Name: Modelado in vitro para enfermedades neurológicas utilizando la conversión directa de fibroblastos a células progenitoras neuronales y la diferenciación en astrocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprenda a convertir fibroblastos de piel humana en células progenitoras neuronales y astrocitos inducidos para modelar enfermedades neurológicas. Este protocolo rápido permite estudiar mecanismos de neurodegeneración y probar medicamentos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a todos los pacientes y voluntarios sanos por donar muestras críticas a estudios de investigación. Además, agradecemos a Rochelle Rodrigo por su continua asistencia técnica experta en cultivo de tejidos y a Laura Ferraiuolo por confirmar de forma independiente la técnica en su laboratorio como colaboradora. Este trabajo recibió fondos de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos Subvenciones R01 NS644912-4 y RC2 NS69476-01 (a A.L.S.) y packard Centro para la ALS Research Grant P2ALS y la Fundación Helping Link. K.M. también recibió fondos de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias, así como el Premio al Desarrollo de Jóvenes Investigadores de la Asociación de Distrofia Muscular, the Rett Syndrome Research Trust y las familias de las fundaciones SCN2A.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Medio</td>
			<td>Reactivo</td>
			<td>Cantidad a mezclar</td>
			<td>Concentración final (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Medios de fibroblastos</td>
			<td>DMEM, glucosa alta, GlutaMAX</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td>Suero fetal bovino</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiótico-Antimicótico</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Medios base</td>
			<td>DMEM/F12 + Glutamax</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>97</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-2</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-27</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiótico-Antimicótico</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Medios de conversión</td>
			<td>Medios base</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>99.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>0,02 (20 ng/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>FEAG</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>0,02 (20 ng/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparina</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>0,1 (5 μg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Medios de células progenitoras neuronales (NPC)</td>
			<td>DMEM/F12 + Glutamax</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>96.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-2</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-27</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiótico-Antimicótico</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF</td>
			<td>10 uL</td>
			<td>0.002</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Medios de astrocitos</td>
			<td>DMEM, glucosa alta, GlutaMAX</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>89</td>
		</tr>
<tr>
<td>Suero fetal bovino</td>
			<td>50 mL</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antibiótico-Antimicótico</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-2</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Los medios deben filtrarse después de mezclar todos los componentes. Los medios de conversión (con factores) deben prepararse frescos cada semana.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Recetas de medios para todos los tipos de células incluidos en el protocolo. Los medios deben filtrarse después de mezclar todos los componentes con un sistema de filtración al vacío estéril para grandes volúmenes o jeringa y filtros de jeringa de 0,2 um. Los medios de conversión (con factores) deben prepararse frescos cada semana.
1. Conversión directa de fibroblastos humanos adultos a células progenitoras neuronales
NOTA: Una línea de tiempo esquemática de este protocolo se puede revisar en Meyer (2014)19.
<ol><li>Utilizar fibroblastos primarios de la piel humana que pueden obtenerse de bancos celulares o biopsias de piel31. Cultivar células a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos de CO2 al 5%. Las células de paso durante al menos 1-2 pasajes después de la descongelación antes de su uso en el experimento. Una vez que las células estén listas, recubra un pozo de una placa de 6 pozos con fibronectina humana (1:200 diluida en PBS) a temperatura ambiente durante 15-20 min.</li>
	<li>Cuando las células estén listas para ser plateadas, retire la fibronectina del plato y agregue inmediatamente la solución celular o 2 mL de medio fibroblasto(Tabla 1)- no deje que el plato se seque antes de agregar el medio. Dependiendo de qué tan rápido crezcan las células, placa 150,000 (crecimiento rápido) - 200,000 (crecimiento lento) fibroblastos en dos pozos de una placa de 6 pozos recubierta de fibronectina humana cada uno. NOTA: Las células deben estar alrededor del 70% confluyentes para la transducción viral para poder mantenerlas en la misma placa durante varios días más después de la transducción. Puede ser beneficioso sembrar en dos densidades diferentes para tener una opción al día siguiente para la conversión.</li>
	<li>Al día siguiente de la siembra, compruebe los fibroblastos bajo el microscopio y verifique la densidad celular (entre el 70-85%) e incluso sembrando en todo el pozo para obtener resultados óptimos.</li>
	<li>Transducir un pozo con los cuatro vectores retrovirales (Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc) - use una multiplicidad de infección (MOI) de 10 para fibroblastos de crecimiento rápido o 15 para fibroblastos de crecimiento lento (la eficiencia de transducción debe exceder el 70% o más de células positivas para cada vector). Agregue el medio de fibroblastos regular a la mezcla viral a un volumen total de 1 mL por pozo e incube durante la noche a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos al 5% de CO2. Deje el segundo pozo sin tratar y devuelva las células a la incubadora de cultivo de tejidos. NOTA: Los vectores retrovirales pueden ser comprados por un proveedor o hechos internamente, los protocolos están disponibles en línea32.</li>
	<li>Al día siguiente de la transducción, lave las células 1x con PBS y agregue 1 mL de medio fibroblasto fresco.</li>
	<li>Al día siguiente, cambie el medio a medio de conversión. Lave las células 1x con PBS para deshacerse del medio de fibroblastos residual, y luego agregue 1 mL de medio de conversión. Cambie los medios del pozo no tratado a medios de conversión también. NOTA: Algunos cambios morfológicos se pueden observar incluso cambiando los medios en los fibroblastos que no recibieron tratamiento con vectores retrovirales, por lo que tener un pozo no tratado (opcional) será útil para determinar los efectos de los vectores virales. Las células deben comenzar a cambiar la morfología 2-4 días después de cambiar a medios de conversión.</li>
	<li>Observar las células bajo el microscopio y observar los cambios en la morfología (Figura 1). Los medios celulares deben ser reemplazados diariamente durante todo el proceso de conversión (1-2 mL de medios de conversión, Tabla 1)y para el cultivo posterior de iNPC. Cambie el medio eliminando cuidadosamente el 70% del medio del pozo mientras se asegura de que las células permanezcan cubiertas en el 30% restante del medio. NOTA: Los medios con factores de crecimiento en él deben consumirse dentro de 1 semana de la preparación.<ol>
<li>Continúe observando las células y cambie los medios diariamente (1-2 mL de medios de conversión).</li>
		<li>Algunas líneas celulares comienzan a formar formaciones redondas elevadas sueltas que crecen en estructuras similares a bolas o esferas neuronales sueltas(Figuras suplementarias 1 y 19,33). Tenga cuidado de no desprenderse de estas células. Si las bolas se desprenden, se pueden recoger y volver a platear en un nuevo pozo recubierto de fibronectina de una placa de 6 pozos. NOTA: Si se expanden por sí solas, las células tendrán una diversidad reducida en comparación con la placa inicial y pueden representar una línea celular claramente diferente. Se recomienda combinar estas celdas con el resto de las celdas convertidas en la siguiente ronda de división.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de unos 5-6 días en medios de conversión (hasta 12 días para líneas celulares difíciles) o cuando las células se vuelven muy densas, pasarlos 1:2 o máximo 1:3. NOTA: Es muy importante mantener las celdas en una alta densidad durante todo el proceso de conversión.</li>
</ol>2. Procedimiento de conversión y división iNPC
<ol><li>Caliente la solución del desprendimiento de la célula (e.g., Accutase) y cubra un número apropiado de pozos de un 6-well con fibronectin (1:200 en PBS, 1 mL de volumen de capa) por 15-20 minutos en la temperatura ambiente. El recubrimiento de fibronectina puede ser más largo sin impacto negativo, pero se debe tener cuidado de no acortar el tiempo de recubrimiento.</li>
	<li>Lave las células cuidadosamente con PBS sin desprender ninguna célula (use la pared del pozo para aplicar PBS suavemente a las células). Retire cuidadosamente el PBS con pipetas o por aspiración.</li>
	<li>Añadir 0,5 mL de solución de desprendimiento celular e incubar 2-3 min a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos. Compruebe bajo el microscopio para verificar que la mayoría de las células se han desprendido. Si todas las células se han desprendido, agregue 2 mL de medios de conversión frescos y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces para disociar los grupos (si es necesario).</li>
	<li>Recoja las células en un tubo de 15 mL y agregue 3 mL adicionales de medios para diluir aún más la solución de desprendimiento celular. Lave el pozo con el medio adicional primero para asegurarse de que todas las células se han recogido.</li>
	<li>Centrífuga durante 4 min a 200 x g a temperatura ambiente. NOTA: Las células de conversión o iNPCs son extremadamente sensibles a la presencia de solución de desprendimiento de células en el medio. Es absolutamente necesario eliminar la enzima residual por centrifugación y retirada del sobrenadante.</li>
	<li>Retire el sobrenadante del pellet celular y resuspend las células en 1 mL de medio fresco. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces para resolver los grupos celulares. Retire la fibronectina de los 6 pozos recubiertos y agregue 1 mL de medio fresco a cada pozo inmediatamente (no deje que la fibronectina se seque). Para una relación de división de 1:2, agregue 0.5 mL de la suspensión celular en un pozo y el otro 0.5 mL en un segundo pozo.<ol>
<li>Cultivar células a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Distribuya las células agitando suavemente los 6 pozos en dirección norte-sur-este-oeste (no circular) y ponga en incubadora de cultivo de tejidos.</li>
	<li>Observe las células bajo el microscopio al día siguiente y cambie los medios (1-2 mL). Cambie los medios todos los días hasta que las celdas estén listas para dividirse de nuevo. NOTA: En este punto, la proliferación celular debe comenzar a acelerarse, y las células deben estar listas para una segunda división dentro de 2-3 días (4 días para líneas de crecimiento muy lento).<ol>
<li>En esta nueva división, se siembra un pozo de células en medios de conversión y el otro pozo en medios NPC que contienen sólo FGF a mayor concentración sin EGF/heparina (Tabla 1). NOTA: Algunas líneas celulares alcanzan un estado estancado en los medios de conversión después de aproximadamente 10 días y cambiar a medios NPC podría ayudar con el crecimiento celular. Además, los NPCs tienen una forma más específica y más pequeña, cuando se cultivan en medios NPC19. En este punto, los iNPCs están listos para la diferenciación y el uso posterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Siga cambiando los medios (1-2 mL) de los iNPCs diariamente.<ol>
<li>Expanda los NPCs en platos de 10 cm combinando dos o tres pozos confluentes de un pozo de 6. El volumen de medios para platos de 10 cm es típicamente de 12-15 mL.</li>
		<li>En la siguiente división, expanda aún más estas células a tres o cuatro platos de 10 cm (12-15 mL de medios) para generaciones de grandes cantidades de existencias celulares. Los platos de 10 cm generalmente se dividen en 1:3 o 1:4 cada 3-4 días, dependiendo de la tasa de proliferación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Generación de astrocitos inducidos a partir de NPCs
<ol><li>Para hacer astrocitos a partir de iNPCs frescos, sembrar iNPCs (en placas recubiertas de fibronectina de 10 cm) directamente en medio de astrocitos de 10 mL(Tabla 1)para que estén alrededor del 10% de confluencia al día siguiente. Cultivar células a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos de CO2 al 5%. NOTA: La densidad de siembra recomendada suele ser de 50 μL de la resuspensión celular de un plato de NPCs de 10 cm, siempre que se diluyan a un volumen final basado en su relación de división (por ejemplo, 3 mL para una división 1:3, 4 mL para una división 1:4, etc.).</li>
	<li>Cambiar el medio (10 mL de medios de astrocitos) de los iAs tres días después del revestimiento. Mantenga las células diferenciadoras durante 5-7 días. NOTA: Los iAs no toleran bien múltiples pasajes, por lo tanto, es mejor hacer astrocitos frescos cada vez que se dividen los NPCs.</li>
	<li>Para sembrar para experimentación, divida los astrocitos usando tripsina o solución de desprendimiento celular como se describe en los pasos 2.1-2.7. Las densidades de siembra recomendadas se incluyen en el Cuadro 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tipo de placa</td>
			<td>Astrocitos por pozo</td>
		</tr>
<tr>
<td>384 pozos</td>
			<td>2500</td>
		</tr>
<tr>
<td>96 pozos</td>
			<td>10000</td>
		</tr>
<tr>
<td>24 pozos</td>
			<td>40000</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 pozos</td>
			<td>150000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2. Densidad de siembra recomendada de iAs por área de placa. Número típico de iAs sembrados para generar una monocapa en las placas de cultivo de tejidos más comunes.
4. Preparación y descongelación de porciones para la diferenciación de astrocitos de las existencias congeladas de NPC (alternativa a la etapa 3)
NOTA: Como alternativa al mantenimiento de iNPCs en cultivo, los astrocitos también se pueden producir directamente a partir de una población congelada. Para ello, los iNPCs se congelan en porciones más pequeñas. La Tabla 3 muestra los volúmenes sugeridos de congelación y descongelación para que las porciones se descongelen en un plato de 10 cm que contiene 10 mL de medios de astrocitos.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tamaño de la porción</td>
			<td>Suspensión celular (μL)</td>
			<td>Medios de congelación (μL)</td>
			<td>Volumen total (μL)</td>
			<td>Descongelación en</td>
		</tr>
<tr>
<td>4x</td>
			<td>400</td>
			<td>400</td>
			<td>800</td>
			<td>Dos platos de 10 cm</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x</td>
			<td>200</td>
			<td>200</td>
			<td>400</td>
			<td>Un plato de 10 cm</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3. Instrucciones sobre cómo porciones de iNPC para generar iAs. Proporción de medios de suspensión y congelación iNPC para generar porciones. Tenga en cuenta que la concentración final de DMSO es del 10% cuando la suspensión celular se mezcla con medios de congelación.
<ol><li>Para hacer astrocitos a partir de existencias congeladas de iNPC, retire el vial de la porción del tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido y descongele rápidamente a 37 ° C. Tan pronto como las células se descongela, pipete la solución celular en un tubo de 15 mL que contiene 5 mL de medios de astrocitos.</li>
	<li>Centrífuga durante 4 min a 200 x g y temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y resuspend en 1 mL de medio de astrocito fresco.</li>
	<li>Añadir 9 mL de medio de astrocito fresco a un plato de 10 cm recubierto de fibronectina y añadir 1 mL de solución celular. Distribuir suavemente las células en movimiento norte-sur-este-oeste. Cultivar células a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos de CO2 al 5%.</li>
</ol>

<ol><li>Leenaars, C. H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+to+human+translation%3A+a+systematic+scoping+review+of+reported+concordance+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal to human translation: a systematic scoping review of reported concordance rates.</a> Journal of Translational Medicine. 17 (1), 223(2019).</li>
<li>Rhrissorrakrai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+limits+of+animal+models+as+predictors+of+human+biology%3A+lessons+learned+from+the+sbv+IMPROVER+Species+Translation+Challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Understanding the limits of animal models as predictors of human biology: lessons learned from the sbv IMPROVER Species Translation Challenge.</a> Bioinformatics. 31 (4), 471-483 (2015).</li>
<li>Hartung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thoughts+on+limitations+of+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+%26+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Thoughts on limitations of animal models.</a> Parkinsonism & Related Disorders. 14, Suppl 2 81-83 (2008).</li>
<li>Ladewig, J., Koch, P., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveling+Waddington%3A+the+emergence+of+direct+programming+and+the+loss+of+cell+fate+hierarchies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Leveling Waddington: the emergence of direct programming and the loss of cell fate hierarchies.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (4), 225-236 (2013).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Hamada, M., Malureanu, L. A., Wijshake, T., Zhou, W., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+to+pluripotency+can+conceal+somatic+cell+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reprogramming to pluripotency can conceal somatic cell chromosomal instability.</a> PLoS Genetics. 8 (8), 1002913(2012).</li>
<li>Stricker, S. H., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+neural+lineage+elaboration%3A+Implications+for+therapeutic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of neural lineage elaboration: Implications for therapeutic reprogramming.</a> Neurobiology of Disease. 148, 105174(2020).</li>
<li>Tang, Y., Liu, M. L., Zang, T., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+Rather+than+iPSC-Based+Reprogramming+Maintains+Aging+Hallmarks+in+Human+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming Rather than iPSC-Based Reprogramming Maintains Aging Hallmarks in Human Motor Neurons.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 359(2017).</li>
<li>Kelaini, S., Cochrane, A., Margariti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+adult+cells%3A+avoiding+the+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Cloning%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of adult cells: avoiding the pluripotent state.</a> Stem Cells Cloning. 7, 19-29 (2014).</li>
<li>Kim, E., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+and+biomaterials+for+controlling+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Research%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming and biomaterials for controlling cell fate.</a> Biomaterials Research. 20, 39(2016).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+mouse+fibroblasts+to+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7838-7843 (2011).</li>
<li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+dermal+fibroblasts+into+neural+progenitor+cells+by+a+novel+cocktail+of+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors.</a> Current Molecular Medicine. 12 (2), 126-137 (2012).</li>
<li>Mertens, J., Marchetto, M. C., Bardy, C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell+reprogramming%2C+differentiation+and+conversion+technologies+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell reprogramming, differentiation and conversion technologies in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (7), 424-437 (2016).</li>
<li>Kim, J., Ambasudhan, R., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming+to+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming to neural cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (5), 778-784 (2012).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Ambasudhan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+adult+human+fibroblasts+to+functional+neurons+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions.</a> Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).</li>
<li>Kogiso, T., Nagahara, H., Otsuka, M., Shiratori, K., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+of+human+fibroblasts+into+hepatocyte-like+cells+by+defined+transcriptional+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+International%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation of human fibroblasts into hepatocyte-like cells by defined transcriptional factors.</a> Hepatology International. 7 (3), 937-944 (2013).</li>
<li>Grath, A., Dai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cell+reprogramming+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Direct cell reprogramming for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Journal of Biological Engineering. 13, 14(2019).</li>
<li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+patient+fibroblasts+demonstrates+non-cell+autonomous+toxicity+of+astrocytes+to+motor+neurons+in+familial+and+sporadic+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity of astrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (2), 829-832 (2014).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+to+Human+Induced+Neuronal+Progenitors+from+Fibroblasts+of+Familial+and+Sporadic+Parkinson%27s+Disease+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming to Human Induced Neuronal Progenitors from Fibroblasts of Familial and Sporadic Parkinson's Disease Patients.</a> International Journal of Stem Cells. 12 (3), 474-483 (2019).</li>
<li>Meyer, K., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia-neuron+interactions+in+neurological+diseases%3A+Testing+non-cell+autonomy+in+a+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Glia-neuron interactions in neurological diseases: Testing non-cell autonomy in a dish.</a> Brain Research. 1656, 27-39 (2017).</li>
<li>Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+the+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Biochemical Society Transactions. 42 (5), 1291-1301 (2014).</li>
<li>Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+and+Myelin+in+Neurodegenerative+Diseases%3A+More+Than+Just+Bystanders%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia and Myelin in Neurodegenerative Diseases: More Than Just Bystanders.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).</li>
<li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes+contribute+to+motor+neuron+death+in+ALS+via+SOD1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes contribute to motor neuron death in ALS via SOD1-dependent mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (42), 6496-6505 (2016).</li>
<li>Palpagama, T. H., Waldvogel, H. J., Faull, R. L. M., Kwakowsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+and+Astrocytes+in+Huntington%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia and Astrocytes in Huntington's Disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 258(2019).</li>
<li>Maezawa, I., Swanberg, S., Harvey, D., LaSalle, J. M., Jin, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome+astrocytes+are+abnormal+and+spread+MeCP2+deficiency+through+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome astrocytes are abnormal and spread MeCP2 deficiency through gap junctions.</a> Journal of Neuroscience. 29 (16), 5051-5061 (2009).</li>
<li>Hautbergue, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRSF1-dependent+nuclear+export+inhibition+of+C9ORF72+repeat+transcripts+prevents+neurodegeneration+and+associated+motor+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SRSF1-dependent nuclear export inhibition of C9ORF72 repeat transcripts prevents neurodegeneration and associated motor deficits.</a> Nature Communications. 8, 16063(2017).</li>
<li>Almad, A., Maragakis, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stocked+toolbox+for+understanding+the+role+of+astrocytes+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (6), 351-362 (2018).</li>
<li>Gatto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+converted+astrocytes+retain+the+ageing+features+of+the+donor+fibroblasts+and+elucidate+the+astrocytic+contribution+to+human+CNS+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly converted astrocytes retain the ageing features of the donor fibroblasts and elucidate the astrocytic contribution to human CNS health and disease.</a> Aging Cell. , (2020).</li>
<li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+into+functional+astrocytes+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts into functional astrocytes by defined transcription factors.</a> Stem Cell Reports. 4 (1), 25-36 (2015).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779(2013).</li>
<li>Pear, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transfection+methods+for+preparation+of+high-titer+retroviral+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transient transfection methods for preparation of high-titer retroviral supernatants.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 9 Unit 9 11(2001).</li>
<li>Boczonadi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+glycyl-tRNA+synthetase+impair+mitochondrial+metabolism+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in glycyl-tRNA synthetase impair mitochondrial metabolism in neurons.</a> Human Molecular Genetics. 27 (12), 2187-2204 (2018).</li>
<li>Rinaldi, F., Motti, D., Ferraiuolo, L., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+analysis+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High content analysis in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 180-191 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En resumen, la conversión directa es un método rápido y fácil para generar células progenitoras neuronales inducidas a partir de fibroblastos cutáneos de pacientes. Este método es ventajoso debido a su velocidad, así como la gran cantidad de celdas generadas que son fáciles de mantener. Además, la creciente evidencia sugiere que los métodos de reprogramación directa eliminan menos marcas epigenéticas en comparación con la tecnología clásica de reprogramación iPSC, por lo que el entorno de la enfermedad está más intacto4,7,8. La diferenciación de iNPCs a astrocitos es muy sencilla y altamente reproducible incluso entre múltiples laboratorios independientes19,29,33. Los iNPCs pueden congelarse en pequeñas porciones y descongelarse directamente para fines de diferenciación, lo que ayuda a reducir la variación entre los experimentos, ya que los números de paso se pueden mantener similares. Los astrocitos juegan un papel crucial en la progresión de la enfermedad en muchas enfermedades neurológicas y, por lo tanto, son un tipo de célula interesante para trabajar. Los astrocitos se pueden utilizar para estudios mecanicistas, estudios metabólicos o ensayos de pruebas de drogas y generalmente se cultivan como monocapas. Además, los astrocitos se pueden combinar en sistemas de co-cultivo con neuronas de ratón o humanas para evaluar el impacto de los astrocitos en la supervivencia neuronal y la morfología, los cuales son buenas lecturas para las pruebas de drogas34.
Para utilizar con éxito este protocolo, algunos puntos y limitaciones potenciales necesitan ser mantenidos en mente. Los fibroblastos de la piel humana, por ejemplo, varían mucho en su tasa de división celular, así como en la respuesta a los vectores virales. Dado que estas no son líneas celulares estandarizadas, son tan variables como la propia humanidad, cada línea es diferente. En cuanto a muchos métodos de reprogramación, es más fácil reprogramar fibroblastos que tienen una tasa de división celular moderada a rápida en comparación con las células que apenas se replican. La tasa de replicación puede verse afectada por la calidad de la biopsia de piel y el procesamiento en sí, por el número de paso de los fibroblastos, así como la manipulación. Cuando se trabaja con fibroblastos primarios de la piel, es importante no dejar que las células se vuelven demasiado densas para evitar la inducción de la senescencia. Si los fibroblastos no crecen bien, lo mejor es probar una nueva cepa o un pasaje más bajo, aunque en algunos casos, la enfermedad en sí también podría desempeñar un papel. La división celular a veces se puede mejorar mediante el uso de 15% o 20% FBS en los medios de fibroblastos en comparación con el 10% estándar.
La calidad de los vectores virales de reprogramación es de gran importancia para el éxito. En nuestras manos, los vectores retrovirales fueron más eficientes en comparación con los vectores lentivirales u otros virus no integradores; sin embargo, esto podría depender de la calidad y pureza del vector viral. Los kits retrovirales comerciales del vector especifican generalmente la concentración viral del vector y a menudo también una multiplicidad de infección para cierta variedades de células. Es importante tener en cuenta que los fibroblastos primarios difieren de la línea celular utilizada por las empresas para determinar la absorción de vectores virales. Además, incluso cuando se pide el mismo kit comercial, la variación entre lotes es común. Por otra parte, la absorción de vectores virales también varía entre las variedades de células del fibroblasto. Algunas líneas podrían ser más sensibles y, por lo tanto, las células transducidas podrían morir, mientras que otras líneas celulares podrían ser más resistentes a la absorción viral. Por lo tanto, determinar la eficiencia de transducción para una línea celular dada puede ser importante, especialmente si la línea celular está creciendo lentamente o los intentos de conversión anteriores fallaron. En nuestras manos, la mejor manera de evaluar cuánto de un vector retroviral específico se necesita para la conversión es realizar una tinción inmunofluorescente con varias diluciones del vector viral. El número de células que expresan el transgén para cada vector puede entonces ser contado, con el objetivo de una eficiencia de transducción del 70% o superior. En nuestra experiencia, mois similares se pueden utilizar para la mayoría de las variedades de células sin embargo el MOI se puede ajustar si es necesario.
Durante el proceso de conversión, es fundamental no dividir las celdas demasiado pronto. El tiempo hasta que las células estén listas para ser divididas depende de múltiples factores, incluyendo la línea celular primaria y sus características, la calidad del vector viral utilizado y la calidad de los medios. Es importante destacar que la tasa de éxito de la conversión es mucho mayor cuando las células se mantienen en alta densidad. Incluso si las células comienzan a cambiar de morfología, es mejor dejar las células en el primer pozo más tiempo que dividirlas prematuramente. Si la división ocurre demasiado pronto, la conversión puede detenerse en su progreso y llevar a las células a diferenciarse de nuevo a la forma y el comportamiento similares a los fibroblastos. Además, diluirlos demasiado pronto puede resultar en cuerpos celulares más alargados en comparación con los cuerpos celulares pequeños y compactos de los NPCs observados previamente. Por lo tanto, las primeras divisiones siempre deben ser conservadoras; es mejor mantener las células demasiado densas con una división de 1:1 o 1:2 en comparación con diluirlas demasiado. Se espera cierta muerte celular después de la división inicial. Cabe destacar que las celdas siempre se ven peor (más planas) el primer día después de la división, lo cual es normal. Los mejores juicios sobre la forma de la célula deben hacerse 2-3 días más tarde. Es importante destacar que la calidad de los factores de crecimiento y los componentes de los medios también es crucial. Es importante preparar pequeñas cantidades de medios que contengan factores de crecimiento para que los medios completamente preparados solo se utilicen durante un máximo de 5-7 días. No mantenga los medios a temperatura ambiente o 37°C durante períodos prolongados de tiempo. Use rápidamente y refrigere tan pronto como se realice el cambio de medio. Además, mantener el volumen de medios bajo en 1 mL en lugar de 2 mL puede ayudar especialmente para las líneas celulares que son más resistentes a la conversión. Si las células consumen el medio rápidamente, que se puede observar por un cambio en la forma de color del medio de rojo a amarillo (tasa de acidificación), ajuste el volumen del medio hasta 2 mL. El rápido consumo de medios de comunicación es una señal positiva y a menudo se observa en etapas posteriores de la conversión junto con una mayor proliferación.
Los NPCs también son muy sensibles a la presencia de accutase en los medios de comunicación y es muy importante mantener el tiempo de incubación de accutase corto. Recomendamos un período de incubación de 2-4 minutos, revisar las células con frecuencia bajo el microscopio para ver cuándo se han desprendido. Es esencial centrifugar las células después de la división para eliminar la mezcla de enzimas del medio. También es importante tener en cuenta el número de pasaje, ya que las líneas celulares pueden cambiar al cultivarse durante un cultivo prolongado que conduce a la alteración de los perfiles de expresión. Por lo tanto, es importante congelar muchas poblaciones de células en los primeros pasajes. Las células deben congelarse en medios 10% DMSO y 90% NPC y almacenarse a largo plazo en nitrógeno líquido. Debido a la falta de suero en este medio, es fundamental garantizar una congelación lenta utilizando cámaras de congelación y una vez congelado durante la noche, transferir inmediatamente al nitrógeno líquido. Mientras que no se realiza ninguna selección clónica en este protocolo, es posible que el cultivo y el passaging extendidos llevan a la selección natural de una población inicial de la célula con tasa favorable del crecimiento y de la supervivencia. Por lo tanto, es importante tener en cuenta el número de pasaje y el manejo al realizar experimentos. Preferimos usar pasajes más bajos para experimentos, si es posible, no superamos el paso de las líneas celulares por más de 20 veces. Dado que los NPC crecen rápidamente, un gran número de poblaciones pueden congelarse en pasajes más bajos para experimentos. Las líneas celulares con tasas de crecimiento particularmente altas tienen un mayor riesgo de acidificación de los medios. Por lo tanto, a medida que las líneas celulares crecen con diferente velocidad, la cantidad de medios podría necesitar ser ajustada en función de la proliferación. Si las células se dejan continuamente en medios altamente acidificados, puede influir en la salud de las líneas celulares de control y enfermedad. Esto hace que incluso los astrocitos sanos se vuelvan reactivos, afectando su uso en una mayor diferenciación y experimentos.
Para la diferenciación de astrocitos, es importante mantener las células en baja densidad, ya que la alta densidad evitará que las células se diferenciven y seguirán proliferando a tasas más altas. Por lo tanto, la densidad de siembra debe ajustarse para cada línea celular dependiente de su tasa de proliferación. Recomendamos probar diferentes densidades de siembra y realizar tinciones/RT-PCR con marcadores de astrocitos para asegurar una diferenciación adecuada. La calidad de los IOS se puede evaluar junto con controles saludables mediante ensayos de co-cultivo con neuronas. Siempre que la patología de la enfermedad no conduzca a un fenotipo reactivo, las neuronas deben permanecer viables en contacto con iAs durante varios días. La morfología de los astrocitos puede variar mucho entre las líneas celulares individuales y también puede verse afectada por el fenotipo de la enfermedad. Además, en enfermedades donde los astrocitos se ven fuertemente afectados, podrían mostrar un fenotipo reactivo con extensiones grandes y alargadas.

La comprensión de los mecanismos subyacentes de la enfermedad es crítica para las enfermedades neurológicas, ya que ayuda en el desarrollo de posibles estrategias terapéuticas. Mientras que los modelos animales han sido históricamente el patrón oro para la investigación de enfermedades del sistema nervioso, la traducción directa de terapias potenciales en un entorno clínico a menudo muestra un éxito limitado1,2,3. Las razones de la falta de traducción son la falta de variabilidad de los antecedentes genéticos y las mutaciones en ratones, la visualización incompleta de fenotipos de enfermedades y la variación en la sensibilidad o la dosificación de fármacos en pacientes humanos que no se muestran bien en cepas de ratón consanguíneo. Además, para muchos desordenes neurológicos raros, ningunos o pocos modelos animales están disponibles. El estudio de los mecanismos de la enfermedad directamente en los tipos de células humanas relevantes podría facilitar la investigación y mejorar la traducción a la clínica. Para los trastornos del SNC, las células humanas primarias son difíciles de recuperar y representan una fuente muy limitada, ya que las biopsias son invasivas o solo se pueden recuperar post mortem en la etapa final de la enfermedad. En los últimos 15 años, el desarrollo de la tecnología de reprogramación celular ha ampliado rápidamente la capacidad de modelar enfermedades neurológicas y neurodegenerativas humanas in vitro.
Los métodos tradicionales de reprogramación celular implican la reprogramación de fibroblastos u otros tipos de células en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) capaces de diferenciarse en tipos de células de las tres capas germinales4. Takahashi y Yamanaka fueron los primeros en demostrar que la reexpresión de cuatro factores de transcripción de células madre es suficiente para redirigir las células somáticas para convertirse en iPSCs5. Los iPSC se pueden entonces diferenciar más lejos en tipos específicos de la célula. Sin embargo, el inconveniente de este proceso es que requiere mucho trabajo y mucho tiempo generar y aislar clones estables de células madre. Las mutaciones somáticas o aberraciones específicas de la célula madre también se mantienen en el clon de células madre y pueden afectar los resultados del estudio6. Además, cada vez hay más evidencia que sugiere que el proceso de reprogramación a células madre borra valiosos cambios epigenéticos que podrían influir en los mecanismos de la enfermedad celular4,7,8. En los últimos años, los investigadores se centraron en métodos de reprogramación modificados que permiten una generación más directa de diferentes tipos de células mientras se pasa por alto el estado de las células madre pluripotentes9,10,11, 12 (revisado en 13,14). Los avances iniciales revelaron la reprogramación combinatoria in vitro de fibroblastos a cardiomiocitos15,neuronas16 y hepatocitos17 por expresión ectópica de múltiples factores de transcripción específicos del linaje o microRNAs18. Esto fue seguido por estudios que reprogramaron directamente las células para modelar trastornos neurológicos19,20. Como se mencionó anteriormente, tales protocolos de reprogramación o conversión directa tienen ventajas potenciales sobre los protocolos iPSC clásicos, incluida la velocidad y la ablación del paso de aislamiento clonal. Por otra parte, la evidencia sugiere que estos protocolos permiten mantener una mayor cantidad de información epigenética relacionada con la edad del paciente y probablemente lo mismo ocurre con los marcadores relevantes de la enfermedad7,8.
Hasta la fecha, la mayoría de las investigaciones in vitro sobre trastornos neurológicos se han centrado principalmente en las neuronas. Sin embargo, es bien sabido que otros tipos de células como los astrocitos, la microglía y los oligodendrocitos juegan un papel crítico en la patología de la enfermedad y la progresión de trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Huntington (EH), la esclerosis múltiple (EM) y otras patologías neurológicas como el síndrome de Rett (RTT), trastornos del sueño, adicción, epilepsia, trastornos de almacenamiento lisosomal, depresión, migraña y dolor patológico21,22,23,24,25,26. Los astrocitos son el tipo celular más abundante en el sistema nervioso central (SNC) y hasta hace poco, han sido ampliamente descuidados desde un punto de vista patológico7. Ahora se saben para tener un papel crítico en la apoyación de casi todas las funciones homeostáticas del CNS sano. Adicionalmente, es evidente que tienen un impacto patológico importante y son muy valiosos para comprender el mecanismo de la enfermedad y evaluar las estrategias terapéuticas19.
En la descripción actual, detallamos un protocolo para la conversión directa de fibroblastos pacientes humanos en células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) utilizando vectores retrovirales que expresan los factores de reprogramación de Yamanaka (Klf4, Oct3/4, Sox2 y c-Myc) y la posterior exposición a medios neuralizantes. Estudios anteriores han utilizado diferentes combinaciones de factores transcripcionales para la reprogramación directa a las células neuronales (revisado en 14), pero los factores utilizados en el protocolo descrito están ampliamente disponibles, ya sea como plásmidos para la producción interna de vectores virales, o como disponibles comercialmente listos para ir kits de reprogramación viral. Los iNPCs resultantes se pueden diferenciar aún más en neuronas inducidas (iNs)27,oligodendrocitos (iOs)24 y astrocitos (iAS)19 para estudiar su papel en enfermedades neurológicas. Nuestro protocolo no implica la generación lenta de iPSCs que la mayoría de los protocolos disponibles utilizan para la derivación de astrocitos humanos28. Aproximadamente del 98% al 100% de los iNPCs reprogramados directamente pueden diferenciarse en astrocitos positivos para GFAP29 en comparación con solo el 2% utilizando el método de conversión directa de fibroblastos a astrocitos30. Recientemente, un estudio transcriptómico comparativo utilizando nuestro método de reprogramación descrito ha demostrado que los iNPCs reprogramados a partir de fibroblastos donantes pueden retener características de envejecimiento a nivel transcripcional y funcional similares a los astrocitos post mortem de edad comparable y los astrocitos primarios29. Así, este protocolo de la conversión es una herramienta potente para investigar mecanismos de la enfermedad y para evaluar los acercamientos terapéuticos nuevos para los desordenes neurodegenerative y neurológicos relativos a la edad.
Aquí describimos el protocolo utilizado para generar iNPCs y una mayor diferenciación en iAs, que son los más adecuados para ensayos de cribado molecular pequeños a mayor escala. Los mecanismos de la enfermedad y las pruebas de fármacos con iAs se pueden realizar utilizando diferentes metodologías como los co-cultivos con neuronas o el análisis metabólico y bioquímico. La ventaja de este sistema es la velocidad y facilidad de mantenimiento de estas líneas celulares en comparación con las iPSC. Además, los iNPCs se pueden congelar en pequeñas porciones para la diferenciación de iAs, lo que facilita las pruebas de drogas en condiciones constantes durante períodos prolongados de tiempo. En general, la comparación de números de muestra más grandes se hace posible de esta manera, lo que abre la puerta para evaluar el potencial terapéutico de los compuestos en una población de pacientes más grande y representativa.

<table><tbody><tr><td>Plato de estilo de 100 mm x 2 mm, tratamiento con cultivo celular, Corning no pirogénico</td><td>430167</td><td>cultivo de tejidos</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga con tapón de rosca cónico de 15 ml, polipropileno copolímero</td><td>USA Scientific</td><td>1475-1611</td><td>Se utiliza para levantar y centrífugas celdas</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml USA</td><td>Scientific</td><td>1500-1811</td><td>Preparación de medios</td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Antibiótico con actividad antifúngica para la preparación</td></tr><tr><td>de medios B-27&nbsp; Suplemento (50X), sin suero</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>Para NPC y medios</td></tr><tr><td>base Viales criogénicos&nbsp; 1.2ML</td><td>Corning</td><td>CLS430658-500EA</td><td>Para congelar existencias celulares</td></tr><tr><td>DMEM, glucosa alta, GlutaMAX&nbsp; Suplemento, piruvato</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td>Para fibroblastos y medios de astrocitos</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX&nbsp; suplemento</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td>Para NPC y medios base</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438-50ML</td><td>Para congelar existencias celulares</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td>Referido en el protocolo como PBS. Para la dilución de fibronectina y el lavado celular</td></tr><tr><td>Kit de reprogramación EZ Retrovirus iPSC</td><td>ALSTEM</td><td>RF101</td><td>Retrovirus que contiene los factores de Yamanaka. El virus también se puede fabricar internamente.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, certificado</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td>Referido en protocolo como FBS. Para medios de fibroblastos y astrocitos</td></tr><tr><td>Jeringas estériles Fisherbrand de un solo uso</td><td>Fisher</td><td>14-955-461</td><td>Medios filtrantes (50 ml)</td></tr><tr><td>Heparina sal sódica de la mucosa intestinal porcina</td><td>Sigma</td><td>H3149-10KU</td><td>Referida en el protocolo como heparina. Se utiliza en los medios de conversión. Polvo diluido en agua ultrapura. Concentración final de 5000X</td></tr><tr><td>Proteína purificada de fibronectina en plasma humano</td><td>Millipore Sigma</td><td>FC010-10MG</td><td>Referida en protocolo como fibronectina, utilizada en dilución 1:200 para el recubrimiento.</td></tr><tr><td>Isopropanol (grado técnico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372A</td><td>Para la congelación de células</td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo Fisher</td><td>5100-0001</td><td>Para la congelación</td></tr><tr><td>de células N-2 Suplemento (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Para astrocitos, NPC y medios base</td></tr><tr><td>EGF humano recombinante</td><td>Preprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Referido en el protocolo como EGF, utilizado en los medios de conversión. Polvo diluido en PBS, concentración final de 1 mg/mL, almacenado en pequeñas alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>FGF humano recombinante-básico</td><td>Preprotech</td><td>100-18B</td><td>Referido en el protocolo como FGF, utilizado en NPC y medios de conversión. Polvo diluido en PBS, concentración final de 1 mg/mL, almacenado en pequeñas alícuotas congeladas</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Reactivo de Disociación Celular</td><td>Gibco A1110501</td><td></td><td>Referido en protocolo como Accutase. Se utiliza para levantar durante el proceso de conversión y NPC.</td></tr><tr><td>Sistema de filtración al vacío estéril Stericup Quick Release-GP Millipore</td><td>Sigma</td><td>S2GPU05RE</td><td>Filtración de medios</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos, 6 pocillos, fondo plano con tapa de baja evaporación</td><td>Fisher</td><td>08-772-1B</td><td>Cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo de fenol</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td>Levantamiento de fibroblastos y astrocitos</td></tr><tr><td>Filtros de jeringa Whatman Puradisc 25, 0,2 &mu; m, PES estéril</td><td>Millipore Sigma</td><td>80-2502</td><td>Medios filtrantes (50 ml)</td></tr></tbody></table>

modelado in vitro para enfermedades neurológicas utilizando la conversión directa de fibroblastos a células progenitoras neuronales y la diferenciación en astrocitos

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

La investigación sobre los trastornos neurológicos se centra principalmente en el impacto de las neuronas en los mecanismos de la enfermedad. La disponibilidad limitada de modelos animales afecta gravemente el estudio de las contribuciones específicas del tipo celular a la enfermedad. Por otra parte, los modelos animales no reflejan generalmente variabilidad en mutaciones y cursos de la enfermedad considerados en pacientes humanos. Los métodos de reprogramación para la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) han revolucionado la investigación específica del paciente y han creado herramientas valiosas para estudiar los mecanismos de la enfermedad. Sin embargo, la tecnología iPSC tiene desventajas como el tiempo, el compromiso laboral, la selectividad clonal y la pérdida de marcadores epigenéticos. Las modificaciones recientes de estos métodos permiten una generación más directa de linajes celulares o tipos específicos de células, evitando el aislamiento clonal o un estado de células madre pluripotentes. Hemos desarrollado un método de conversión directa rápida para generar células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs) de fibroblastos de la piel que utilizan vectores retrovirales en combinación con medios neuralizantes. Los iNPCs se pueden diferenciar en neuronas (iNs) oligodendrocitos (iOs) y astrocitos (iAs). La producción de iAs facilita las pruebas rápidas del mecanismo de la droga y de la enfermedad pues la diferenciación de iNPCs toma solamente 5 días. Además, los iAs son fáciles de trabajar y se generan en poblaciones puras en grandes cantidades. Desarrollamos un ensayo de co-cultivo altamente reproducible utilizando neuronas GFP + de ratón e iAs derivados del paciente para evaluar posibles estrategias terapéuticas para numerosos trastornos neurológicos y neurodegenerativos. Es importante destacar que los ensayos iA son escalables al formato de 384 pozos, lo que facilita la evaluación de múltiples moléculas pequeñas en una placa. Este acercamiento permite la evaluación terapéutica simultánea de variedades de células pacientes múltiples con el fondo genético diverso. La fácil producción y almacenamiento de iAs y la capacidad de examinar múltiples compuestos en un solo ensayo hacen que esta metodología sea adaptable para la medicina personalizada.

Este protocolo permite la generación rápida y fácil de iNPCs directamente de fibroblastos de la piel humana usando retrovirus que contienen los factores de Yamanaka. Este método permite evitar el estado de las células madre y la necesidad de selección clonal, evitando así la variación clonal. Los pasos importantes a tener en cuenta mientras las células se someten al proceso de conversión son la densidad de siembra de fibroblastos, el pH de los medios y el mantenimiento de las células en una confluencia óptima. Ejemplos de confluencia de división óptima y cambios de morfología durante el proceso de conversión se pueden encontrar en la Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig01.jpg"> Figura 1. Imágenes representativas del proceso de conversión después de agregar la mezcla retroviral de factores de Yamanaka. Los fibroblastos fueron sembrados y transducidos veinticuatro horas más adelante con los factores de Yamanaka. Dos días después del virus (DPV), los medios se cambiaron a medios de conversión. Las células fueron cultivadas en medios de conversión hasta que estuvieron listas para pasar (13 DPV). Las células fueron sembradas después del paso para alcanzar el 80% de confluencia al día siguiente (14 DPV). Los pasajes posteriores mantuvieron esta densidad hasta que las células progenitoras neuronales comienzan a dividirse rápidamente. La barra de escala es de 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Una vez completado el proceso de conversión, los NPCs mostrarán una expresión fuertemente reducida o ninguna expresión de los marcadores de fibroblastos y morfología, y expresarán los marcadores celulares específicos de NPC(Figura 2). Además, también se pueden utilizar para generar diferentes líneas celulares, como iNs, iOs e iAs.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig02.jpg"> Figura 2. Las células que se someten al proceso de conversión expresan marcadores específicos de la célula. Los fibroblastos pacientes (a), las células neuronales inducidas del progenitor (iNPCs (b) y las células inducidas de Astrocytes (iAs (c) fueron sembradas en los coverslips de cristal en una placa tratada cultura del tejido del pozo 24. Las células immunostained para: los marcadores específicos de la célula del fibroblasto (a), Vimentin (verde) y TE7 (rojo), marcador específico de la célula del iNPC (b), Nestin (rojo), y marcador nestin (verde) de la célula del iAs (c) GFAP (púrpura) y marcador Nestin (verde) del iNPC. La barra de escala es de 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En nuestra experiencia, los iAs en particular son muy valiosos para las pruebas de mecanismos de fármacos y enfermedades, ya que se pueden generar en poblaciones puras (98% o más células GFAP positivas29)en grandes números reproducibles. Los iAs se pueden diferenciar de los iNPCs tomando una pequeña alícuota de células durante la división o una porción de iNPC previamente congelada y directamente enchapado en medios de astrocitos. Consideraciones importantes durante este proceso son mantener baja la densidad de siembra inicial de los iNPCs(Figura 3 y Figura 4),ya que se ha demostrado que una alta densidad dificulta el proceso de diferenciación(Figura 4)y prestar atención adicional al pH de los medios, ya que la acidificación puede activar incluso astrocitos sanos.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig03.jpg"> Figura 3. Imágenes representativas del proceso de generación de iAs a partir de iNPCs. Los iNPCs se siembran en medios de astrocitos (Tabla 1) a una baja densidad de siembra. Una buena densidad de siembra es de aproximadamente el 10% en el primer día después de la siembra (DPS) (izquierda); sin embargo, esta densidad se puede ajustar de acuerdo con la tasa de crecimiento de las células. La morfología típica de iAs se puede observar después de 5 DPS (medio). En algunos casos, se puede observar una morfología aberrante de astrocitos, con extensiones largas y puntiagudas. Este cambio es indicativo de la activación de astrocitos y puede ser secundario al estado de la enfermedad o técnicas de cultivo incorrectas (derecha). La barra de escala es de 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62016/62016fig04.jpg"> Figura 4. La densidad de siembra de iNPC afecta la eficiencia de diferenciación de iAs. Las líneas de control iNPC se sembraron a baja (A) y alta densidad (B) en medios de astrocitos para demostrar los efectos de la densidad de siembra en la diferenciación. 5 DPS, la línea de baja densidad expresó marcadores específicos de astrocitos, mientras que la línea de alta densidad muestra una mezcla de marcadores iNPC e iAs con una marcada morfología similar a iNPC. La barra de escala es de 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/62016fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1. Cifras adicionales del proceso de conversión después de agregar la mezcla retroviral de factores de Yamanaka. Imágenes del proceso de conversión a 12 DPV (1 día antes del paso) y 19 DPV (6 días después del paso). Nótese la diferencia en la morfología entre las células antes y después del paso, en 12 células DPV tienen una morfología de estructura similar a una bola. Después de un pasaje y varios días en los medios de conversión (tabla 1) las células comienzan a mostrar una morfología similar a la de NPC. La barra de escala es de 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62016/Supplemental%201.%20Additional%20Images%20Conversion.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Se describe un protocolo para reprogramar fibroblastos derivados de la piel humana en células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs), y su posterior diferenciación en astrocitos inducidos (iAs). Este método conduce a la generación rápida y reproducible de iNPCs e iAs en grandes cantidades.

Modelado in vitro para enfermedades neurológicas utilizando la conversión directa de fibroblastos a células progenitoras neuronales y la diferenciación en astrocitos

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...

Utilizamos este protocolo para hacer células progenitoras neurales de fibroblastos de la piel del paciente y estudiar enfermedades neurológicas y neurodegenerativas. Sentimos que este protocolo tiene muchas ventajas sobre la tecnología IPS clásica, incluida la velocidad, pero también conseguir en ciertos casos un fenotipo de enfermedad más grave. Estudiamos enfermedades neurológicas y neurodegenerativas y el uso de muestras de piel nos permite evaluar realmente la diversidad de los pacientes también.Mi laboratorio está particularmente interesado en el papel de los astrocitos en las enfermedades y utilizamos los astrocitos que hacemos de los NPCs para probar medicamentos y también para estudiar los mecanismos de la enfermedad, pero también en co-cultivos con neuronas humanas y de ratón. Esperamos que este protocolo va a ser informativo y comuníquese si tiene alguna pregunta. Gracias.Use fibroblastos primarios de la piel humana que se pueden obtener de bancos celulares o biopsias de piel. Células de cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos al 5%CO2. Las células de paso durante al menos uno o dos pasajes después de la descongelación antes de su uso en el experimento.Una vez que las células estén listas, recubra un pozo de una placa de seis pozos con fibronectina humana a una concentración de 1:200 diluida en PBS a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. Prepare los medios del fibroblasto como se muestra en la tabla una. Cuando las células estén listas para ser plateadas, retire la fibronectina del plato y agregue inmediatamente la solución celular o dos milésimas de medio fibroblasto.No dejes que el plato se seque antes de añadir medios. Dependiendo de qué tan rápido crezcan las células, placa 150, 000 a 200, 000 fibroblastos en dos pozos de una placa humana de seis pozos recubierta de fibronectina. Células de cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos al 5%CO2.El día después de la siembra, revise los fibroblastos bajo el microscopio y verifique que la densidad celular esté entre 70 a 85%Transducir un pozo con los cuatro vectores retrovirales: Oct3/4, Klf4, Sox2 y c-Myc. Utilice una multiplicidad de infección de 10 para los fibroblastos de crecimiento rápido o de 15 para los fibroblastos de crecimiento lento. La eficiencia de transducción debe superar el 70% o más de células positivas para cada vector.Agregue el medio de fibroblasto regular a la mezcla viral para un volumen total de una mil por pozo. Deje el segundo pozo sin tratar y devuelva las células a la incubadora de cultivo de tejidos para incubar durante la noche. Al día siguiente de la transducción, lave las células una vez con PBS y agregue un medio de fibroblastos frescos mil.Células de cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos al 5%CO2. Al día siguiente, prepare los medios de conversión como se muestra en la tabla uno y lave las células una vez con PBS para deshacerse de los medios de fibroblastos residuales, luego agregue una mil de medio de conversión. Cambie los medios del pozo no tratado a medios de conversión también.Observe las células bajo el microscopio y observe si hay cambios en morfología. Los medios celulares deben reemplazarse diariamente durante todo el proceso de conversión con uno a dos milésimas de medios de conversión y para el cultivo posterior de iNPC. Cambie los medios eliminando cuidadosamente el 70% de los medios del pozo mientras se asegura de que las celdas permanezcan cubiertas en el 30% restante de los medios.Continúe observando las celdas y cambie los medios diariamente con uno o dos milésimas de medios de conversión. Después de unos cinco a seis días en medios de conversión o cuando las células se vuelven muy densas, pasarlos de uno a dos o máximo uno a tres. Caliente Accutase y cubra un número apropiado de pozos en una placa de seis pozos con un mil de fibronectina total diluida 1:200 en PBS durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente.Lave las células cuidadosamente con PBS sin separar ninguna célula. Utilice la pared del pozo para aplicar PBS suavemente a las células. Retire cuidadosamente el PBS con pipetas o aspirando.Añadir 500 microlitros Accutase e incubar de dos a tres minutos a 37 grados Centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos. Compruebe bajo el microscopio para verificar que la mayoría de las células se han desprendido. Si las células se han desprendido, agregue dos milésimas de medios de conversión frescos y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo de dos a tres veces para disociar los grupos.Recoger las células en un tubo de 15 mil y añadir tres mils medios para diluir aún más el Accutase. Centrífuga durante cuatro minutos a 200 G a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante de la pastilla celular y resuspend las células en un mil de medio fresco.Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo de dos a tres veces para resolver los grupos celulares. Retire la fibronectina de seis pozos recubiertos y agregue un mil de medios frescos a cada pozo inmediatamente. Para una relación de división de 1:2, agregue 500 microlitros de la suspensión celular en un pozo y los otros 500 en un segundo pozo.Distribuya las células agitando suavemente los seis pozos en dirección norte-sur este-oeste y coloque una incubadora de cultivo de tejidos de 37 grados. Observe las células bajo el microscopio al día siguiente y cambie los medios con uno o dos mils. Cambie los medios todos los días hasta que las celdas estén listas para dividirse de nuevo.Preparar medios NPC que contengan FGF a mayor concentración sin EGF o heparina como se ve en la tabla uno. En esta nueva división, sembra un pozo de células en medios de conversión y el otro pozo en medios NPC. Siga cambiando los medios de los iNPCs diariamente con uno a dos mils de medios NPC.Preparar medios de astrocitos de acuerdo con la tabla uno. Para hacer astrocitos a partir de iNPCs frescos, sembra iNPCs directamente en 10 mils de medios de astrocitos en placas recubiertas de fibronectina de 10 centímetros para que estén alrededor del 10% de confluencia al día siguiente. Células de cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos al 5%CO2.Cambie el medio con 10 mils de medios de astrocitos tres días después del revestimiento. Mantenga las células diferenciando durante cinco a siete días. Para sembrar para experimentación, divida los astrocitos usando tripsina o Accutase como se describe en el paso 2 a 2.6.Las densidades de siembra recomendadas se incluyen en la tabla dos. Las instrucciones sobre cómo porciones de iNPCs para generar astrocitos inducidos se encuentran en la tabla tres. Para hacer astrocitos de las existencias congeladas de iNPC, retire el archivo de porción del tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido y descongele rápidamente a 37 grados Celsius.Tan pronto como las células se descongela, solución de células pipeteadas en un tubo de 15 mil que contiene cinco mils de medios de astrocitos. Centrífuga durante cuatro minutos a 200 G a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y resuspend en un medio de astrocitos fresco mil.Agregue nueve mils de medio de astrocitos frescos a un plato de 10 centímetros recubierto de fibronectina y agregue una solución de mil células, distribuyendo suavemente las células en movimiento norte-sur este-oeste. Células de cultivo a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos al 5%CO2. Este protocolo permite la generación rápida y fácil de iNPCs directamente de fibroblastos de la piel humana usando retrovirus que contienen los factores de Yamanaka.Este método permite evitar el estado de las células madre y la necesidad de selección clonal, evitando así la variación clonal. Los pasos importantes a tener en cuenta mientras las células se someten al proceso de conversión son la densidad de siembra de fibroblastos, el pH de los medios y el mantenimiento de las células en una confluencia óptima. Ejemplos de cambios óptimos de confluencia y morfología durante el proceso de conversión se pueden encontrar en la figura uno.Una vez completado el proceso de conversión, los NPCs mostrarán una expresión fuertemente reducida o ninguna expresión de los marcadores de fibroblastos y la morfología y los marcadores celulares específicos de NPC. Por otra parte, también se pueden utilizar para generar diferentes líneas celulares como neuronas inducidas, oligodendrocitos, y astrocitos. En nuestra experiencia, los astrocitos inducidos en particular son muy valiosos para las pruebas de mecanismos de fármacos y enfermedades, ya que se pueden generar en poblaciones puras en grandes cantidades reproducibles.Los astrocitos inducidos se pueden diferenciar de los iNPCs tomando una pequeña alícuota de células durante la división o una porción de iNPC previamente congelada y directamente enchapado en medios de astrocitos. Las consideraciones importantes durante este proceso son mantener la densidad de siembra inicial de los iNPCs baja, ya que se ha demostrado que una alta densidad de siembra dificulta el proceso de diferenciación, y prestar atención adicional al pH de los medios, ya que la acidificación puede activar incluso astrocitos sanos. En resumen, el protocolo de conversión directa es un método muy rápido para poder hacer células progenitoras neurales a partir de muestras de piel de pacientes.Esto permite estudiar un mayor número de muestras de células al mismo tiempo y realmente observar la diversidad en el contexto de la enfermedad. Creemos que este es un ensayo muy fuerte que se puede utilizar para hacer células progenitoras neuronales, neuronas, sino también astrocitos que luego se pueden utilizar ya sea en co-cultivo o por sí mismos para pruebas de drogas o estudios mecanicistas, así.

in-vitro-modeling-for-neurological-diseases-using-direct-conversion

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video demuestra el proceso para diferenciar células progenitoras neurales inducidas (iNPCs) en neuronas y astrocitos utilizando medios especializados.

Diferenciación de células progenitoras neurales inducidas en astrocitos

Los astrocitos fenotípicamente salvajes y las células madre neurales recolectadas de ratones modificados con alelos oncogénicos condicionales floxados y transformados a través de la recombinación mediada por Cre viral se pueden utilizar para modelar la patogénesis del astrocitoma in vitro e in vivo mediante la inyección ortotópica de células transformadas en cerebros de compañeros de camada singénicos e inmunocompetentes.

Modelado astrocitoma Patogénesis In Vitro Y En Vivo Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Reprogramación neuronal directa genera neuronas que mantienen la edad de la partida de la célula somática. Aquí, describimos un método único basado en vectores para generar neuronas inducidas de fibroblastos dérmicos obtenidos de donantes humanos adultos.

Sencilla generación de una cultura de alto rendimiento de las neuronas inducidas de fibroblastos de piel humana adulta

En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

Este estudio introduce y describe protocolos para derivar dos organoides neuronales humanos específicos como un modelo relevante y preciso para el estudio de 1) desarrollo de glioblastoma humano dentro de organoides neuronales humanos exclusivamente en humanos y 2) neurona dopaminérgica diferenciación que genera un organoide tridimensional.

Organoides neuronales humanos para el estudio del cáncer cerebral y las enfermedades neurodegenerativas

Aquí informamos un método de bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para biofabricar tejidos neurales para estudiar la funcionalidad de los astrocitos en el sistema nervioso central y los mecanismos que involucran a las células gliales en enfermedades y tratamientos neurológicos.

Bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para la ingeniería de tejido neural

Describimos un método para diferenciar astrocitos y neuronas derivados pluripotentes inducidos por humanos de la médula espinal y su cocultivo para el registro electrofisiológico.

Establecimiento de una plataforma electrofisiológica para modelar la ELA con astrocitos y neuronas derivados de células madre pluripotentes humanas específicas de la región

Aquí describimos un protocolo detallado para generar cultivos altamente enriquecidos de astrocitos derivados de diferentes regiones del sistema nervioso central de ratones postnatales y su conversión directa en neuronas funcionales por la expresión forzada de factores de transcripción.

Aislamiento y reprogramación neuronal directa de astrocitos de ratón

Aprenda a convertir fibroblastos de piel humana en células progenitoras neuronales y astrocitos inducidos para modelar enfermedades neurológicas. Este protocolo rápido permite estudiar mecanismos de neurodegeneración y probar medicamentos.

Modelado in vitro para enfermedades neurológicas utilizando la conversión directa de fibroblastos a células progenitoras neuronales y la diferenciación en astrocitos (Video) | JoVE Journal

Modelado in vitro para enfermedades neurológicas utilizando la conversión directa de fibroblastos a células progenitoras neuronales y la diferenciación en astrocitos

Explorar más videos