Name: Aplicación de células madre embrionarias haploides partegenéticas del ratón como sustituto de los espermatozoides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprende a utilizar células madre embrionarias haploides partenogenéticas como sustituto de espermatozoides para generar embriones semiclonados en ratones. Este método permite estudiar el imprinting genómico mediante manipulación gamética.

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Agradecemos al Dr. Giulio Di Minin la derivación de líneas phaESC y al Dr. Remo Freimann por el funcionamiento de la citometría de flujo. También reconocemos a la Sra. Michèle Schaffner y al Sr. Thomas M. Hennek por apoyo técnico con transferencia de embriones. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional suiza de Ciencias (subvención 31003A_152814/1).

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Los autores no tienen nada que revelar.

La clonación de mamíferos por transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) ha sido pionera en los años1990 19,20,21. Estos desarrollos siguieron a estudios de clonación realizados 30 años antes en anfibios22. El considerable retraso refleja la dificultad de la embriología y la impresión genómica en mamíferos. El desarrollo del SCNT mamífero es la base para la aplicación de haESC para sustituir espermatozoides, que se detalla en este protocolo.
La sincronización del ciclo de celda es un factor importante para el éxito de SCNT23. Este es también el caso de inyección de haESC en este protocolo. La introducción de un genoma de donante en un receptor requiere que las fases del ciclo celular se igualan para evitar roturas cromosómicas o aneuploidies que abroguen el desarrollo del embrión. La semi-clonación tiene la complejidad adicional de que dos genomas y un citoplasto necesitan ser compatibles. Un informe anterior ha demostrado que la inyección de haESC androgenéticas detenidas en fase M produjo mejores tasas de desarrollo de embriones semi-clonados que la inyección de haESC en fase G1 en ocitos7. Este informe sugiere la fase M como un punto de sincronización adecuado para la semiagulación. En consecuencia, se detuvo mitoticamente a los faásicos con demecolcina e inyectaron en el ooplasma de ocitos MII, que fueron detenidos naturalmente en metafase II de meiosis. Es importante destacar que la detención en fase M se puede lograr en los ESC del ratón con alta eficiencia, proporcionando una excelente sincronización entre los ciclos celulares de donantes y receptores.
Durante la mitosis, la membrana nuclear se descompone y se forma un husillo al que se adhieren los cromosomas replicados. Después de la inyección de DKO-phaESCs de fase M, los cromatátidos hermanos se segregan en un cuerpo pseudo polar y el cigoto7 (Figura 3E). En consecuencia, un solo conjunto de cromosomas de un DKO-phaESC contribuye al embrión semi-clonado. Es fundamental que los cromosomas hermanos de los cromosomas DKO-phaESC se puedan segregar correctamente después de la inyección. La membrana plasmática de un DKO-phaESC intacto evita la segregación en un cuerpo pseudo polar. De hecho, observamos casos raros en los que la membrana plasmática de los DKO-phaESCs no se rompió, y los embriones exhibieron DKO-phaESCs intactos en el ooplasma después de la inyección (Figura 3D). Por lo tanto, se debe tener cuidado de eliminar la membrana plasmática de los DKO-FASC mediante pipeteo. Durante la inyección, es igualmente importante evitar la interrupción del husillo meiotico del ócito, que podría conducir a defectos de segregación cromosómica e inducir la aneuploidía también.
En los mamíferos, la impresión genómica limita la aplicación de fases como reemplazo de espermatozoides. Los haESC partenogenéticos poseen una configuración materna de impresiones genómicas, mientras que los espermatozoides poseen una configuración paterna. Por lo tanto, la generación de cachorros a término no se ha producido después de la inyección de fasfas de wildtype como reemplazo de espermatozoides. Para superar esta limitación, las eliminaciones de los IG- y H19-DMR se diseñan en fases. La modificación de la expresión impresa en el Igf2-H19 materno y gtl2-Dlk1 loci es suficiente para cambiar la configuración de las impresiones genómicas para permitir la generación de ratones semi-clonados con una frecuencia de más del 5,1%, basado en embriones transferidos de 2 células. Estas observaciones sugieren que apuntar a dos genes impresos cambia el genoma de los fasc en una configuración paterna funcional que puede reemplazar a los espermatozoides en ratones. No obstante, para esta estrategia es necesaria una modificación genética permanente de las fases. Como estrategia alternativa, se puede considerar la haESC androgenética. Los haESC androgenéticos se derivan del genoma del esperma y poseen huellas paternas. Se ha informado de que el tipo salvaje y los haESC androgenéticos contribuyeron como reemplazo de espermatozoides para generar cachorros a término a una frecuencia entre el 1,3% y el 1,9% de los embriones transferidos4,7,24. Los cachorros a término también se han obtenido inyectando haESC androgenéticos con eliminaciones del IG- y H19- DMR a una frecuencia del 20,2% de los embriones de 2 células transferidos24. El aumento de la eficiencia de la semi-clonación utilizando haESC androgenéticos modificados es probable porque las impresiones pueden volverse inestables en el cultivo. Los defectos de impresión se corrigen mediante las deleciones genéticas de los DMR críticos.
Teniendo en cuenta la dificultad de introducir modificaciones genéticas directamente en los genomas de los ócitos o espermatozoides, los haESC son una herramienta valiosa para manipular los genomas parentales por separado. El uso de haESCs como sustituto de los espermatozoides proporciona una ventaja notable para la edición del genoma en la línea germino del ratón. Un estudio reciente ha combinado la edición del genoma basada en CRISPR/Cas9 con la aplicación de haESC para la caracterización de regiones de impresión que son críticas para el desarrollo embrionario12. Este estudio analizó el papel del Rasgrf1-DMR en combinación con el H19-y IG-DMR en el desarrollo de ratones bimaternal, y la función de 7 DMR diferentes en el desarrollo de ratones bipaternales. El método para sustituir los haESC por espermatozoides formó la base para enfoques genéticos de detección para identificar aminoácidos clave dentro de la proteína DND1 en el desarrollo primordial de células germinales y para identificar genes en el desarrollo óseo24,25,26. Los estudios sobre la impresión genómica y el cribado genético para identificar factores clave en el desarrollo embrionario son enfoques considerables para la aplicación de los haESC como genomas áticos.

En los mamíferos, los gametos son las únicas células que transmiten información genética a la próxima generación. La fusión de un ócito y un espermatozoide forma un cigoto diploide que se convierte en un animal adulto. Las mutaciones en genomas áticos son heredadas por la descendencia e impulsan la variación genética en la especie1. Se ha aplicado la introducción de mutaciones en la línea germinal para producir animales genéticamente modificados para diversos estudios biológicos, incluida la caracterización de la función génica y el modelado de enfermedades. Tanto los ocitos como los espermatozoides son células diferenciadas terminalmente y altamente especializadas que han dejado de proliferar. Por lo tanto, la modificación directa de gametos es técnicamente difícil, y se han desarrollado enfoques especializados. Las modificaciones genéticas pueden introducirse en la línea germinal del ratón mediante la inyección de ESC genéticamente modificados en blastocquistas, donde se integran en el embrión en desarrollo y colonizan la línea germinal. Además, la modificación genética de los cigotos utilizando enfoques de edición del genoma, incluido el sistema CRISPR/Cas9, se ha adoptado ampliamente2.
Recientemente, se ha notificado un enfoque excepcional, que aplica haESCs como sustituto de un genomagametic 3,4,5,6,7,8. Los haESC son líneas de células madre derivadas de la masa celular interna de blastocistos haploides partefenogenéticos o androgenéticos y poseen un solo conjunto de cromosomas4,7,9,10. Se ha demostrado que tanto los haESC partenogenéticos como los haESC androgenéticos pueden contribuir al genoma de ratones semi-clonados después de la inyección intracitoplasmática en ocitos. A diferencia de otros enfoques, los genomas de los haESC pueden modificarse directamente en el cultivo debido a su capacidad de autorretración. La introducción de modificaciones genéticas en la línea germinales mediante la sustitución de espermatozoides por haESC es un método importante para los estudios biológicos. Prevé la posibilidad de cultivo separado y manipular el genoma materno o paterno, que se derivan de haESCs partefenogenéticos o androgenéticos, respectivamente. A continuación, los HaESC se pueden utilizar como reemplazo del genoma ático, lo que es especialmente ventajoso para los estudios de la impresión genómica, la expresión específica del alelo y los procesos específicos de los padres.
En ratones, se requiere información genómica materna y paterna para el desarrollo normal del embrión11. Por lo tanto, los cachorros a término no pudieron obtenerse cuando se inyectaron haESC partenogenéticos de tipo salvaje (fasfascos) para reemplazar el genoma del esperma5,8. Para superar el bloque de desarrollo, es necesario corregir la impresión genómica del genoma materno de los haESC partefenogenéticos a una configuración paterna. Esto se puede lograr mediante la manipulación de las regiones metiladas diferencialmente (DMR). Hasta la fecha, se han estudiado eliminaciones específicas del H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR y Rasgrf1-DMR para reprimir los genes expresados maternamente en fases3,5,8,12. Estos estudios demostraron que las eliminaciones tanto del H19-DMR como del IG-DMR son suficientes para convertir a un materno en una configuración de impresión paterna que puede sustituir a los cromosomas de espermatozoides. La inyección intracitoplasmática de falanges que transportan las dos eliminaciones dmr en ocitos produjo cachorros semi-clonados con una frecuencia entre el 5,1% y el 15,5% de los embriones transferidos de 2 células.
Este protocolo se basa en la aplicación de fases con eliminaciones de H19-DMR e IG-DMR, a las que denominamos fases eliminatorias dobles (DKO-phaESCs). Proporcionamos instrucciones detalladas para la modificación de la impresión genómica en fases para establecer líneas DKO-phaESC, para la inyección de DKO-fasfas en ocitos como sustituto de un genoma de espermatozoides, para el cultivo de embriones semi-clonados a blastocistas y para la obtención de ratones semi-clonados. Este protocolo es una referencia para los investigadores que requieren una manipulación precisa y directa del genoma paterno y la generación de embriones y ratones semi-clonados.

<table><tbody><tr><td>1,5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haCultivo de ESC</td></tr><tr><td>Tubo de 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>Cultivo de haESC</td></tr><tr><td>Placa de 12 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>de cultivo de haESC</td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>cultivo de haESC</td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>de cultivo de haESC</td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>cultivo de haESC</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>cultivo de haESC</td></tr><tr><td>Fracción BSA</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>cultivo de haESC</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>cultivo de haESC</td></tr><tr><td>Solución de demecolcina</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>cultivo de haESC</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC cultivo</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC cultivo</td></tr><tr><td>DR4 ratón</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haESC cultivo</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC cultivo</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC</td></tr><tr><td>cultivo Medio de congelación</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC cultivo</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC cultivo</td></tr><tr><td>Hepes solución</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC cultivo</td></tr><tr><td>MEF irradiado</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haCultivo de ESC</td></tr><tr><td>LIF (Factor inhibidor de la leucemia)</td><td>(Hecho en casa)</td><td>-</td><td>haCultivo</td>de</tr><tr><td>ESC Reactivo de lipofección</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>de cultivo</td></tr> <tr>de haESC<td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>cultivo de haESC Axón</td></tr><tr><td>de PD</td><td>0325901 1408</td><td>cultivo de haESC</td><td></td></tr><tr><td>Pluma Estreptococo</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>cultivo de haESC</td></tr><tr><td>piggyBac plásmido portador de un transgén CAG-EGFP</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>cultivo de haESC</td></tr><tr><td>piggyBac plásmido transposasa</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>cultivo</td></tr> <tr>de haESC<td>plásmido pX330</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>cultivo haESC</td></tr><tr><td>plásmido pX458</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>cultivo haESC</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>cultivo haESC</td></tr><tr><td>ADN polimerasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotipado</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotipado</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotipado</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotipado</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotipado</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Genotipado</td></tr><tr><td>SDS Merck</td><td></td><td>71729</td><td>Genotipado Cloruro</td></tr><tr><td>de sodio</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotipado</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotipado</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotipado</td></tr><tr><td>5 mL Tubo</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>5 mL Tubo con tapón de filtro</td><td>celular Falcon</td><td>352235</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>de flujo MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL Codan</td><td></td><td>62.1640</td><td>Superovulación</td></tr><tr><td>Aguja de 1/2 pulgada de calibre 30</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulación</td></tr><tr><td>B6D2F1</td><td>ratón The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulación</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD salud animal</td><td>49451</td><td>Superovulación</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulación</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 UI</td><td>Superovulación</td></tr><tr><td>plato de 10 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Manipulación de embriones</td></tr><tr><td>placa de 4 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Manipulación de embriones</td></tr><tr><td>tubo de 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td>227261 Manipulación de embriones</td></tr><tr><td>plato de 6 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Manipulación</td></tr> <tr>de embriones<td>Plato de pocillo central</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Manipulación de embriones</td></tr><tr><td>Balancín digital</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Manipulación de embriones</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Manipulación de embriones</td></tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Manipulación de embriones</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck MR-020P-5F</td> Manipulación <td>de</td><td>embriones</td></tr><tr><td>M16 medio</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Manipulación de embriones</td></tr><tr><td>M2 medio</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Manipulación de embriones</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Manipulación de embriones</td></tr><tr><td>Capilar de vidrio</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Manipulación de embriones</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Manipulación de embriones</td></tr><tr><td>Cloruro de estroncio</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Manipulación de embriones</td></tr><tr><td>jeringa de 5 ml</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Microinyección</td></tr><tr><td>Cappilar de vidrio de borosilicato</td><td>Producto científico</td><td>GB100T-8P</td><td>Microinyección</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinyección</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Microinyección</td></tr><tr><td>Pipeta de retención</td><td>BioMedical</td> <td>Instruments-Microinyección</td><td></td></tr> <tr><td>Microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Microinyección Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microinyección</td></tr><tr><td>Pipeta de microinyección</td><td>BioMedical</td> <td>Instruments-Microinyección</td><td></td></tr> <tr><td>Puntas de Microlaoder</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Microinyección</td></tr><tr><td>Brazos de micromanipulación</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Microinyección</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Microinyección</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Microinyección</td></tr><tr><td>PVP (Polivinilpirrolidina)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>Microinyección</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Microinyección</td></tr></tbody></table>

aplicación de células madre embrionarias haploides partegenéticas del ratón como sustituto de los espermatozoides

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

En organismos con reproducción sexual, las células germinales son la fuente de células totipotentes que se convierten en nuevos individuos. En ratones, la fertilización de un ócito por un espermatozoide crea un cigoto totipotente. Recientemente, varias publicaciones han informado de que las células madre embrionarias haploides (haESC) pueden ser un sustituto de los genomas áticos y contribuir a los embriones, que se convierten en ratones. Aquí, presentamos un protocolo para aplicar haESC partenogenéticos como sustituto de los espermatozoides para construir embriones mediante inyección intracitoplasmática en ocitos. Este protocolo consiste en pasos para preparar los haESC como reemplazo de espermatozoides, para la inyección de cromosomas haESC en ocitos y para el cultivo de embriones semi-clonados. Los embriones pueden producir ratones semi-clonados fértiles después de la transferencia de embriones. El uso de haESCs como reemplazo de espermatozoides facilita la edición del genoma en la línea germinaria, los estudios de desarrollo embrionario y la investigación de la impresión genómica.

Este artículo tiene como objetivo demostrar el uso de células madre embrionarias heploideas partefenogenéticas como sustituto de los espermatozoides para la construcción de embriones semi-clonados.

Aplicación de células madre embrionarias haploides partegenéticas del ratón como sustituto de los espermatozoides

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Este protocolo fecha falsamente la modificación de la impronta genómica en células madre embrionarias de ratón haploides, como la de nuestro sujeto debido a espermatozoides falsos, lo que permite la generación de embriones cultivados en ratones. La modificación genética de un gameto generalmente requiere técnicas difíciles. Utilizando esta metodología, los gametos parentales pueden ser manipulados en células madre embrionarias híbridas para su posterior introducción en ratones como una opción de reemplazo de espermatozoides.Dado que este método permite la modificación artificial específica de un gameto paterno en embriones, es particularmente aplicable al estudio de la impronta genómica y la cauterización. El encargado de demostrar este procedimiento será Charles Etienne Dumeau, un embriólogo de ratones de mi laboratorio. Para preparar las pipetas de retención y de microinyección para el experimento, primero use un extractor de micropipetas para extraer capilares de vidrio de borosilicato con una forma alargada y una conicidad gradual.Para preparar las pipetas de sujeción, coloque un capilar tirado con un diámetro exterior de 60 a 100 micrómetros en una microforja sobre el cordón de vidrio del filamento. Enciende el filamento y baja el capilar hasta que entre en contacto con el cordón. Cuando el capilar se haya adherido al cordón, apague el filamento y retraiga el capilar, haciendo que el capilar se rompa con un extremo recto.A continuación, coloque la punta capilar rota horizontalmente junto a la cuenta de vidrio en el filamento y caliente el filamento para derretir el extremo hasta que el diámetro interior de la punta capilar alcance los 10 a 20 micrómetros de diámetro. A continuación, coloque el capilar por encima de la cuenta de vidrio aproximadamente a un milímetro de la punta y caliente el filamento para permitir que el capilar se doble en un ángulo de 20 grados. Para preparar una pipeta de microinyección, coloque un capilar tirado con un diámetro exterior de unos seis micrómetros por encima de la perla de vidrio sobre el filamento calentado y baje el capilar hasta que entre en contacto con la perla.Una vez que el capilar se haya adherido, apague el filamento y retraiga el capilar. El capilar se romperá con un extremo recto. A continuación, mueva el capilar sobre la cuenta de vidrio aproximadamente un milímetro de la punta del capilar y caliente el filamento para permitir que el capilar se doble en un ángulo de 20 grados.Para realizar una inyección intracitoplasmática, coloque cinco gotas de microlitros de solución PVP y 20 gotas de microlitros de medio M2 en la tapa invertida de un plato de 10 centímetros y cubra las gotas con aceite mineral. Coloque el plato en la plataforma e instale una pipeta de sujeción en el micromanipulador. Utilice una punta de microcargador para llenar la pipeta de microinyección con aceite de fluorocarbono y montar la pipeta en el actuador piezoeléctrico.Observando a través del microscopio, baje la pipeta de microinyección en una gota de solución de PVP. Cuando la pipeta esté sumergida, pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para cubrir el vidrio con el PVP. Cargue un pequeño volumen de solución PVP en la pipeta de microinyección.Sumerja las pipetas de microinyección y de sujeción en el medio M2 y concéntrese en la pipeta en la parte inferior de la gota. Transfiera aproximadamente dos microlitros de la suspensión de células madre embrionarias partogénicas de doble knockout a la gota media M2 y use una pipeta bucal para transferir 10 ovocitos M2 a la misma gota. Gire un ovocito y aplique presión negativa a través de la pipeta de retención para sujetar el ovocito de modo que el espacio perivitelina quede frente a la pipeta de microinyección, teniendo cuidado de que la placa de metafase dos no se coloque en el camino de la pipeta de microinyección.Extraiga una célula madre embrionaria partogénica knockout doble en la punta de la pipeta de microinyección y confirme la ruptura de la membrana celular. Aplique una ligera presión negativa a la pipeta de microinyección y administre cuatro impulsos piezoeléctricos mientras empuja la punta de la pipeta de microinyección hacia el espacio perivitelino para atravesar la zona pelúcida. Penetrar en el ovocito con una pipeta de microinyección para que el oolema se estire hacia el lado opuesto y aplicar un pulso piezoeléctrico para perforar el oolema, asegurándose de que el oolema se relaja a lo largo del eje de la pipeta de microinyección.Inyecte la célula madre embrionaria partogénica doble knockout con un volumen mínimo de medio en el ooplasma y retire la pipeta de microinyección suavemente del ovocito. Libere el ovocito inyectado de la pipeta de retención y muévalo hacia el lado de la microgota para su posterior recolección. Cuando se hayan inyectado todos los ovocitos, transfiera los ovocitos a una placa de pocillo central precalentada que contenga medio KSOM e incube la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante una hora antes de la activación.El análisis del contenido de ADN de esta línea representativa de células madre embrionarias partogénicas de doble knockout, portadora del transgén CAG/EGFP mediante citometría de flujo, ilustra la distribución de las células haploides y diploides en las fases G0, G1, S y G2 M. El genotipado se puede realizar para confirmar la ausencia de alelos de tipo salvaje en las regiones H19 e intergénicas diferencialmente metiladas. Un transgén CAG/EGFP puede introducirse en células madre embrionarias patógenas de doble knockout para estudiar su contribución a los embriones semiclonados mediante la visualización de fluorescencia verde bajo un microscopio.El análisis de citometría de flujo muestra dos poblaciones correspondientes a la fase G2 M detenidas por células haploides y diploides después del tratamiento con demuculceno. La ausencia de un pico haploide 1N indica que el ciclo de reposo de la célula se completó en gran medida. Después de la inyección, la expresión de EGFP rara vez se detecta en los embriones semiclonados construidos.a medida que el citoplasma de las células madre embrionarias partogénicas de doble knockout se dispersa en el citoplasma grande del ovocito. Seis horas después de la activación, se pueden observar hasta tres cuerpos polares bajo el microscopio. El primer y segundo cuerpo polar del ovocito y un cuerpo pseudopolar del ESC haploide.Para demostrar su competencia en el desarrollo, los embriones semiclonados pueden cultivarse hasta la etapa de blastocitos. Además, se pueden obtener ratones hembra a término a partir de embriones semiclonados en dos etapas celulares transferidos a los oviductos de las hembras receptoras. Durante la microinyección, es importante romper la membrana plasmática de las células madre embrionarias haploides, ya que se manifiesta para evitar la segregación cromosómica cuando se activa el ovocito.En lugar de células madre embrionarias haploides partenogenéticas, también se pueden utilizar células madre embrionarias haploides androgénicas, lo que permite seleccionar el gameto materno o paterno como reemplazo de espermatozoides según el propósito del estudio.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

La capacidad de las células germinales embrionarias a diferenciarse en células germinales primordiales durante etapas tempranas del desarrollo es un modelo perfecto para hacer frente a nuestra hipótesis sobre el cáncer y la infertilidad. Este protocolo se muestra la forma de aislar las células germinales primordiales de las gónadas en desarrollo de embriones de 10.5 a 11.5 días después de ratón coitum.

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

Los protocolos para el trasplante de células germinales de testículo y el xenotrasplante de tejido se describen. Germen de los resultados de trasplante de células en donantes derivado de la espermatogénesis en los testículos receptores y representa un ensayo de reconstitución funcional para la identificación de células madre de espermatogonias (SSC). Tejido testicular xenoinjerto reproduce desarrollo de los testículos y la espermatogénesis de las especies de los distintos donantes en los...

Germen de Trasplante de Células y Tejidos Testículos xenotrasplante en ratones

Aquí se demuestra que el nuevo desarrollo • Kit de Cryo para la criopreservación de espermatozoides de ratón. Dos células etapa de desarrollo del embrión con esperma congelado-descongelado se ha mejorado consistentemente en cinco cepas de ratón con el uso de este kit. Durante un período de 1,5 años, 49 líneas de ratones genéticamente modificados fueron archivados por la crioconservación de esperma con el I • Kit de Cryo y más tarde recuperado con éxito por fecundación in vitro.

Criopreservación de espermatozoides de ratón y de recuperación con el I · Kit de Cryo

Generación de células madre pluripotentes inducidas (IPSC) Líneas produce líneas con diferente potencial de desarrollo aún cuando pasan las pruebas estándar de pluripotencia. Aquí se describe un protocolo para producir ratones totalmente derivadas de iPS, que define las líneas de IPSC como poseedor completo...

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

Este artículo describe un protocolo y eficiente derivar líneas de células madre pluripotentes de embriones de ratón de la cultura en la etapa de blastocisto.

Derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón

Aquí presentamos un protocolo para aumentar la producción de quimeras sin el uso de nuevos equipos. Un cambio de orientación simple del embrión para la inyección puede aumentar el número de embriones producidos y potencialmente reducir la línea de tiempo a la transmisión de la línea germinal.

Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

Aquí, presentamos un método modificado para la criopreservación de embriones unicelulares, así como un protocolo que combina el uso de embriones de congelación descongelado y electroporación para la generación eficiente de ratones modificados genéticamente.

Uso de embriones congelados descongelados para la producción de alta eficiencia de ratones modificados genéticamente

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar modelos de ratón modificados genéticamente utilizando células madre embrionarias, especialmente para ADN grande knock-in (KI). Este protocolo se ajusta utilizando la edición del genoma CRISPR / Cas9, lo que resulta en una eficiencia de KI significativamente mejorada en comparación con el método convencional de orientación de ADN linealizado mediado por recombinación homóloga.

Focalización génica altamente eficiente mediada por CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias para desarrollar modelos de ratón manipulados genéticamente

El método de manipulación cervical presentado puede inducir pseudoembarazo en ratones sin necesidad de reproductoras con machos vasectomizados. La inducción del pseudoembarazo es necesaria para el éxito de la transferencia embrionaria no quirúrgica y de la inseminación artificial no quirúrgica, que también se presentan.

Inducir pseudoembarazo en ratones hembra sin necesidad de machos vasectomizados antes de la transferencia embrionaria no quirúrgica o la inseminación artificial

Aquí, presentamos un método para realizar la inyección redonda de espermatida (ROSI) en ratones, una técnica con aplicaciones clínicas prometedoras y utilidad para investigar los mecanismos subyacentes al desarrollo embrionario.

Inyección de espermatida redonda de ratón

Este artículo establece una línea para suspensiones de células individuales y núcleos de alta calidad de embriones de ratón gastrulados para la secuenciación de células individuales y núcleos.

Secuenciación de ARN unicelular de embriones enteros de ratón mutantes: desde el epiblasto hasta el final de la gastrulación

Aprende a utilizar células madre embrionarias haploides partenogenéticas como sustituto de espermatozoides para generar embriones semiclonados en ratones. Este método permite estudiar el imprinting genómico mediante manipulación gamética.

Aplicación de células madre embrionarias haploides partegenéticas del ratón como sustituto de los espermatozoides

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