CRISPR/Cas9 Edición del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando el marcador de detección co-CRISPR dpy-10 y complejos de ribonucleoproteína ensamblados.

Esta técnica es beneficiosa para introducir mutaciones precisas en C. elegans mediante la edición del genoma CRISPR/Cas9 en un corto período de tiempo. Esta técnica proporciona una manera eficiente y simplificada para editar el genoma de C. elegans, ya que el uso de un marcador Co-CRISPR mejora en gran medida la probabilidad de identificar gusanos editados positivamente. Asegúrese de practicar la realización de las microinyecciones e inyectar ambos brazos de gónadas de tantos gusanos como sea posible para aumentar las posibilidades de obtener las ediciones deseadas.

Amy Smith, Mary Bergwell, Danita Mathew, Ellie Smith y Carter Dierlam, todos estudiantes de pregrado de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. Para preparar los gusanos adultos jóvenes para la inyección, recoja C. elegans en etapa L2, L3 en un césped bacteriano fresco en una placa MYOB e incube la placa a 20 grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, prepare la mezcla inyectable como se indica en la tabla en tubos estériles sin nucleasa y mezcle mediante pipeteo.

Incubar la mezcla de inyección a 37 grados centígrados durante 15 minutos para ensamblar los complejos de ribonucleoproteínas antes de centrifugar la mezcla. A continuación, utilice un microscopio de disección para seleccionar unos 30 gusanos adultos jóvenes con menos de 10 embriones en el útero e inyecte ambos brazos de gónadas de cada gusano con unos pocos picolitros de mezcla inyectable por brazo. Después de la microinyección, utilice un aparato de recuperación para pipetear suavemente los gusanos inyectados de la almohadilla de inyección en una placa MYOB de 60 milímetros sembrada con OP50 E. coli.

Deje que los gusanos inyectados se recuperen durante una hora a temperatura ambiente. Al final del período de recuperación, use un pico de alambre de platino para transferir cada gusano inyectado a una sola placa de agar MYOB de 35 milímetros con semillas y permita que los gusanos pongan huevos a 20 grados centígrados. Después de 24 horas, transfiera los gusanos inyectados a nuevas placas individuales de 35 milímetros.

Durante tres o cuatro días después de la inyección, use un microscopio de disección para identificar las placas que tienen progenie F1 que exhibe fenotipos de rodillos, como lo indica el cuerpo del animal que gira alrededor de su eje largo a medida que los animales se mueven en un patrón circular, y fenotipos rechonchos, como lo demuestra una fisiología más corta y robusta en comparación con los animales de control en la misma etapa de desarrollo. Transfiera de 50 a 100 gusanos de rodillo F1 a sus propias placas individuales y permita que los gusanos pongan huevos durante uno o dos días. Después de uno o dos días de producción de gusanos F2, transfiera cada uno de los rodillos madre de rodillos F1 de una placa numerada a su tubo de PCR numerado correspondiente que contenga 2,5 microlitros de tampón de lisis complementado con una dilución 1:100 de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K. Congele los tubos a menos 30 grados Celsius durante 20 minutos antes de lisar los gusanos en un termociclador, como se indica.

Al final del ciclo, agregue 12,5 microlitros de mezcla de PCR 2X que contenga trifosfatos desoxinucleósidos, ADN polimerasa, cloruro de magnesio y colorante de carga, un microlitro de cebador directo de 10 micromolares, un microlitro de cebador inverso de 10 micromolares y suficiente agua estéril para llevar la mezcla de reacción a 25 microlitros por cada muestra de gusano lisada. A continuación, ejecute las muestras en el termociclador como se indica. Para detectar ediciones de menos de 50 pares de bases de longitud, transfiera 10 microlitros de cada reacción de PCR a un nuevo tubo y agregue cinco microlitros de la mezcla maestra de digestión de restricción a cada tubo.

Incubar las reacciones de digestión a 37 grados centígrados durante dos horas. Al final de la incubación, calentar y activar las digestiones con una incubación de 10 a 15 minutos a 65 grados centígrados. A continuación, cargue toda la reacción de cada tubo en un solo pocillo de un gel de agarosa del 1% al 2% y haga funcionar el gel a 110 miliamperios hasta que se logre la separación adecuada de la banda.

Al final de la carrera, visualice geles de agarosa bajo luz ultravioleta para detectar los tamaños de las bandas de ADN. Los gusanos editados positivamente mostrarán una banda adicional de ADN en el tamaño esperado debido a la edición mediante la plantilla de reparación, llevando el sitio de restricción en el locus deseado dentro del genoma del gusano. Escoja de ocho a 12 gusanos F2 de aspecto salvaje y no rodantes de las respectivas placas de gusanos rodillos F1 editadas positivamente y permita que los gusanos pongan huevos y produzcan progenie durante uno o dos días.

A continuación, identifique las líneas de gusanos homocigotos como se ha demostrado para los gusanos editados positivamente y analice los resultados de la secuenciación utilizando un software de análisis de secuencias para confirmar la presencia de la edición de acuerdo con los protocolos estándar. Aquí, se puede observar el ADN genómico y el ARN CRISPR diseñado y la plantilla de reparación para el gen c. elegans rbm-3.2. En este análisis representativo, se encontró que siete de los 73 gusanos F1 eran positivos para la edición.

Los gusanos no editados mostraron un único fragmento de ADN de 445 pares de bases en la digestión de EcoRI, mientras que los gusanos que llevaban un codón de parada prematuro en el gen rbm-3.2 exhibieron dos fragmentos en 265 y 166 pares de bases en la digestión de EcoRI. Los gusanos heterocigotos editados mostraron tres fragmentos tras la digestión de EcoRI. Se encontró que seis de los 12 gusanos F2 de los heterocigotos F1 positivos identificados eran homocigotos para la edición de interés.

El ADN genómico de una línea de gusanos editados homocigotos identificados podría usarse para establecer una reacción de secuenciación de ADN, que confirmó la presencia de la edición en su estado homocigótico. Tenga cuidado de que los reactivos de edición y los cebadores de cribado estén diseñados correctamente, y que la mezcla de inyección se prepare correctamente. Una microinyección precisa también es fundamental.

Siguiendo este procedimiento, se puede realizar una validación fenotípica de la edición, si corresponde, y un análisis de expresión génica y proteica para verificar la precisión de la edición del genoma.