Utilización de Grafix para la detección de interactores transitorios de subcomplejos de Saccharomyces cerevisiae Spliceosome

El método de fijación en gradiente, en el que se realiza una centrifugación en gradiente de glicerol en presencia de un reticulante, ayuda a identificar las interacciones entre proteínas que se unen transitoriamente a complejos de subunidades múltiples. El uso de reactivos de fijación en el gradiente de glicerol estabiliza la unión de factores sueltos, sin la formación de precipitados, lo que permite la identificación de las interacciones de proteínas específicas con semicomplejos empalmados. La demostración del protocolo final ayuda a los usuarios principiantes a aprender información que puede ser difícil de entender solo con texto escrito.

Para la preparación del extracto total de levadura, cultive las células de levadura que expresan uno de los factores de empalme fusionados con la etiqueta del grifo y un litro de medio de glucosa Y y B suplementado con los aminoácidos o bases nucleicas apropiados. Cuando el cultivo alcance una densidad óptica de 600 nanómetros de uno, recoja las células de levadura por centrifugación en tres botellas de centrífuga de 500 mililitros y lave las células dos veces en 10 mililitros de agua fría estéril por lavado. Después del segundo lavado, vuelva a suspender las células en una décima parte del volumen celular del tampón frío A y congele 50 gotas de microlitros de la suspensión celular de levadura en nitrógeno líquido.

Después de la congelación, muela los gránulos de células congeladas a través de seis ciclos a 20 hercios durante tres minutos en un dispositivo de molino de bolas, sumergiendo el recipiente de células congeladas en nitrógeno líquido al final de cada ciclo. Después del último ciclo, coloque los tubos que contienen los extractos en agua a temperatura ambiente con agitaciones ocasionales. Una vez derretido, centrifugar para recoger los extractos.

Y cuantificar la proteína que los sobrenadantes aclararon por el método BCA. A continuación, congele rápidamente las alícuotas de los extractos en nitrógeno líquido para almacenarlas a menos 80 grados centígrados. Para preparar un gradiente de glicerol, añadir una concentración final del 0,1% del agente de reticulación glutaraldehído a una solución de glicerol al 30% y tampón A, y mezclar para homogeneizar.

Agregue seis mililitros de solución fría de glicerol al 10% y tampón A a un tubo de centrífuga de 12 mililitros y use una jeringa de dispositivo maestro de gradiente equipada con una aguja larga para colocar la solución de glutaraldehído al 30% de glicerol en el fondo del tubo. Utilice un dispositivo maestro de gradiente para crear un gradiente lineal de glicerol de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Coloque con cuidado 200 microlitros de un cojín de glicerol al 7% y tampón A en la parte superior del gradiente antes de agregar aproximadamente dos miligramos de extracto celular en la parte superior del tubo.

Después de la generación del gradiente de glicerol, coloque la muestra en un rotor de cubo oscilante preenfriado y recoja el extracto por centrifugación. Alicube la muestra de cada tubo de muestra de 12 mililitros en 24 fracciones de 500 microlitros, y use una bomba peristáltica para empujar una solución de glicerol al 40% a través del gradiente del 10 al 30% desde el tubo hasta la recolección de fracciones. A continuación, cargue 50 microlitros de cada fracción directamente sobre las membranas de nitrocelulosa en una transferencia de puntos, seguida de la adición de tampón de bloqueo, y utilice un anticuerpo primario contra la CBP para detectar la proteína en la transferencia inmunológica, y un anticuerpo secundario adecuado según sea necesario.

En ausencia de reticulante, CWC 24 se concentra entre las fracciones cinco y 13, correspondientes a complejos de aproximadamente 80 a 200 megadaltons. Sin embargo, en presencia del reticulante, la posición de CWC 24 en el gradiente se desplaza a fracciones en la parte inferior del gradiente correspondientes a complejos más grandes. Al comparar la sedimentación de CWC 24 con la de la subunidad U5 snRNP, Prp8, y la subunidad NTC, Prp19 revela que CWC 24 se concentra en las mismas fracciones.

Pero, debido a que se asocia transitoriamente con el espliceosoma, también está presente en las fracciones más ligeras. Curiosamente, las fracciones 11 y 12 son aquellas en las que Prp8 y 19 comienzan a concentrarse, lo que sugiere que esta es la porción del gradiente donde el complejo B Act comienza a sedimentarse. El análisis de Western blot de las fracciones 11 y 12 revela señales de Prp8 y 19 como frotis que apenas penetran en un gel de acrilamida al 8%, lo que demuestra que, de hecho, forman parte de grandes complejos.

CWC 24 también está presente en la fracción 12, pero en una concentración mucho más baja, lo que es consistente con su unión transitoria al complejo B Act. Tomados en conjunto, estos resultados muestran que el glutaraldehído se puede utilizar como reticulante para estabilizar la unión de factores transitorios a los subcomplejos de empalme. Este método se puede aplicar al estudio de cualquier complejo de subunidades motoras dinámicas que se asocie transitoriamente con algunos de sus componentes, como el espliceosoma.