abertura uretral, manteniendo el cilindro de la jeringa en un ángulo de 30 a 45 grados sobre el cuerpo del ratón.Aplique presión hacia abajo con un ligero movimiento en el sentido de las agujas del reloj e inserte suavemente el catéter en la uretra A medida que ingresa la punta del catéter, gire la jeringa hacia la cola del ratón mientras continúa deslizando el catéter más adentro de la uretra hasta que el cilindro de la jeringa esté paralelo a la superficie de trabajo. Todo el eje de la aguja del catéter debe entrar en el ratón, colocando la punta del catéter dentro de la luz de la vejiga. Administre lentamente de 50 a 80 microlitros de fijador, lo que hace que la vejiga se infle como un globo.Mantenga el catéter en su lugar y levante ligeramente la jeringa, inclinando la punta hacia arriba. Con la otra mano, abra un hemostático y deslice una punta por debajo de la aguja del catéter en la intersección de la uretra. Cierre parcialmente el hemostático hasta que haga contacto con la aguja.Deslice suavemente la aguja del catéter fuera de la vejiga mientras simultáneamente sujeta y bloquea el hemostático por completo para evitar la pérdida del fijador. Agarre el hemostático de modo que quede paralelo a la superficie de trabajo con la vejiga apoyada en la parte superior. Levántelo suavemente y corte con cuidado debajo del hemostático para extraer la vejiga con el hemostático aún unido.Coloque la vejiga y el hemostático conectado en un tubo Falcon que contenga fijador calentado. Asegúrese de que la vejiga esté completamente sumergida en el líquido y no presionada contra las paredes del tubo. Para obtener imágenes de la vejiga mediante microscopía electrónica de barrido, bicorte sagitalmente con una cuchilla de afeitar o bisturí limpio de doble cara y haga un segundo corte tangencial al hemostático para liberar la vejiga.Esto da como resultado dos copas de media vejiga. Si quedan almohadillas de grasa en el exterior de la vejiga, retírelas con cuidado. Enjuague las mitades de la vejiga tres veces con tampón de cacodilato de sodio.Tiñir el tejido con tetróxido de osmio al 1% en tampón de cacodilato de 0,15 molares durante una hora a temperatura ambiente. Realice este paso con el recipiente de tinción envuelto en papel de aluminio para mantener un ambiente oscuro. Después de teñir, enjuague las mitades de la vejiga tres veces con agua ultrapura.Si se observa aceite osmicado en la superficie del agua, aspire o absorba para evitar la contaminación durante los pasos de secado. Después de deshidratar el tejido, bisescta las mitades de la vejiga con una navaja limpia de doble cara para generar cuatro piezas en total. Después de la inoculación, los títulos de UPEC son detectables en la orina.El nivel de bacteriuria UPEC es alto el primer día y puede aumentar durante la primera semana antes de disminuir en puntos temporales posteriores. Aproximadamente entre el 65 y el 80% de los ratones no tendrán UPEC detectable en la orina a los 28 días después de la inoculación. Estos ratones se pueden utilizar en los pasos posteriores del modelo.Los ratones que permanezcan bacteriúricos deben ser eliminados del experimento. Dos exposiciones secuenciales a G. vaginalis, con 12 horas o una semana de diferencia, dan lugar a la aparición de UPEC a partir de reservorios intracelulares que causan bacteriuria recurrente. El análisis de citología de orina se puede utilizar para detectar células polimorfonucleares en la orina de ratones expuestos a G. Vaginalis con aparición de UPEC.En el modelo con dos exposiciones administradas con una semana de diferencia, los títulos de UPEC en el tejido vesical son más bajos en los ratones expuestos a G. vaginalis en comparación con PBS, presumiblemente debido a la emergencia de UPEC de los reservorios y la posterior eliminación. La visualización de tejido vesical fijo in situ mediante SEM revela células uroteliales grandes y superficiales que recubren la superficie de la vejiga en ratones de control expuestos solo a PBS. La exfoliación urotelial se evidencia por una pérdida de células paraguas superficiales, revelando un epitelio transicional subyacente más pequeño en ratones expuestos a G. vaginalis.Temprano después de la inoculación de UPEC, durante el establecimiento de reservorios intracelulares, las células bacterianas son visibles en el urotelio y filamentan a partir de las células exfoliantes. Los métodos descritos aquí allanan el camino para futuros estudios que investiguen el efecto de cepas adicionales de Gardnerella u otras especies urogenitales en la infección urinaria por E. coli.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video se muestran los métodos para inducir transuretral infecciones del tracto urinario ratón y cuantificar la extensión de las infecciones resultantes.

Inducción transuretral de infección del tracto urinario ratón

Fuente: O'Brien, V. P., et. al., Infección urinaria recurrente de Escherichia coli desencadenada por exposición a la vejiga a Gardnerella vaginalis en ratones. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demuestra el uso de microscopía electrónica de barrido para visualizar la colonización bacteriana y las interacciones huésped-patógeno en el epitelio de vejiga de un modelo murino preinfectado.

Preparación del tejido de vejiga de ratón para la visualización de infecciones bacterianas

Fuente: O'Brien, V.P. et al. Infección urinaria recurrente por Escherichia coli desencadenada por la exposición a la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo muestra la preparación de un inóculo de Gardnerella vaginalis para establecer un modelo murino de infección urinaria recurrente.

Preparación del inóculo de Gardnerella vaginalis para modelar infecciones urinarias recurrentes en ratones

Fuente: Conover, M. S., et al., J. Establecimiento y caracterización de ITU y CAUTI en un modelo murinho. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo muestra el procedimiento para ensamblar e implantar un catéter transuretral en una ratona, seguido de la inoculación bacteriana para establecer la infección urinaria asociada al catéter e investigar las interacciones hospedador-patógeno mediadas por biofilm.

Infección urinaria asociada a catéter en un modelo murino

Fuente: Conover, M. S. et al., Establecimiento y caracterización de ITU y CAUTI en un modelo murinho. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demuestra la detección de comunidades bacterianas intracelulares (IBCs) en tejido de vejiga de ratón infectado con Escherichia coli que expresa β-galactosidasa. Tras la fijación tisular, permeabilización y tinción con X-gal, los IBC aparecen como puntos azules bajo un microscopio disecante, confirmando la invasión bacteriana durante la infección urinaria.

Visualización de comunidades bacterianas intracelulares en una vejiga de ratón infectada

En este video, describimos la técnica para la administración intravesical de bacterias uropatógenas para generar un modelo de infección del tracto urinario en ratones. Este modelo se puede utilizar para comprender la propagación de la infección bacteriana uropatógena dentro del sistema urinario y los mecanismos que determinan la susceptibilidad a las infecciones urinarias.

Modelo de Generación de Infección del Tracto Urinario: Una Técnica para Administrar Bacterias Uropatógenas en Ratón para Desarrollar un Modelo de Infección del Tracto Urinario

Este video demuestra el establecimiento de una infección uropatógena por Escherichia coli en una vejiga de ratón hembra a través de la instilación de catéter transuretral. Las bacterias inyectadas establecen con éxito una infección del tracto urinario dentro de la vejiga, proporcionando una valiosa plataforma para estudiar las enfermedades asociadas a la atención médica relacionadas con el tracto urinario.

Cateterismo transuretral e inoculación bacteriana para generar un modelo de infección del tracto urinario en ratones machos

Establecimiento de un modelo de infección del tracto urinario en ratones hembra

La capacidad de modelar infecciones del tracto urinario (ITU) es crucial para poder comprender la patogénesis bacteriana y generar el desarrollo de nuevas terapias. El objetivo de este trabajo es demostrar modelos murinos de ITU experimentales e ITU asociadas a catéteres que recapitulen y predigan los hallazgos observados en humanos.

Establecimiento y caracterización de IU y ITUAC en un modelo de ratón

El modelo establecido de cateterización transuretral de ratones permite el estudio de patologías de vejiga, incluyendo infección del tracto urinario, pero puede realizarse solamente en las hembras. Un nuevo modelo de hombre instilación transuretral, presentado aquí, permitirá que la investigación en un área marcada por fuertes diferencias clínicas y epidemiológicas entre los sexos.

Infección del tracto urinario en un modelo Animal pequeño: cateterización transuretral de ratones machos y hembras

El parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) es un problema de salud mundial urgente con opciones de prevención y tratamiento subóptimas. Presentamos un modelo de ratón de parto prematuro inducido por infección bacteriana vaginal ascendente y describimos cómo analizar la morbilidad y mortalidad neonatal resultante.

Modelado de infección vaginal ascendente, parto prematuro y morbilidad neonatal en ratones

Aprende a investigar infecciones urinarias recurrentes por E. coli en ratones usando un modelo que expone la vejiga a Gardnerella vaginalis. Este método permite estudiar la dinámica bacteriana y el desarrollo de reservorios intracelulares.

Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones (Video) | JoVE Journal

Infección recurrente del tracto urinario por Escherichia coli desencadenada por la exposición de la vejiga de Gardnerella vaginalis en ratones

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