Etiquetado Covalente Con Dietilpirocarbonato Para El Estudio De La Estructura De Orden Superior De Proteínas Por Espectrometría De Masas

Caracterizar una estructura proteica es esencial para entender su función. La espectrometría de masas ha surgido como una herramienta poderosa para este propósito, especialmente para los sistemas de proteínas que son difíciles de estudiar por métodos tradicionales. Para estudiar una estructura de proteína por especificación de masa, se realizan reacciones químicas específicas en solución que codifican una proteína información estructural en su masa.

Un enfoque particularmente efectivo es utilizar reactivos que modifican covalentemente la resolución de cadenas laterales de aminoácidos accesibles. Estas reacciones conducen a aumentos de masa que se pueden localizar con la resolución del nivel de residuos cuando se combinan con la digestión proteolítica y la espectrometría de masas en tándem. Aquí, describimos los protocolos asociados con el uso de pirocarbonato de dietilo o DEPC como reactivo de etiquetado covalente junto con la detección de especificaciones de masa.

DEPC es una molécula altamente electrofílica capaz de etiquetar hasta el 30% de los residuos en la proteína promedio, proporcionando así una excelente resolución estructural. DEPC se ha utilizado con éxito junto con las especificaciones de masa para obtener información estructural para muchas proteínas diferentes. Comience por preparar una solución tamponada de su proteína de interés en una concentración en el rango de decenas de micromolares.

Utilizamos comúnmente un almacenador intermediario de 10 milimolares pH 7.4 MOPS. Alternativamente, una solución de proteína existente puede ser un intercambio de tampón en MOPS u otro tampón si la muestra original contiene un tampón que tiene grupos funcionales nucleófilos. Es necesario que el tampón no tenga grupos funcionales nucleófilos porque interferirán con la reacción de la proteína DEPC.

En un microtubo diferente, prepare una solución común de 100 milimolares DEPC en acetonitrilo seco. La preparación de la solución común en acetonitrilo seco es necesaria para prevenir la hidrólisis de DEPC. En un nuevo microtubo, prepare la solución de un imidazol molar en agua de grado HPLC.

En un nuevo microtubo, mezcle el tampón MOPS y la solución de proteínas. A la proteína y al tampón agregue una alícuota de la solución común de DEPC asegurándose de que se mezcle correctamente antes de colocar la mezcla de reacción en un baño de agua de 37 grados Celsius durante un minuto. El volumen de la solución común de DEPC que se utiliza debe elegirse en función de la relación de concentración de proteína DEPC final que se desea.

No hay un solo conjunto de dePC y concentraciones de proteínas que funcionen con cada proteína, aunque la concentración óptima de DEPC se puede estimar en función del número de residuos de histidina y lisina accesibles al disolvente presentes en la proteína. Cabe señalar que el volumen de acetonitrilo añadido, que es efectivamente el volumen de la solución DEPC añadido no debe exceder el 1% del volumen total de la reacción como para evitar la perturbación de la estructura de la proteína durante la reacción. El tiempo de reacción depende en última instancia del usuario, aunque una reacción de un minuto bajo la condición de ejemplo minimiza el etiquetado excesivo de la proteína y la hidrólisis del DEPC.

Después de que haya pasado un minuto, apague la reacción agregando el imidazol para limpiar el dePC reaccionado restante. Asegurarse de que la concentración final de imidazol es 50 veces la concentración de DEPC. Para identificar los residuos que han sido modificados por DEPC, la proteína debe ser digerida proteolíticamente en fragmentos peptídicos.

Para la digestión, elija las condiciones que son susceptibles a la proteína de interés. Los pasos comunes que se describen aquí implican el despliegue de proteínas y luego la reducción y alquilación de enlaces disulfuro para que la eficiencia de la digestión se puede mejorar. En nuestra experiencia, desplegar la proteína con un desnaturalizante y calor antes de la digestión mejora la eficiencia de la digestión.

Mientras se despliega la proteína, compare las soluciones de TCEP y yodoacetamida en un tampón de digestión apropiado. El TCEP debe utilizarse como agente reductor en lugar del ditiothreitol o la TDT, ya que la TDT puede reaccionar con los residuos modificados por el DEPC. La alquilación de los archivos resultantes después de la reducción es esencial para evitar la aleatorización de etiquetas en la que los archivos libres y la proteína reaccionan con aminoácidos modificados.

Una vez que el paso de despliegue haya terminado, reduzca los enlaces disulfuro agregando TCEP a la mezcla de reacción y déjela reaccionar durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de la reducción, agregue iodoacetamida a la mezcla de reacción, deje que reaccione durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se logra aquí colocando la mezcla de reacción en una caja.

La concentración final de yodoacetamida debe ser el doble de la concentración utilizada para TCEP o 80 veces la concentración de proteínas o el enlace disulfuro. Prepare la enzima de interés, generalmente tripsina o quimotripsina de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Después de preparar la enzima de elección, comience la digestión e incube la mezcla de reacción a 37 grados Celsius.

Una proporción de proteína a enzima de 10:1 con una digestión de tres horas usando enzimas inmovilizadas es típicamente una buena opción para las proteínas etiquetadas con DEPC. Después de la digestión, la muestra debe ser analizada inmediatamente por LC-MS/MS o congelada con nitrógeno líquido para minimizar la degradación de la muestra y la pérdida de la etiqueta. Los parámetros estándar de LC-MS/MS para la proteómica de abajo hacia arriba se pueden utilizar para identificar sitios etiquetados en los fragmentos de péptido proteolítico.

La fase estacionaria de fase inversa C18 debe utilizarse para lograr la mejor separación de péptidos. En nuestra experiencia, la LC capilar proporciona información cuantitativa más confiable sobre los niveles de modificación que la nano LC debido a las mayores cantidades de muestra utilizadas. Una fase móvil lc típica que se utiliza para separar los péptidos etiquetados de DEPC se compone de dos disolventes.

El disolvente A es agua con ácido fórmico al 0,1% y el disolvente B es un acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1%. Se utiliza una elución de gradiente y el tiempo de separación se puede optimizar en función de la complejidad de la muestra. Se requiere un espectrómetro de masas capaz de hacer LC-MS y MS/MS en línea para identificar los sitios de modificación de DEPC en los péptidos.

En nuestros experimentos, hemos utilizado con éxito varios tipos de espectrómetros de masas. Hemos encontrado que un Thermo Orbitrap Fusion proporciona excelentes resultados, aunque cualquier espectrómetro de masas capaz de realizar automáticamente MS / MS de muchos péptidos durante el curso de un análisis LC-MS debe ser adecuado. Las condiciones de HPLC y los parámetros espectrométricos de masas deben establecerse correctamente antes de la medición.

Si la muestra ha sido congelada con flash, debe ser descongelada justo antes del análisis. Haga todo lo posible para minimizar el tiempo entre la preparación de la muestra y la inyección de HPLC. Cargue e inyecte la muestra de proteína etiquetada digerida en el sistema LC y comience la adquisición de LC-MS / MS o la identificación del sitio de la etiqueta DEPC y la cuantificación del área pico, existen múltiples métodos.

En los instrumentos Thermo Fisher, excalibur o descubridor de proteomas puede ser utilizado. Establezca los parámetros apropiados para la identificación de péptidos en un programa. La adición de DEPC y la carbamidometilación se incluyen como modificaciones variables que ayudan a los residuos o se asignan.

Las áreas pico cromatográficas de las versiones modificadas y no modificadas de los péptidos se utilizan para determinar los porcentajes de modificación del nivel de residuos. El etiquetado DEPC con detección de MS también es una herramienta valiosa para caracterizar los cambios estructurales de orden superior en las proteínas. A partir de nuestro estudio, el etiquetado covalente DEPC puede identificar regiones proteicas específicas que sufren cambios estructurales tras el estrés térmico y oxidativo.

En la figura, los cambios significativos en los porcentajes de modificación se muestran en azul para la disminución del etiquetado y en rojo para el aumento del etiquetado, mientras que los residuos sin cambios significativos en el etiquetado se muestran en verde pálido. Por ejemplo, después de que la microglobulina beta-2 se expone a la tensión de calor, muchos residuos que experimentan disminuciones significativas de grados de etiquetado, N-término, serina 28, histidina 31, serina 33, serina 55, serina 57, y lisina 58 están más cerca que un lado de la proteína que sugiere que esta región de la proteína experimenta un cambio confirmacional o media posiblemente la agregación. Después de que la proteína se exponga a la tensión oxidativa, diversos residuos con una disminución del etiquetado, serina 11, histidina 13, lisina 19, lisina 41, y lisina 94 de un racimo en otra fase de la proteína que indica que el cambio confirmacional inducido oxidación ocurre a otra parte.

Este estudio tiene implicaciones importantes para la terapéutica de proteínas, que actualmente son el segmento de más rápido crecimiento del mercado farmacéutico. Otros trabajos de nuestro grupo también han demostrado que la especificación de masa de etiquetado covalente DEPC puede detectar e identificar sitios de cambios confirmacionales en la terapéutica de anticuerpos monoclonales estresados. Como puede ver, el etiquetado covalente con DEPC es fácil de implementar experimentalmente, pero puede proporcionar información estructural valiosa para las proteínas.

La resolución estructural proporcionada por la especificación de masa de etiquetado DEPC es modesta en comparación con las técnicas como la cristalografía de rayos X y RMN, pero es susceptible a casi cualquier proteína, independientemente de su tamaño o capacidad de ser cristalizada. La especificación de masa de etiquetado covalente DEPC también funciona con mezclas de proteínas y puede funcionar con tipos de muestras muy complicados, como el lisato celular y las células haCat. Después de ver este video, estamos seguros de que encontrará el etiquetado DEPC una herramienta útil para caracterizar la estructura de la proteína.