Procedimientos de gonadectomía y muestreo de sangre en el modelo de teleósto de tamaño pequeño japonés Medaka (Oryzias latipes)

Este método ayudará a responder preguntas clave sobre la función fisiológica de las gónadas, incluido el papel de los esteroides sexuales en la plasticidad y regulación del sistema neuroendocrino en los teleósteos y, en mayor medida, en los vertebrados. Este protocolo permite realizar la gonadectomía con una alta tasa de éxito en teleósteos de pequeño tamaño, que es ampliamente utilizado en la comunidad investigadora. Para tener éxito y lograr una alta tasa de supervivencia, esta técnica requiere un entrenamiento adecuado, particularmente en la evaluación de las gónadas y la sutura de los peces.

Comience sacando al pez de la solución anestésica y colocándolo horizontalmente de lado bajo un microscopio de disección. Para realizar la ovariectomía en las mujeres, raspe las escamas en el área de la incisión. Realice suavemente una incisión de dos a 2,5 milímetros entre las costillas y las aletas pélvicas y anales con una cuchilla de afeitar.

Pellizque suavemente el abdomen del pez mientras saca los ovarios con pinzas finas con una punta ancha. Es importante evitar romperse las costillas, lo que puede causar la muerte. Corta el extremo de los ovarios con las pinzas finas y déjalos a un lado.

Para realizar la orquidectomía en hombres, haga una incisión entre las costillas por encima del ano y abra la incisión lentamente con pinzas finas. Agarre suavemente los testículos con las pinzas y sáquelos lentamente. A continuación, corta el extremo de los testículos para eliminarlos por completo.

Después de realizar el procedimiento, sutura la incisión de manera similar para hombres y mujeres. Coloque el hilo de nailon al lado del área de la incisión y apuñale la piel desde el lado derecho de la incisión a través de la cavidad interna del cuerpo, usando pinzas ultrafinas para introducir el hilo. Luego, perfore la piel desde el lado izquierdo de la incisión a través de la cavidad exterior del cuerpo para sacar el hilo.

Cierre la abertura de la incisión, haga dos nudos y corte el exceso de hilo. Coloque los peces en el agua de recuperación isotónica y déjelos allí durante al menos 24 horas antes de transferirlos al sistema de acuario. Ensamble el cajón de sangre colocando una aguja de vidrio en el capilar de silicona.

Rompa la punta de la aguja con pinzas de punta ancha y cubra el interior de la aguja con una solución anticoagulante succionando y soplando. Dirija la aguja hacia el área del pedúnculo del pez, apuntando a la vena caudal del pedúnculo, y extraiga la sangre con la boca hasta que se llene al menos 1/4 del volumen total de la aguja. Suelte la aguja y coloque un trozo de cinta adhesiva cerca del lado afilado.

Coloque una tapa con un orificio en un tubo de recolección y coloque la aguja dentro del tubo a través del orificio con la punta de la aguja en el exterior. Coloque los peces en el agua de recuperación y déjelos allí durante al menos 24 horas antes de transferirlos al sistema de acuario. Haga girar la sangre durante uno o dos segundos a 1.000 veces G para recoger la sangre en el tubo.

La tasa de supervivencia después de la ovariectomía, o OVX, en las mujeres fue del 100% y del 94% en los hombres después de la orquidetomía. Todos los peces sobrevivieron al procedimiento de muestreo de sangre. Las hembras operadas simuladamente mostraron la posición de OV.

Todos los óvulos fueron fertilizados y procedieron al desarrollo embrionario. Cuando el procedimiento de gonadectomía se realizó correctamente, la forma del cuerpo del pez cambió ligeramente y no quedaron trozos de gónada. La incisión y la sutura desaparecieron por completo cuatro semanas después de la gonadectomía.

Después de cuatro meses, todos los peces seguían mostrando un fenotipo sano y no se encontró tejido gonadal. El análisis de sangre en las hembras reveló que el nivel de E2 en los peces OVX era significativamente más bajo que en los peces operados simuladamente 24 horas después de la cirugía. Después de cuatro meses, el nivel de E2 en los peces OVX seguía siendo significativamente más bajo que en los peces operados por simulación.

Los peces parcialmente OVX, donde solo se extrajo de 1/3 a 1/2 de la gónada, mostraron niveles de E2 significativamente más bajos que los peces operados simuladamente, y niveles de E2 significativamente más altos que los peces OVX completos. La concentración de 11-KT en los machos orquidectomizados fue significativamente menor que en los peces operados simuladamente 24 horas después de la cirugía. Después de cuatro meses, el nivel de 11 KT seguía siendo más bajo que en los peces operados simuladamente.

Los peces parcialmente orquidectomizados mostraron niveles más bajos de 11-KT que los peces operados simuladamente y niveles más altos que los peces completamente orquidectomizados. Para garantizar que el procedimiento sea exitoso, es esencial extraer la gónada con el mayor cuidado y completitud posible, sin dañar otros órganos dentro del pez. Dado que se sabe que los esteroides sexuales juegan un papel importante en la plasticidad del cerebro y las células pituitarias, esta técnica proporciona una poderosa herramienta para investigar los mecanismos subyacentes en pequeños modelos de teleósteos.