Modelo microfluídico para imitar el evento inicial de neovascularización
10 de abril de 2021
Aquí, proporcionamos un chip microfluídico y un sistema microfluídico de circulación automáticamente controlado y altamente eficiente que recapitula el microambiente inicial de neovascularización, permitiendo que las células endoteliales (ECs) sean estimuladas por un alto estrés esquilar luminal, nivel fisiológico de flujo transendotelial y diversa distribución del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) simultáneamente.
Neovascularización, la generación de nuevos vasos sanguíneos es un proceso altamente regulado tanto en eventos normales como patológicos. Para entender mejor la neovascularización, es importante reconstruir el proceso en microambiente celular natural in vitro. Hemos desarrollado un chip microfluídico y un control automático.
Las circulaciones altamente eficientes se realizan para formar microtubatos de perfusión y simular el uso de la proteína para recapitular al evento inicial de nueva vascularización. El chip de germinación microfluídica consistió en tres canales. Un canal de cultivo celular endotelial y un canal líquido fueron separados por un amplio canal central de hidrogel.
El sistema de control microfluídico consistía en una bomba de microsyringe y una válvula de pellizco electromagnético. Un chip trampa de burbujas, un chip de brote microfluídico, una bomba micro-peristáltica y un depósito medio de cultivo. Con un sistema microfluídico, las células endoteliales podrían ser estimuladas por un alto estrés de cizalladura luminal, nivel fisiológico de flujo transendotelial y varias distribuciones de factores de crecimiento endotelial vascular simultáneamente.
Pipeta 20 microlitros de 125 microgramos por mililitro de fibronectina en un puerto de inyección de medios del canal de cultivo celular. Corte una punta de pipeta para adaptarse al puerto del canal de cultivo celular con tijeras. Inserte la punta de la pipeta en el otro puerto de inyección de medios del canal de cultivo celular.
Luego, pipeta fuera del aire del canal de cultivo celular para llenarla de fibronectina. Incuba las virutas a 37 grados centígrados durante una hora. Antes de la siembra celular, pipeta 20 microliter de células endoteliales medio en cada puerto de inyección de medios e incubar los chips a 37 grados Celsius durante 30 minutos.
A continuación, pipetear todos los medios en todos los puertos de inyección de medios. A continuación, pipetear cinco microlitros de suspensión celular en un puerto de inyección de medios del canal de cultivo celular. Luego, las células endoteliales se extendieron rápidamente por todo el canal bajo presión hidrostática diferencial.
Agregue entre cuatro y seis microlitros de medios ECM al otro puerto para ajustar la presión hidrostática y detener el movimiento de la célula. Control remoto de las virutas a la incubadora de celdas. Luego, gire los chips cada 30 minutos hasta que las células endoteliales se cubran alrededor de la superficie interna del canal de cultivo celular, dos horas más tarde.
Utilice la punta de la pipeta para eliminar las células conectadas en los puertos de inyección con mucho cuidado. A continuación, inserte cuatro adaptadores Luer hembra de púas en los puertos de inyección de medios y rellene con medios ECM. Retire los chips a la incubadora de celdas, cambie los medios ECM y los adaptadores Luer cada 12 horas.
Para ensamblar el sistema de control microfluídico, prepare dos tubos de politetrafluoroetileno, dos tubos cortos de silicona, tres tubos largos de silicona, un adaptador luer hembra de púas, un conector tipo Y y, a continuación, tres conectores tipo L. Llene la jeringa con 10 mililitros de medio ECM precalentado. Conecte un tubo de politetrafluoroetileno a la jeringa mediante un adaptador luer hembra de púas.
A continuación, conecte el otro extremo del tubo de politetrafluoroetileno a un conector de tipo Y. A continuación, conecte dos tubos largos de silicona a los otros dos extremos del conector tipo Y. Utilizamos un tubo para conectarlo al depósito y al otro tubo para conectarlo al chip trampa de burbujas.
Conecte otro tubo largo de silicona al depósito. A continuación, utilice dos tubos cortos de silicona para conectar todos los orificios de entrada y salida en la capa superior del chip trampa de burbujas. Conecte un tubo de politetrafluoroetileno al back-end del chip.
A continuación, fije una jeringa en la bomba de microsyringe. Recorte dos tubos largos de silicona en la válvula de pellizco electromagnético. A continuación, cambie la válvula de pellizco electromagnético para abrir la tubería entre la jeringa y el depósito.
Inyecte los medios en el depósito utilizando una bomba de microsyringe para agotar el aire en el tubo. A continuación, vuelva a cambiar la válvula para abrir la tubería entre la jeringa y el chip trampa de burbujas. Inyecte medios para llenar la cámara líquida y el tubo back-end del chip trampa de burbujas.
Saque las virutas de brote endotelial de la incubadora de células y, a continuación, retire los adaptadores Luer en el lado del cultivo celular. Inserte dos tapones de tubería en los puertos de inyección de hidrogel de chip de brote microfluídico. Conecte el tubo back-end del chip trampa de burbujas a un puerto del canal de referencia celular.
Inserte un conector tipo T en el otro puerto y conéctelo a un tubo de silicio largo conectado con el depósito. Corta el tubo largo de silicona en la bomba micro peristáltica. A continuación, inserte un filtro de aire en el depósito.
A continuación, ensambla el chip microfluídico para la incubadora de la parte superior del escenario. A continuación, conecte la bomba de vacío a los agujeros de la capa inferior del chip trampa de burbujas mediante un tubo TPU. Ajuste el volumen de circulación opuesto y un caudal en el programa personalizado que controla simultáneamente la bomba de microsyringe y la válvula de pellizcar electromagnética.
A continuación, configure el caudal de la bomba micro peristáltica. Encienda la bomba de microsyringe. A continuación, se establece el sistema de control de circulación.
Probamos la función de barrera de algunos micro-recipientes en nuestro modelo midiendo el coeficiente de permeabilidad diffusional de 40 kDa F-I-T-C dextrina. Como se muestra en la figura, el coeficiente de permeabilidad diffusional del chip de cultivo estático con revestimiento celular es de 0,1 más o menos 0,3 micrómetros por segundo. Y el coeficiente de permeabilidad diffusional del canal vacío sin revestimiento celular es de 5,4 más o menos 0,7 micrómetros por segundo.
El ensayo de brotes endoteliales mostró que las células endoteliales brotaron en el hidrogel central en gran parte después de 24 horas de cultivo estático, mientras que el grado de brote disminuyó significativamente con el aumento del estrés de cizallamiento luminal. Cuantitativamente, el estrés de cizallamiento luminal disminuyó significativamente el brote endotelial en términos de área de brotes, longitud media de brotes y la longitud de brote más larga. Con nuestro sistema, el estrés cizallador en las células endoteliales podría cambiarse opcionalmente en cualquier momento durante el experimento, mientras que el flujo transendotelial se mantuvo a nivel fisiológico.
Este modelo biomimético 3D in vitro se puede aplicar directamente al estudio del mecanismo de neovasularización, y mantiene la promesa potencial como una plataforma de bajo costo para aplicaciones de detección de fármacos y toxicología.
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Resumen
Este artículo presenta el desarrollo de un modelo microfluídico 3D in vitro que replica las etapas iniciales de la neovascularización en condiciones fisiológicas. El modelo, denominado MIEN, integra un chip microfluídico de brotación y un sistema de circulación automatizado para simular el microentorno biomecánico y bioquímico de las células endoteliales (ECs) durante la neovascularización temprana. Esta plataforma permite un control preciso del estrés cortante luminal, el flujo transendotelial y los gradientes del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), proporcionando una herramienta valiosa para estudios mecanicistas y cribado de fármacos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología vascular
- Ingeniería de tejidos
- Microfluídica
Antecedentes
- La neovascularización es la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir del sistema vascular preexistente, un proceso crucial en contextos fisiológicos y patológicos.
- El microentorno inicial que experimentan las células endoteliales durante la neovascularización difiere significativamente de las etapas posteriores.
- Los modelos existentes a menudo no logran imitar con precisión las condiciones bioquímicas y biomecánicas tempranas de la neovascularización.
- Existe una necesidad de sistemas in vitro que recapitulen estos eventos iniciales para la investigación mecanicista y traslacional.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un modelo in vitro tridimensional que simule el proceso inicial de neovascularización bajo condiciones fisiológicas del microentorno.
- Permitir la aplicación controlada de estrés cortante, flujo transendotelial y gradientes de VEGF a las células endoteliales.
- Proporcionar una plataforma adecuada para estudios mecanicistas y cribado de fármacos/toxicología.
Métodos Utilizados
- Elaboración de un chip microfluídico de brotación con tres canales: un canal de cultivo de células endoteliales, un canal central de hidrogel y un canal líquido.
- Recubrimiento de los canales con fibronectina y siembra de células endoteliales para formar un endotelio confluyente.
- Ensamblaje de un sistema de control microfluídico automatizado que incluye bombas de jeringa y peristálticas, trampa de burbujas y control de flujo programable.
- Aplicación de esfuerzo cortante luminal controlado, flujo transendotelial fisiológico y gradientes de VEGF.
- Evaluación de la función de barrera del vaso mediante ensayos de permeabilidad con dextrano-FITC.
- Cuantificación del brotamiento endotelial bajo condiciones variables de esfuerzo cortante.
Resultados principales
- El modelo formó con éxito microcanales perfusables y endotelializados que imitan la neovascularización temprana.
- La función de barrera se demostró mediante coeficientes de permeabilidad bajos en canales revestidos con células en comparación con canales vacíos.
- Se observó brotamiento endotelial hacia el hidrogel tras 24 horas de cultivo estático.
- El aumento del estrés cortante luminal redujo significativamente la extensión y longitud del brotamiento endotelial.
- El sistema permitió la modulación dinámica del estrés cortante manteniendo simultáneamente un flujo transendotelial fisiológico.
Conclusiones
- El modelo MIEN recapitula eficazmente el microentorno inicial de la neovascularización in vitro.
- El estrés cortante es un regulador clave del brotamiento endotelial en este contexto.
- Esta plataforma es prometedora para estudios mecanicistas de la neovascularización y como una herramienta de bajo costo para la selección de fármacos y toxicología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La modelización de la neovascularización en estadios iniciales es fundamental para reducir los riesgos asociados a las hipótesis sobre dianas vasculares y optimizar la confianza predictiva en las líneas de descubrimiento de fármacos. La plataforma microfluídica MIEN permite una simulación precisa del microentorno vascular inicial, facilitando la interrogación mecanicista y la evaluación cuantitativa de las respuestas endoteliales. Esta capacidad mejora la continuidad traslacional y orienta la selección de carteras para terapias dirigidas a vasos sanguíneos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite reducir el riesgo mecanicista de dianas vasculares mediante la replicación de gradientes fisiológicos de estrés cortante y de VEGF.
- Apoya la validación funcional del comportamiento de las células endoteliales en condiciones microambientales controladas.
- Facilita una mayor confianza predictiva en hipótesis tempranas de biología vascular.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona una plataforma de ensayo 3D estandarizada y reproducible para evaluar los efectos de compuestos sobre la formación de brotes endoteliales.
- Genera resultados cuantitativos, como coeficientes de permeabilidad y métricas de brotación, para comparaciones rigurosas.
- Permite la realización de cribados a gran escala de candidatos a fármacos y perfiles de toxicología en un contexto fisiológicamente relevante.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relaciona hallazgos in vitro con mecanismos vasculares relevantes para la enfermedad, mejorando las estrategias traslacionales de biomarcadores.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la modelización de eventos tempranos de neovascularización.
- Reduce la ambigüedad biológica en las decisiones de avance preclínico para programas dirigidos a vasos sanguíneos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El modelo MIEN se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al permitir la verificación de hipótesis, la selección cuantitativa y la validación mecanicista de dianas vasculares.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías y la reducción de riesgos biológicos mediante la manipulación controlada del microentorno.
- Selección: Proporciona métricas cuantitativas y reproducibles para la evaluación de compuestos y la normalización de ensayos.
- Análisis: Ofrece lecturas de permeabilidad y brotamiento para comparar condiciones experimentales y apoyar la toma de decisiones.
- Investigación Translacional: Conecta los conocimientos mecanicistas in vitro con modelos vasculares preclínicos cuando se alinean con la relevancia de la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para diversas aplicaciones en biología vascular y selección de fármacos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos vasculares.
- Valor operativo: Estandariza los ensayos endoteliales y favorece la reproducibilidad entre equipos de I+D.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar proyectos y mejora la eficiencia del capital al reducir riesgos en programas vasculares de etapas iniciales.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos dirigidos a objetivos vasculares.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microfluídica, cultivo de células endoteliales y análisis de ensayos cuantitativos.
- Necesita acceso a bombas programables, chips microfluídicos e infraestructura de imagen.
- Exige estandarización entre equipos en el montaje del ensayo y la interpretación de datos.
- Puede ser necesaria una adaptación para diferentes fuentes de células endoteliales o modelos de enfermedad.
- Las limitaciones incluyen restricciones en el rendimiento y la necesidad de formación técnica especializada.
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