Aplicación de células madre embrionarias haploides partegenéticas del ratón como sustituto de los espermatozoides

Este protocolo fecha falsamente la modificación de la impronta genómica en células madre embrionarias de ratón haploides, como la de nuestro sujeto debido a espermatozoides falsos, lo que permite la generación de embriones cultivados en ratones. La modificación genética de un gameto generalmente requiere técnicas difíciles. Utilizando esta metodología, los gametos parentales pueden ser manipulados en células madre embrionarias híbridas para su posterior introducción en ratones como una opción de reemplazo de espermatozoides.

Dado que este método permite la modificación artificial específica de un gameto paterno en embriones, es particularmente aplicable al estudio de la impronta genómica y la cauterización. El encargado de demostrar este procedimiento será Charles Etienne Dumeau, un embriólogo de ratones de mi laboratorio. Para preparar las pipetas de retención y de microinyección para el experimento, primero use un extractor de micropipetas para extraer capilares de vidrio de borosilicato con una forma alargada y una conicidad gradual.

Para preparar las pipetas de sujeción, coloque un capilar tirado con un diámetro exterior de 60 a 100 micrómetros en una microforja sobre el cordón de vidrio del filamento. Enciende el filamento y baja el capilar hasta que entre en contacto con el cordón. Cuando el capilar se haya adherido al cordón, apague el filamento y retraiga el capilar, haciendo que el capilar se rompa con un extremo recto.

A continuación, coloque la punta capilar rota horizontalmente junto a la cuenta de vidrio en el filamento y caliente el filamento para derretir el extremo hasta que el diámetro interior de la punta capilar alcance los 10 a 20 micrómetros de diámetro. A continuación, coloque el capilar por encima de la cuenta de vidrio aproximadamente a un milímetro de la punta y caliente el filamento para permitir que el capilar se doble en un ángulo de 20 grados. Para preparar una pipeta de microinyección, coloque un capilar tirado con un diámetro exterior de unos seis micrómetros por encima de la perla de vidrio sobre el filamento calentado y baje el capilar hasta que entre en contacto con la perla.

Una vez que el capilar se haya adherido, apague el filamento y retraiga el capilar. El capilar se romperá con un extremo recto. A continuación, mueva el capilar sobre la cuenta de vidrio aproximadamente un milímetro de la punta del capilar y caliente el filamento para permitir que el capilar se doble en un ángulo de 20 grados.

Para realizar una inyección intracitoplasmática, coloque cinco gotas de microlitros de solución PVP y 20 gotas de microlitros de medio M2 en la tapa invertida de un plato de 10 centímetros y cubra las gotas con aceite mineral. Coloque el plato en la plataforma e instale una pipeta de sujeción en el micromanipulador. Utilice una punta de microcargador para llenar la pipeta de microinyección con aceite de fluorocarbono y montar la pipeta en el actuador piezoeléctrico.

Observando a través del microscopio, baje la pipeta de microinyección en una gota de solución de PVP. Cuando la pipeta esté sumergida, pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para cubrir el vidrio con el PVP. Cargue un pequeño volumen de solución PVP en la pipeta de microinyección.

Sumerja las pipetas de microinyección y de sujeción en el medio M2 y concéntrese en la pipeta en la parte inferior de la gota. Transfiera aproximadamente dos microlitros de la suspensión de células madre embrionarias partogénicas de doble knockout a la gota media M2 y use una pipeta bucal para transferir 10 ovocitos M2 a la misma gota. Gire un ovocito y aplique presión negativa a través de la pipeta de retención para sujetar el ovocito de modo que el espacio perivitelina quede frente a la pipeta de microinyección, teniendo cuidado de que la placa de metafase dos no se coloque en el camino de la pipeta de microinyección.

Extraiga una célula madre embrionaria partogénica knockout doble en la punta de la pipeta de microinyección y confirme la ruptura de la membrana celular. Aplique una ligera presión negativa a la pipeta de microinyección y administre cuatro impulsos piezoeléctricos mientras empuja la punta de la pipeta de microinyección hacia el espacio perivitelino para atravesar la zona pelúcida. Penetrar en el ovocito con una pipeta de microinyección para que el oolema se estire hacia el lado opuesto y aplicar un pulso piezoeléctrico para perforar el oolema, asegurándose de que el oolema se relaja a lo largo del eje de la pipeta de microinyección.

Inyecte la célula madre embrionaria partogénica doble knockout con un volumen mínimo de medio en el ooplasma y retire la pipeta de microinyección suavemente del ovocito. Libere el ovocito inyectado de la pipeta de retención y muévalo hacia el lado de la microgota para su posterior recolección. Cuando se hayan inyectado todos los ovocitos, transfiera los ovocitos a una placa de pocillo central precalentada que contenga medio KSOM e incube la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una hora antes de la activación.

El análisis del contenido de ADN de esta línea representativa de células madre embrionarias partogénicas de doble knockout, portadora del transgén CAG/EGFP mediante citometría de flujo, ilustra la distribución de las células haploides y diploides en las fases G0, G1, S y G2 M. El genotipado se puede realizar para confirmar la ausencia de alelos de tipo salvaje en las regiones H19 e intergénicas diferencialmente metiladas. Un transgén CAG/EGFP puede introducirse en células madre embrionarias patógenas de doble knockout para estudiar su contribución a los embriones semiclonados mediante la visualización de fluorescencia verde bajo un microscopio.

El análisis de citometría de flujo muestra dos poblaciones correspondientes a la fase G2 M detenidas por células haploides y diploides después del tratamiento con demuculceno. La ausencia de un pico haploide 1N indica que el ciclo de reposo de la célula se completó en gran medida. Después de la inyección, la expresión de EGFP rara vez se detecta en los embriones semiclonados construidos.

a medida que el citoplasma de las células madre embrionarias partogénicas de doble knockout se dispersa en el citoplasma grande del ovocito. Seis horas después de la activación, se pueden observar hasta tres cuerpos polares bajo el microscopio. El primer y segundo cuerpo polar del ovocito y un cuerpo pseudopolar del ESC haploide.

Para demostrar su competencia en el desarrollo, los embriones semiclonados pueden cultivarse hasta la etapa de blastocitos. Además, se pueden obtener ratones hembra a término a partir de embriones semiclonados en dos etapas celulares transferidos a los oviductos de las hembras receptoras. Durante la microinyección, es importante romper la membrana plasmática de las células madre embrionarias haploides, ya que se manifiesta para evitar la segregación cromosómica cuando se activa el ovocito.

En lugar de células madre embrionarias haploides partenogenéticas, también se pueden utilizar células madre embrionarias haploides androgénicas, lo que permite seleccionar el gameto materno o paterno como reemplazo de espermatozoides según el propósito del estudio.