Reprogramación directa de fibroblastos humanos en mioblastos para investigar terapias para trastornos neuromusculares

Hola a todos. Mi nombre es Nicolas Wein. Soy investigador principal del Hospital Nacional de Niños en Columbus, Ohio.

Y hoy vamos a mostrarte un video sobre cómo tomar una biopsia de piel y convertirla en mioblastos y miotube. Esta es una herramienta muy útil para estudiar el trastorno neuromuscular. Además, es una tecnología mucho más rápida en comparación con IPSC porque estamos utilizando dos tipos diferentes de virus para combatir directamente este tipo de célula.

Este video demuestra el protocolo para establecer cultivos de fibroblastos derivados de la piel humana, la conversión en mioblastos y luego miotubes diferenciados. Una biopsia de piel se transfiere al cultivo celular para derivar fibroblastos dérmicos. Los Lentivirus portadores de genes hTERT y MYOD se utilizan para transducir estos fibroblastos.

Tras la adición del medio de crecimiento de mioblastos complementado con doxiciclina, se expresa el gen MYOD, induciendo la conversión de fibroblastos en mioblastos. A continuación, el medio se cambia a un medio de diferenciación, también complementado con doxiciclina. Luego los mioblasts se fusionan entre sí, formando miotubes multinucleados.

Aspirar los medios del tubo y enjuagar la biopsia con 10 mililitros, uno x PBS a temperatura ambiente, tres veces. Después del tercer lavado, deje el PBS en el tubo. Vierta el PBS y la biopsia de la piel en un plato cuadrado de 10 centímetros.

Usando bisturíes estériles, corta la biopsia en trozos lo más pequeños posible. Con una pipeta, transfiera una pieza de piel individual a un plato estéril de 10 centímetros cuadrados. Aspirar el exceso de PBS de alrededor de cada pieza.

Tenga cuidado de no aspirar la pieza en sí. Cubra parcialmente los platos con la tapa y deje que las piezas de biopsia de la piel se sequen durante cinco a 20 minutos. No permita que las piezas se sequen durante demasiado tiempo.

Una vez que las piezas estén secas, incline el plato en un ángulo de 45 grados y agregue lentamente 12 mililitros de fibroblasto medio a la esquina del plato. Baje el plato, distribuyendo cuidadosamente los medios de comunicación para que las piezas no sean levantadas por los medios de comunicación. Coloque los platos en la incubadora.

Reemplace los medios de comunicación en cinco a siete días, y una vez a la semana a partir de entonces. Sembran fibroblastos primarios al 30% de la confluencia y dos pozos de una placa de 12 pozos, aproximadamente 20.000 células por pozo, con el fin de tener alrededor del 50% de la confluencia al día siguiente. Para la transducción lentiviral, añadir de dos a 5 mil millones de genomas virales de hTERP Puromycin Lentivirus y 400 microlitros de medio fibroblasto.

Agregue la mezcla de lentivirus a un pozo. Al segundo pozo, añadir sólo 400 microlitros de fibroblasto medio. Al día siguiente, agregue un mililitro de medios.

Uno o dos días más tarde, transfiera las células a una placa de seis pozos y las haga crecer hasta alcanzar entre el 60 y el 70% de confluencia. Complemente el medio fibroblasto con un microgramos por mililitro de Puromicina y agregue dos mililitros a cada pozo. Mantenga las celdas bajo selección hasta que todas las celdas del pozo de control estén muertas durante al menos 12 días, cambiando los medios cada dos o tres días.

Gráfico H de semillas que expresa fibroblastos al 30% de confluencia en tres pozos de la placa de 12 pozos para tener alrededor de 50% de confluencia al día siguiente. Para la transducción lentiviral, mezcle de dos a cinco mil millones de genomas virales de MYOD Hygromiccin B lentivirus y 400 microlitros de fibroblasto medio y añada a dos pozos. Agregue un mililitro de medio al día siguiente.

Uno o dos días más tarde transferir las células a una placa de seis pozos y crecer hasta 60 a 70% confluente. Complementar los medios de crecimiento con 400 microgramos por mililitro de higromicina B.Añadir dos mililitros a cada pozo. Mantenga las células bajo selección hasta que todas las células de los pozos de control hayan muerto, normalmente tardando al menos 12 días, cambiando los medios cada dos o tres días.

Para la inducción de mioblastos, cultivar fibroblastos hasta que sean 70% confluentes. Añadir ocho microgramos por mililitro de doxiciclina al medio de crecimiento de mioblastos. Utilice siempre alícuotas frescas de doxiciclina y medio.

El medio debe prepararse justo antes de que los medios cambien. Además, la doxiciclina no debe ser refrozen. Aspirar el medio fibroblasto y enjuagar las células con PBS.

Añadir 10 mililitros de medios mioblastos suplementados. Dos o tres días después, las células son 90 a 95% confluentes y su morfología habrá cambiado. Aspirar el medio de crecimiento de mioblast y enjuagar la superficie celular con PBS.

Añadir 10 mililitros de medios de diferenciación que se ha complementado con ocho microgramos por mililitro de doxiciclina fresca. Continúe cambiando los medios cada dos o tres días hasta que se formen los miotubes. Siete a 10 días después del inicio de la diferenciación de miotube, las células deben diferenciarse completamente, pero esto varía de una línea celular a otra.

Los primeros fibroblastos pueden surgir cinco días después de que las piezas de la piel hayan estado en cultivo. En la imagen B, los fibroblastos son confluentes y listos para ser transferidos a frascos cuadrados de 75 centímetros para una mayor proliferación. Es importante congelar varios viales de fibroblastos en números de paso bajos a medida que las células primarias entran en la senescencia replicativa.

Una vez establecidas las líneas celulares FM para la conversión de fibroblastos en miotubes, los fibroblastos deben proliferar hasta un 70% de confluentes como se muestra en la imagen A.Es importante no exceder el 80% de la confluencia, ya que una alta densidad puede afectar la diferenciación. Después de la adición de doxiciclina al medio, dentro de dos a cuatro días las células se convierten en mioblastos, caracterizados por una morfología alargada y orientación paralela como se ve en la imagen B.Los miotubes diferenciados se muestran en la imagen C.El tiempo de fusión y diferenciación de los miotubes puede variar de siete a 21 días dependiendo del genotipo celular. Las celdas deben recogerse o fijarse antes de que se desasocian.

El principio del desprendimiento se puede observar por el color y el brillo de los bordes del myotube, como señalan las flechas de esta imagen. Por inmunofluorescencia, la expresión de proteínas musculares maduras específicas confirma la conversión exitosa de fibroblastos en miotubes. En estas imágenes, se muestran tres celdas diferentes.

El grado de diferenciación variará de una célula a otra, y puede o no ser efectuado por la mutación primaria, ya que es el caso de las células en las figuras B y C.La validación adicional del modelo fue confirmada por RNAseq. Como se muestra en esta trama hay más de 12.000 genes expresados diferencialmente detectados en myotubes FM en comparación con el del músculo esquelético. La correlación significativa entre ambos transcriptomas apoya que las células FM tienen un perfil de expresión específica muscular que demuestra que son un sustituto útil y confiable para las líneas celulares derivadas del músculo.

Para ilustrar la utilidad de este modelo in vitro, hemos utilizado una de las duplicaciones exónicas más comunes en el gen DMD. La duplicación de Exon dos conduce a la interrupción del marco de lectura DMD, y su salto puede conducir a la restauración de ese marco de lectura o la utilización del sitio de entrada ribosoma interno. Esta terapia ya ha sido validada con estudios in vivo Figura A, demostramos prueba de concepto por el análisis RTPCR de esta línea celular mutada en particular, con y sin tratamiento por salto exon.

La mancha occidental en la figura B demuestra que la proteína de distrofina funcional se expresa en las células tratadas. Al comparar la eficiencia de esta terapia con modelos in vivo, los resultados apoyan la fiabilidad de la técnica de diferenciación celular y apoyan su uso para probar diversas terapias genéticas específicas de mutación. Antes de los estudios clínicos necesarios para probar la eficacia del apoyo de terapia oficial en trastornos neuromusculares, dependiendo de la capacidad de los modelos animales y celulares.

El desarrollo de modelos animales, aunque sea más fácil hoy en día, no es una opción factible para cada mutación específica. La generación de mioblastos a través de células IPS derivadas de fibroblastos dérmicos es una alternativa, pero es una técnica que consume mucho tiempo. Por lo tanto, este procedimiento es una alternativa simple a la generación ips que permite la conversión directa de fibroblastos en mioblastos.

Facilita el acceso a los modelos celulares humanos evitando la aplicación más invasiva de biopsias musculares En conclusión, esta conversión directa de fibroblastos en mioblastos es una poderosa herramienta para probar terapias para trastornos neuro musculares en contexto específico de limitación.