Name: Hibridación fluorescente in situ en preparaciones de halo de ADN para revelar cromosomas completos, telómeros y loci de genes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprende a realizar hibridación fluorescente in situ en preparaciones de halo de ADN para analizar interacciones genómicas con el nucleoesqueleto. Este método económico permite visualizar territorios cromosómicos y telómeros en células cancerosas y con progeria.

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Nos gustaría agradecer al profesor Michael Bittner por el amable regalo de las sondas de pintura de brazos cromosómicos. LG recibió el apoyo del proyecto financiado por la UE EURO-Laminopathies y el Brunel Progeria Research Fund.

<ol><li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nuclear+protein+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li>
<li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li>
<li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li>
<li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Released+chromatin%3A+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li>
<li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li>
<li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li>
<li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+mapping+by+fiber-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li>
<li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+combing%3A+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li>
<li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li>
<li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface%2C+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475(2017).</li>
<li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li>
<li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+DNA+integrity+testing%3A+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Andrology%22%5BJournal%5D)">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li>
<li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively%2C+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li>
<li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR%3A+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li>
<li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li>
<li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+More+Hidden+behind+a+%27Classic+Proliferation+Marker%27%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%2C+expressing+a+novel+SUN1+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li>
<li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li>
<li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li>
<li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMPdb%3A+Database+of+nuclear+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li>
<li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li>
<li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Oncology%22%5BJournal%5D)">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li>
<li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li>
<li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+glossary%3A+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li>
<li>Bridger, J. M., Foster, H. A. Senescence and the Genome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBridger%2C+JM+%22Human+Interphase+Chromosomes%22">Human Interphase Chromosomes</a>. , Springer. New York. Ed. Ivan Iourov (2021).</li>
<li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método del halo de ADN es un excelente método de elección cuando se analizan las interacciones entre el nucleoesqueleto y el genoma, sin embargo, hay algunos pasos críticos que también deben cumplirse. Uno de los parámetros más importantes es la optimización de la densidad de siembra celular. Si las células se vuelven demasiado confluentes, entonces los halos de ADN se superpondrán con las células vecinas, lo que hará imposible realizar el análisis. El CSK y los tampones de extracción deben hacerse siempre frescos el día de su uso, añadiéndose espermina, espermidina y digitonina al tampón de extracción al final del proceso de preparación para mantener su actividad biológica. Si se realiza Halo-FISH, es extremadamente importante utilizar la temperatura de desnaturalización correcta de los halos de ADN para permitir que la sonda o la pintura se hibriden posteriormente.
La microscopía electrónica se ha utilizado para visualizar la matriz nuclear, identificándose estructuras filamentosas20. Sin embargo, la microscopía electrónica es limitada ya que las asociaciones matriciales con la cromatina no se pueden deducir fácilmente. De hecho, el método DNA Halo es más versátil en comparación con la microscopía electrónica, ya que se pueden examinar genes específicos, cromosomas y estados celulares. Además, se está estudiando el análisis proteómico de proteínas de la matriz nuclear21,22. Este método es bueno para comparar componentes de la matriz nuclear, particularmente cuando se comparan células enfermas, sin embargo, no proporciona la distribución espacial y las uniones resaltadas por la técnica estándar de ADN Halo.
Los ensayos de ADN Halo tienen limitaciones. En primer lugar, a medida que se extrae la matriz, esto solo se puede realizar en células fijas, por lo que no es posible obtener imágenes en vivo. Aunque el método DNA Halo es relativamente rápido y fácil de realizar, el proceso general puede llevar mucho tiempo cuando se tiene en cuenta el cultivo celular, la generación de sondas, Halo-FISH y el análisis.
La captura de imágenes de halos de ADN y HALO-FISH utilizando microscopía de súper resolución mejoraría en gran medida la resolución de sondas y anticuerpos específicos de ADN. Además, como los fluorocromos se pueden resolver espectralmente más fácilmente, puede ser posible utilizar varias sondas de ADN en un solo experimento, proporcionando aún más información. Las mejoras en las técnicas de biología molecular, como la captura de conformación cromosómica (3C), se han utilizado para determinar las interacciones de los loci de los genes y analizar la organización espacial de la cromatina en la célula. Los ensayos DNA Halo y 3C se pueden combinar, un término conocido como M3C23, demostrando nuevamente la adaptabilidad de la técnica DNA Halo.
Los datos originales presentados aquí son para demostrar las posibilidades de interrogación del comportamiento del genoma y cómo presentar esos datos. Con estos datos hemos demostrado que es posible determinar diferencias significativas en la unión del genoma utilizando (1) sondas de pintura cromosómica, revelando en este estudio que el cromosoma 18 es el cromosoma menos unido de los analizados (Figura 3); (2) Loci de genes con diferencias significativas entre dos loci de genes y (Figura 4) (3) Telómeros, que están menos fuertemente unidos en las células quiescentes en comparación con las células proliferantes y senescentes (Figura 5). Somos capaces de diferenciar entre células proliferantes y no proliferantes a través de la presencia del marcador de proliferación del antígeno Ki67, que es una proteína insoluble, por lo que permanece con los núcleos residuales o utilizando la incorporación de nucleótidos para resaltar las células que han pasado por la fase S dentro de un período de tiempo específico (Figura 2). Esta técnica también nos ha permitido analizar el comportamiento del genoma en células que están comprometidas en sus nucleoesqueletos, es decir, células laminopatías, y aquí y en Bikkul et al., 2018 revelamos que el genoma puede estar menos unido en comparación con las células de control y puede restaurarse cuando se trata con medicamentos específicos que mejoran el efecto de la mutación lamin A en células HGPS clásicas15. Sin embargo, mostramos nuevos datos aquí para las células HGPS AGO8466 atípicas, que carecen de una mutación de lamina A pero que contienen una forma inusual de la proteína del complejo LINC SUN1 19 en la que el cromosoma13 está menos unido (Figura 6).
HALO-FISH es un método único que permite el estudio de las interacciones genómicas con el nucleoesqueleto en combinación con inmunofluorescencia indirecta para resolver proteínas no eliminadas del procedimiento de extracción. Se ha demostrado que el nucleoesqueleto está modificado en diversas enfermedades como ciertos tipos de cáncer19 y la importancia de algunas proteínas asociadas al nucleoesqueleto como biomarcadores diagnósticos24,25. Así, esta técnica tiene un papel importante en el examen del efecto del nucleoesqueleto sobre la organización/desorganización de la cromatina en la enfermedad 15,24,25,27 y no está restringida a células humanas, con sondas de pintura cromosómica de otros animales, el mismo protocolo ADN-halo podría ser empleado 28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

La "matriz nuclear" fue descrita por primera vez por Berezney y Coffey en 19741. Después de realizar extracciones con molaridades de alta sal y tratamiento con nucleasas en núcleos hepáticos de rata, identificaron un marco estructural proteico. El procedimiento de halo de ADN se adaptó posteriormente de este método e implica la eliminación de proteínas solubles para que solo persistan la matriz nuclear (NM) y las proteínas y cromosomas asociados a NM. Las regiones de unión al ADN se encuentran en la base de los bucles de ADN y se denominan regiones unidas a la matriz (MAR) o regiones de unión a andamios (SAR), que son resistentes a la extracción con altas concentraciones de sal y detergente iónico litio-3,5-diyodosalicilato (LIS) respectivamente. En los halos de ADN, el ADN asociado con MARs/SARs está unido dentro del núcleo residual, mientras que los bucles de ADN se extienden lejos de estos sitios y forman el halo de ADN. Ahora sabemos que el genoma está anclado a través de dominios asociados a láminas (LADs) a la lámina nuclear y a través de regiones nucleolares asociadas (NADs) y posiblemente a través de otras estructuras nucleares como cuerpos nucleares específicos.
El método de halo de ADN se puede utilizar para el mapeo físico de ADN, genes y regiones cromosómicas, ya que el ADN extendido y la cromatina proporcionan una mayor resolución porque la cromatina se despoja de histonas y el ADN se estira 2,3,4,5,6. Sin embargo, existen algunas limitaciones al usar halos de ADN para esta aplicación. Por ejemplo, el ADN estrechamente asociado con núcleos residuales de halos de ADN puede ser inaccesible para las sondas, lo que lo excluye del análisis y el mapeo físico6. Otras técnicas como la fibra-FISH 2,4,5,7 y el peinado molecular8 también permiten el mapeo físico y tienen la ventaja de ser relativamente rápidos y fáciles de realizar. Ambos se utilizan preferentemente para el mapeo de ADN de genes sobre halos de ADN. Estos métodos extraen fibras de cromatina mediante el uso de extracciones de solventes o sales del núcleo, sin embargo, el peinado molecular tiende a tener mejor reproducibilidad 8,9.
Existe una creciente evidencia de que el nucleoesqueleto tiene un papel en el apoyo a procesos nucleares clave, como los sitios de unión para el ADN, la remodelación de la cromatina, la transcripción del ADN, la reparación del ADN y la replicación del ADN11,12. Como tal, la técnica del halo de ADN se desarrolló para investigar las interacciones entre el nucleoesqueleto y el genoma durante estas actividades celulares y se ha utilizado e informado rutinariamente en la investigación. Esta técnica también ha sido utilizada para investigar las interacciones entre el genoma y el nucleoesqueleto en relación con la progresión de la enfermedad con cambios asociados a la malignidad en la estructura nuclear identificados11.
La técnica del halo de ADN también ha sido utilizada para investigar la relación entre el genoma y el nucleoesqueleto durante el desarrollo y la diferenciación12. Varios estudios han utilizado una variación de la técnica de halo de ADN conocida como halosperma13 o SpermHalo-FISH si se combina con FISH14. La cromatina de los espermatozoides está estrechamente unida a proteínas conocidas como protaminas y esta técnica se desarrolló para mejorar el acceso al ADN de los espermatozoides. La halosperma se ha utilizado para investigar la integridad del ADN de los espermatozoides y determinar si hay daño en el ADN. Los espermatozoides con menos daño en el ADN se correlacionan con un tamaño de halo de ADN más grande, mientras que los espermatozoides con niveles aumentados de ADN fragmentado y dañado tenían halos pequeños o ninguno en absoluto. Por lo tanto, las halospermas se pueden utilizar como un marcador pronóstico potencial de la calidad embrionaria y el embarazo exitoso con FIV13. Este ejemplo enfatiza las posibles aplicaciones clínicas de esta técnica. En nuestro trabajo hemos utilizado HALO-FISH para evaluar los cambios en el comportamiento del genoma y el efecto de tratamientos farmacológicos específicos en la enfermedad de envejecimiento prematuro Síndrome de Progeria de Hutchinson-Gilford (HGPS)15.
Juntos, estos y otros estudios resaltan la amplitud de procesos / aplicaciones que la técnica de halo de ADN se puede utilizar para estudiar y la utilidad de la técnica.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>10388739 Se utiliza para crear halos</td></tr><tr><td>de ADN 5-bromo-2&prime;-desoxi-uridina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-100MG</td><td>Nucleótido marcado</td></tr><tr><td>5-fluoro-2&prime;-desoxiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>Agar nucleótido marcado</td></tr><tr><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific</td><td>15562141</td><td>Aislamiento de ADN de clones de BAC</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A939-50G</td><td>Compruebe el tamaño del producto de DOP-PCR y la traducción de nick</td></tr><tr><td>HGPS atípico tipo 2 fibroblastos (AG08466)</td><td>Instituto Coriell</td><td>AG08466</td><td>línea celular</td></tr><tr><td>Bacto triptona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16269751</td><td>Aislamiento de ADN de clones BAC</td></tr><tr><td>Biotina-16-dUTP</td><td>Roche Diagnostics&nbsp;</td><td>11093711103</td><td>Nucleótidos marcados:</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>C0378-25G</td>, <td>aislamiento de ADN de clones de BAC,</td></tr><tr><td>síndrome de progeria clásico de Hutchinson-Gilford (HGPS), fibroblastos (AG06297)&nbsp;</td><td>Instituto Coriell</td><td>AG0297</td><td>Línea celular</td></tr><tr><td>Frasco Coplin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12608596</td><td>Tiene capacidad para 5 portaobjetos u 8 portaobjetos espalda con espalda</td></tr><tr><td>ADN Cot-1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15279011</td><td>Block Hibridación inespecífica en agua tratada con HALO FISH</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>Aislamiento de ADN de clones de BAC</td></tr><tr><td>Sulfato</td> <td>de dextranoSigma-Aldrich</td><td>S4030</td><td>Mezcla de hibridación</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>Componente del tampón de extracción</td></tr><tr><td>Digoxigenina-11-dUTP&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11093088910</td><td>Nucleótidos marcados</td></tr><tr><td>Burro anti-ratón Cy3</td><td>Jackson Laboratory</td><td>715-165-150</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>Componente del tampón de extracción</td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>Componente del tampón de extracción</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>443611</td><td>Precipitación de sonda y HALO FISH</td></tr><tr><td>Sistema fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td>Suero de cultivo celular</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10523525</td><td>2D FISH de halos de ADN</td></tr><tr><td>Lana de vidrio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18421</td><td>Columna de centrifugado</td></tr><tr><td>Esperma de arenque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7290</td><td>Sonda de precipitación</td></tr><tr><td>HXP&trade; Lámpara (lámpara de microscopio de halogenuros metálicos)</td><td>OSRAM</td><td>HXP-R120W45C VIS</td><td>Captura de imágenes de halos de ADN</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313680</td><td>Limpieza de portaobjetos de microscopio</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-25ML</td><td>Aislamiento de ADN de clones BAC</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR Kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2103</td><td>PCR Kit</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente Leica DM4000 con cámara DFC365 FX y software de adquisición de imágenes LAS AF (Versión: 4.5.0).</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Captura de imágenes de halos de ADN</td></tr><tr><td>agar Luria-Bertani&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13274843</td><td>Aislamiento de ADN de clones de BAC</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Componente del tampón CSK</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10284580</td><td>Portaobjetos de microscopio de limpieza y esterilización</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-BrdU para ratones</td><td>BD Pharmingen</td><td>B2531-100UL</td><td>Visualización de BrdU</td></tr><tr><td>Suero</td> <td>para terneros recién nacidosThermo Fisher Scientific 16010159</td><td></td><td>Suero de cultivo celular y reactivo bloqueante</td></tr><tr><td>Kit de traducción Nick</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>Aislamiento de PCR y ADN de clones BAC</td></tr><tr><td>Imprimaciones PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPES Sigma-Aldrich</td><td></td><td>P1851</td><td>Componente de CSK y tampones</td></tr> <tr>de extracción<td>Acetato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-100G</td><td>Aislamiento de ADN de clones BAC</td></tr><tr><td>QuadriPERM&reg; 4 X 12</td><td>SARSTEDT</td><td>94.6077.307</td><td>Placa de cultivo celular cuadrada, polisterene con cuatro compartimentos. Tiene una superficie hidrofóbica, es estéril, no pirogénico y no citotóxico.</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Ki67 de conejo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1007-25UL Marcador de</td><td>proliferación</td></tr><tr><td>Rnasa A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Aislamiento de ADN de clones de BAC</td></tr><tr><td>Cemento de caucho</td><td>Halford's</td><td>101836</td><td>2D FISH de halos de ADN</td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6022-25G</td><td>Columna de centrifugado</td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>Precipitación de la sonda</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>Componente de CSK, tampones de extracción y SSC</td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td>Componente del tampón SSC</td></tr><tr><td>Sulfato de dodecilo de sodio&nbsp;</td><td></td><td>L3771-100G</td><td>Aislamiento de ADN de clones de BAC</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>Aislamiento de ADN de clones de BAC</td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>Componente del tampón de extracción</td></tr><tr><td>Spermine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4264</td><td>Componente del tampón de extracción</td></tr><tr><td>Streptavidin-Cy3&nbsp;</td><td>Amersham Life Sciences Ltd, Suministros de laboratorio científico</td><td>pa43001</td><td>Sonda anticuerpo</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Componente del tampón CSK</td></tr><tr><td></td><td>Sacarosa Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>Tampón CSK+A66:D68</td></tr><tr><td>SuperFrost&trade; portaobjetos de microscopio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12372098</td><td>Portaobjetos de microscopio: 1 mm de grosor, 76 mm de longitud, 26 mm de ancho. Sin recubrimiento.</td></tr><tr><td>Cerdo anti-conejo TRITC&nbsp;</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TELO-PNA FISH KIT</td><td>Agilent Dako</td><td>K532511-8</td><td>Delineación de telómeros</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253-100G Tampón de</td><td>columna</td></tr><tr><td>Triton&trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>Componente del tampón CSK</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10158962</td><td>Aislamiento de ADN de clones BAC</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416- 100ML</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Vectashield mountant que contiene DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>2D FISH de halos de ADN</td></tr><tr><td>Sondas de cromosomas humanos completos</td><td>Calbiochem</td><td></td><td>FISH 2D de halos de ADN</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10108202</td><td>Aislamiento de ADN de clones de BAC</td></tr></tbody></table>

hibridación fluorescente in situ en preparaciones de halo de adn para revelar cromosomas completos, telómeros y loci de genes

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

El genoma está asociado con varias estructuras dentro de los núcleos celulares, con el fin de regular su actividad y anclarla en lugares específicos. Estas estructuras se conocen colectivamente como el nucleoesqueleto e incluyen la lámina nuclear, los nucléolos y los cuerpos nucleares. Aunque existen muchas variantes de hibridación fluorescente in situ (FISH) para estudiar el genoma y su organización, a menudo están limitadas por la resolución y proporcionan información insuficiente sobre la asociación del genoma con las estructuras nucleares. El método del halo de ADN utiliza altas concentraciones de sal y detergentes no iónicos para generar bucles de ADN que permanecen anclados a estructuras dentro de los núcleos a través de regiones de unión dentro del genoma. Aquí, se extraen proteínas nucleares solubles, como histonas, lípidos y ADN que no están estrechamente unidos a la matriz nuclear. Esto conduce a la formación de un halo de ADN no unido que rodea un núcleo residual que a su vez contiene ADN estrechamente asociado con estructuras nucleares internas y proteínas resistentes a la extracción. Estas cadenas de ADN extendidas permiten una mayor resolución y pueden facilitar el mapeo físico. En combinación con FISH, este método tiene la ventaja añadida de estudiar las interacciones genómicas con todas las estructuras por las que está anclado el genoma. Esta técnica, denominada HALO-FISH, es muy versátil mediante la cual los halos de ADN se pueden acoplar con sondas de ácidos nucleicos para revelar loci de genes, cromosomas completos, satélite alfa, telómeros e incluso ARN. Esta técnica proporciona una visión de la organización y función nuclear en células normales y en la progresión de la enfermedad, como con el cáncer.

Este método de preparación del halo de ADN nos ha ayudado en nuestros esfuerzos por determinar las diferencias en el comportamiento del genoma dentro de las células jóvenes y viejas, pero también en las células derivadas de enfermedades de envejecimiento prematuro con proteínas nucleosqueléticas aberrantes15. La Figura 1 muestra ejemplos de halos de ADN donde es posible ver el borde de un núcleo residual, el ADN que queda dentro del núcleo residual y el ADN no unido que se ha enrollado en el área circundante creando un halo de ADN. También representa el análisis que muestra cómo se obtiene el núcleo residual y las mediciones NE y CTE. Es posible diferenciar entre células proliferantes y no proliferantes incorporando un nucleótido marcado como BrdU cuando las células están en fase S o empleando el marcador de proliferación diagnóstica anti-pKi67, que revela nucleolos y regiones de heterocromatina en células G117,18. Se supone que las células primarias cultivadas en suero alto sin lograr confluencia, que son negativas para los marcadores de proliferación, son senescentes. Las células primarias cultivadas en suero bajo o que se han vuelto confluentes, es decir, inhibidas por contacto que son negativas para los marcadores de proliferación, se consideran inactivas y podrían volver a entrar en el ciclo celular proliferativo dados los nutrientes y la situación correctos. Ser capaces de diferenciar entre células Ki67 positivas y negativas nos ha permitido determinar las diferencias entre los fibroblastos dérmicos humanos proliferantes, quiescentes y senescentes. La Figura 2 muestra halos de ADN de fibroblastos dérmicos humanos proliferantes creados a partir de células donde BrdU se incorporó a ellas durante la replicación del ADN, un mecanismo que no ocurre en células no proliferantes, y posteriormente teñido con anticuerpos anti-BrdU. La tinción con el marcador proliferativo anticuerpo anti-pKi67 también es visible en la Figura 2. Este es un antígeno robusto y sobrevive al protocolo FISH y, por lo tanto, puede teñirse para post-FISH y pre-montaje. Por lo tanto, las células proliferantes son positivas (rojas) para BrdU y anti-pKi67 (rojas) en la columna izquierda y las células no proliferantes, de hecho, las células senescentes en la Figura 2 se muestran en la columna de la derecha. Las señales verdes son telómeros individuales revelados con un kit PNA FISH/FITC de telómeros. La combinación de inmunofluorescencia con halos de ADN permite el análisis durante diferentes estados celulares, como se muestra en la Figura 2 cuando se investigan células proliferantes, quiescentes y senescentes. Dependiendo del anticuerpo elegido, se pueden examinar otras condiciones, como la diferenciación, el daño del ADN por irradiación, etc.
Los territorios cromosómicos también se pueden visualizar dentro de los halos de ADN utilizando FISH. Debido a que la preparación permite la bobina de ADN fuera de los núcleos, la forma del territorio cromosómico puede ser alterada, con cantidades más pequeñas o mayores del cromosoma encontradas en el halo de ADN, dependiendo del anclaje del genoma dentro del núcleo residual y sus estructuras. La Figura 3 revela un panel de halos de ADN mediante los cuales se han revelado cromosomas individuales con sondas específicas de pintura cromosómica de brazo entero (rojo) para los cromosomas 1, 13, 17 y 18. Anti-pKi67 (verde) se ha utilizado para marcar células en proliferación y su ausencia dentro del mismo cultivo, en el mismo portaobjetos, denotando células senescentes. Es muy obvio a partir de las imágenes y los datos presentados como CTE / NE que el pequeño cromosoma 18 pobre en genes es un cromosoma que tiene pocas uniones y se enrolla más lejos en el halo de ADN lejos de los núcleos residuales y está significativamente más lejos del centro de los núcleos residuales que los otros cromosomas. Sin embargo, esto también es cierto para el cromosoma 1. Utilizando el marcador proliferativo anti-pKi67 también ha sido posible comparar la proliferación con células senescentes, dentro del mismo cultivo, y en el mismo portaobjetos, y este análisis ha revelado que los cromosomas dentro de estos dos estados celulares muy diferentes no son significativamente diferentes entre sí, con respecto a la unión con las estructuras nucleares residuales.
Curiosamente, los genes también muestran diferencias estadísticamente significativas entre las células proliferantes y senescentes con respecto a permanecer dentro de un núcleo residual o estar ubicadas en el halo de ADN. La Figura 4 demuestra esto con loci de genes delineados por sondas BAC marcadas en rojo y anti-Ki67 en verde. No hay diferencias significativas entre las ubicaciones de los genes en las células proliferantes frente a las senescentes, después de una preparación de Halo de ADN. Sin embargo, hay significativamente más loci de catenina alfa 1 CTNNA1 dentro del halo de ADN que los loci de ciclina D1 CNDD1 , donde hay muy pocos. La Figura 5 muestra preparaciones de halo de ADN con telómeros en verde. El fondo se deja deliberadamente alto para permitir que las señales de los telómeros se visualicen dentro del halo de ADN. En este conjunto de células quiescentes de datos, es decir, se han incluido células que han estado hambrientas de suero durante 7 días y, curiosamente, hay significativamente más telómeros no unidos y ubicados dentro de los halos de ADN en las células quiescentes que para las células proliferantes y senescentes. En la Figura 5a se puede observar la proporción de telómeros en el halo de ADN, particularmente para la imagen 'Experimento 2'. Esto se corresponde con la Figura 5b, donde el porcentaje medio de telómeros en el halo de ADN es de aproximadamente el 17% en las células quiescentes. Existe cierta evidencia de que no todos los telómeros en las células senescentes pueden verse como algunos de ellos tal vez muy cortos.
Este método de halo de ADN ha sido exitoso para nosotros para investigar alteraciones de la interacción del genoma dentro de los núcleos en células enfermas15. La Figura 6 muestra diferencias en la unión cromosómica en fibroblastos de control primario y en células enfermas con síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford típico (mutación lamina A) y atípico, expresando una isoforma SUN1 diferente y sin mutación en laminaA 19. Los cromosomas 1 y 13 muestran diferencias estadísticamente significativas en su unión dentro de los núcleos residuales en comparación con los halos de ADN de control. La figura 6b correlaciona la posición de todo el territorio cromosómico con el núcleo residual y el halo de ADN. Los valores de 1 o menos indican que el cromosoma se encuentra dentro del núcleo residual y los valores superiores a 1 muestran cromosomas o porciones de cromosomas dentro del halo de ADN.
En general, esto resalta la utilidad de HALO-FISH en la investigación de las interacciones genómicas de cromosomas completos, genes específicos y telómeros bajo una variedad de condiciones que afectan el ciclo celular (proliferación, quiescencia y senescencia) o dentro de las células de la enfermedad, por ejemplo, progeria y líneas celulares cancerosas. De hecho, las diferencias en las interacciones entre estos estados implican que el nucleoesqueleto tiene un papel importante en la regulación de procesos clave dentro del núcleo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig01.jpg"> Figura 1: Núcleo extraído de HDF que muestra el núcleo residual y el halo de ADN y una descripción general del método de análisis. (a) Un núcleo HDF preparado mediante ensayo de halo de ADN y teñido con DAPI. El núcleo residual brillantemente teñido muestra ADN anclado al nucleoesqueleto y este está rodeado por el ADN no unido que forma un halo de ADN. Ampliación = x 100; barra de escala 10 μm. (b) El canal azul captura el núcleo teñido de DAPI y el ADN circundante. El núcleo residual se selecciona y se elimina mediante ImageJ. La flecha representa la distancia desde el centro nuclear hasta el borde nuclear residual (NE). (c) El canal rojo muestra la señal de la sonda. d) La imagen denominada «Resultado» es el resultado de la superposición del canal rojo sobre la imagen del canal azul; esto permite la distancia desde el centro nuclear hasta el borde del territorio cromosómico más lejano (CTE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig02.jpg"> Figura 2: Preparación del halo de ADN con telómeros PNA FISH en HDFs proliferantes y senescentes. Telómero PNA FISH en HDFs sometidos a ensayo de halo de ADN. Las señales de los telómeros se visualizan en verde (FITC), el ADN residual y de halo se teñó con DAPI (azul) y los núcleos proliferantes se detectaron utilizando anticuerpos anti-BrdU o anti-pKi67 a través de inmunofluorescencia indirecta en rojo (TRITC). Ampliación = x 100; Barra de escala 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig03.jpg"> Figura 3: Interacciones nucleoesqueleto-cromosoma y análisis mediante ensayo de halo de ADN. (a) Se realizó 2D-FISH con sondas específicas para los cromosomas 1, 13, 15, 17 y 18 en HDF sometidos a preparación de halo de ADN. Se pintaron cromosomas enteros en rojo (Cy3) y los núcleos se sondearon con pKi67 para determinar si estaban proliferando o eran senescentes. Las células en proliferación (pKi67+) se delinearon en verde (FITC), mientras que las células senescentes permanecieron sin teñir (pKi67-), es decir, no se detectó ninguna señal verde. Ampliación = x 100; barra de escala 10 μm. (b) Anclaje cromosómico por el nucleoesqueleto en HDF proliferantes y senescentes que habían sido sometidos a HALO-FISH. Las mediciones muestran la relación entre el borde del territorio cromosómico más lejano (CTE) y el borde nuclear respectivo (NE) para los cromosomas 1, 13, 15, 17 y 18 en células en proliferación (pKi67+) y senescentes (pKi67-). Las barras de error representan ± SEM. (c) Representación modificada del diagrama de caja del borde del territorio cromosómico (CTE) al borde nuclear respectivo (NE) de cromosomas específicos en núcleos pKi67+ y pKi67-. Q1 = cuartil inferior; Min = valor más bajo registrado; Med = mediana; Max = valor máximo registrado; Q3 = cuartil superior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig04.jpg"> Figura 4: Interacciones específicas de genes en HDFs usando HALO-FISH. (a) Los núcleos extraídos del halo de ADN se sondearon con sondas específicas de genes (CCND1 y CTNNA1) para investigar su anclaje al NM en células proliferantes y senescentes. Las señales genéticas se muestran en rojo (Cy3) y anti-pKi67 representa células en proliferación y la señal se visualiza en verde (FITC). Para la imagen CCND1 en proliferación, el núcleo residual está encerrado dentro del círculo blanco, y el espacio entre el círculo blanco y verde representa el halo de ADN. Ampliación = x 100; barra de escala 10 μm. (b) Las señales específicas de genes para CCND1 y CTNNA1 se comparan entre el núcleo residual y el halo de ADN, y también, entre las células en proliferación y senescentes. Las barras de error representan ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig05.jpg"> Figura 5: Ensayo de halo de ADN en HDF quiescentes sondeados con telómeros PNA-FISH. (a) La quiescencia de las HDF fue inducida por cultivo en medio sérico bajo durante 7 días. Se realizó el ensayo de halo de ADN, y PNA-FISH permitió la visualización de los telómeros por señal FITC (verde) y el núcleo residual y el halo de ADN circundante se contrastaron con DAPI (azul). Las células también se tiñeron con anticuerpos anti-pKi67 para garantizar que los núcleos no proliferaran. Esto se repitió en dos ocasiones distintas. Ampliación = x 100; barra de escala 10 μm. (b) Comparación del porcentaje medio de telómeros localizados dentro del halo de ADN en células HDF proliferantes, senescentes y quiescentes. Las barras de error representan ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig06.jpg"> Figura 6: Examen del anclaje cromosómico completo al nucleoesqueleto en células HGPS utilizando HALO-FISH26. (a) Los núcleos de control HDF (2DD), HGPS clásico (AG06297) y HGPS tipo 2 atípico (AG08466) se sometieron a la preparación del halo de ADN y luego a 2D-FISH utilizando pinturas cromosómicas completas para los cromosomas 1, 13, 15 y 17. Los cromosomas enteros se representan en verde (FITC) y el ADN se teñó con DAPI (azul). Ampliación = x 100; barra de escala 10 μm. (b) El posicionamiento de los cromosomas dentro de los núcleos extraídos se determinó midiendo la relación entre el borde del territorio cromosómico medio (CTE) y el borde nuclear (NE). Una relación por encima de 1 demuestra que el CTE más lejano se encuentra fuera del NE correspondiente dentro del halo de ADN, mientras que una relación por debajo de 1 significa que el CTE más lejano se encuentra dentro del NE dentro del núcleo residual. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componentes</td>
			<td>Volumen (μL)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5XDOP-PCRbuffer</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>dNTPmix(sinTTP)(2mM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>dTTP (2mM)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Biotina-16-dUTPorDigoxigenina-11-dUTP</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>DOPprimer (20μM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>TaqDNAPolimerasa (1U/μL)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>PCRgradoagua</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>Plantilla</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Tabla que muestra los componentes y volúmenes de DOP-PCR para una reacción 1x
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Paso</td>
			<td>Ciclos</td>
			<td>Temp (grado centígrado)</td>
			<td>Hora</td>
		</tr><tr><td>Desnaturalización inicial</td>
			<td>1</td>
			<td>95</td>
			<td>3 minutos</td>
		</tr><tr><td>Desnaturalización</td>
			<td rowspan="3">34</td>
			<td>98</td>
			<td>20 s</td>
		</tr><tr><td>Recocido de imprimación</td>
			<td>62</td>
			<td>1 minuto</td>
		</tr><tr><td>Extensión</td>
			<td>72</td>
			<td>30 s</td>
		</tr><tr><td>Extensión final</td>
			<td>1</td>
			<td>72</td>
			<td>5 minutos</td>
		</tr><tr><td>Enfriamiento</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>Sostener</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Tabla que muestra el ciclo DOP-PCR, la temperatura y el perfil de tiempo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Constituyente</td>
			<td>Volumen (μL)</td>
		</tr><tr><td>Tampón NT 10x (0.5M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0.5 mg/ml BSA)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>0,1 M de beta-mercaptoetanol</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Stock de nucleótidos 10X (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml biotina-16-dUTP)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Dnase I (1 ng/ml)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>DNApolimerasa I</td>
			<td>5U por μg de ADN</td>
		</tr><tr><td>DNAtemplate (1 μg)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Agua tratada con DEPC</td>
			<td>Hasta 50 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 3: Tabla que muestra los componentes y volúmenes de traducción de nick para una sonda.

La combinación de preparaciones de halo de ADN con hibridación fluorescente in situ permite el análisis de alta resolución de las interacciones genómicas con el nucleoesqueleto. El genoma unido conduce a señales fluorescentes hibridadas ubicadas dentro de los núcleos extraídos residuales, mientras que el genoma no unido está en el halo de ADN que rodea los núcleos residuales.

Hibridación fluorescente in situ en preparaciones de halo de ADN para revelar cromosomas completos, telómeros y loci de genes

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

Este protocolo se puede utilizar para evaluar las uniones al nucleoesqueleto en lugar de utilizar la secuenciación DamID, y es un ensayo de una sola célula. La principal ventaja de usar este método es que es rentable y de fácil acceso. Puede resaltar diferencias funcionales entre genes y cromosomas que normalmente no ocurren con otras técnicas de visualización.Las organizaciones espaciales y funcionales dentro del genoma en las células tratadas de cáncer y progeria y las diferencias genómicas de comportamiento en las células senescentes se pueden evaluar utilizando este protocolo. Este método se puede aplicar a cualquier tipo de célula o tejido a lo largo de la vida y de cualquier enfermedad. También se puede utilizar en organismos modelo donde hay sondas disponibles.Para comenzar, prepare 500 mililitros de ácido clorhídrico al 10% y viértalo en un vaso de precipitados grande. Deje caer los portaobjetos de microscopio individualmente en el ácido e incubarlos durante una hora a temperatura ambiente en un agitador ajustado a dos G.Decantar el ácido del vaso de precipitados y lavar los portaobjetos 10 veces en agua del grifo. Luego otras 10 veces en agua desionizada.Enjuague los portaobjetos en metanol dos veces y manténgalos en metanol hasta la esterilización. Coloque los portaobjetos sobre una toalla de papel para que se sequen y envuélvalos en papel de aluminio para su esterilización en un autoclave u horno caliente. Cultive células en el medio apropiado con suero durante al menos 48 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que se alcance una confluencia del 60 al 70%.Recolecte cada tipo de célula y cuente las células con un hemocitómetro. Sembrar una vez 10 a las cinco celdas en 10 mililitros de medio por portaobjetos. Retire de la incubadora la placa de cultivo que contiene los portaobjetos y las células adheridas.Deseche el medio y etiquete las diapositivas con un lápiz. Luego colóquelos en un frasco de coplin que contenga 50 mililitros de tampón citoesqueleto helado. Incubar el frasco durante 15 minutos en hielo o a cuatro grados centígrados.Deseche el tampón del citoesqueleto y enjuague rápidamente los portaobjetos en 50 mililitros de tampón de halo de ADN de una sola vez tres veces sumergiéndolos en un frasco de coplin con el tampón. Transfiera los portaobjetos a un frasco de coplin que contenga 50 mililitros de tampón de extracción e incube durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Luego, incube consecutivamente las diapositivas en 50 mililitros de 10 veces, cinco veces, dos veces y una vez tampón de halo de ADN durante un minuto cada una.Cuando termine, sumerja las diapositivas a través de una serie secuencial de etanol de 10, 30, 70 y 95% de etanol. Tome las diapositivas a través de una serie secuencial de etanol de 50 mililitros de 70, 90 y 100% de etanol durante cinco minutos cada una. Sécalos al aire en un plato de calentamiento.Luego hornee en un horno de 70 grados centígrados durante cinco minutos. Desnaturalice los portaobjetos colocándolos en una solución de SSC al 70% dos veces durante dos minutos a 70 grados centígrados. Coloque los portaobjetos desnaturalizados en 50 mililitros de etanol helado al 70% durante cinco minutos.Luego muévalos a través de una serie de etanol de 90, 95 y 100% a temperatura ambiente durante cinco minutos cada uno. Cuando termine, seque al aire las diapositivas en una placa de calentamiento. Desnaturalice las sondas de ADN a 75 grados centígrados durante 10 minutos en un bloque caliente o baño de agua.Luego incubarlos a 37 grados centígrados durante 30 minutos antes de pipetear 10 microlitros en el portaobjetos apropiado. Superponga la sonda con un cubreobjetos de 21 por 21 milímetros y séllela con cemento de goma. Incubar los portaobjetos durante un mínimo de 18 horas a 37 grados centígrados en una cámara de hibridación humidificada.Después de la incubación, retire con cuidado el cemento de goma con fórceps. Luego incubar los portaobjetos en 50 mililitros de formamida al 50% dos veces la solución SSC a pH siete que se ha precalentado a 45 grados centígrados durante tres incubaciones de cinco minutos. A continuación, coloque los portaobjetos en 50 mililitros de 0,1 veces la solución SSC que se ha precalentado a 60 grados centígrados, pero se coloca en un baño de agua de 45 grados centígrados.Incubar durante cinco minutos y reemplazar el tampón dos veces para incubaciones de cinco minutos. Coloque los portaobjetos en un frasco de coplin que contenga 50 mililitros de solución cuatro veces SSC a temperatura ambiente e incube durante 15 minutos con tres cambios de tampón. Para evitar la unión de anticuerpos no específicos, aplique 100 microlitros de solución de SSC al 4% BSA cuatro veces a cada portaobjetos y superpóngalo con un trozo de película de parafina.Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego incubar los portaobjetos con 100 microlitros de estreptavidina Cy3 diluidos uno en 200 durante una hora a temperatura ambiente para detectar la sonda etiquetada. Coloque los portaobjetos en un frasco de coplin que contenga 50 mililitros de solución cuatro veces SSC a temperatura ambiente e incube durante 15 minutos con tres cambios de tampón.Monte las guías en 20 microlitros de una solución de montaje que contiene DAPI y superponga con un cubreobjetos de 22 por 50 milímetros. Visualice los halos de ADN y los territorios cromosómicos utilizando un microscopio de epifluorescencia con un objetivo de aceite 100X. La preparación del halo de ADN permite ver el borde de un núcleo residual, el ADN que queda dentro del núcleo residual y el ADN no unido que se ha enrollado en el área circundante.Los halos de ADN de fibroblastos dérmicos humanos proliferantes se crearon a partir de células con BRDU incorporada y posteriormente se tiñeron con anticuerpos anti-BRDU. Las células proliferantes fueron positivas para BRDU y anti-pKi-67. Este protocolo se utilizó para visualizar territorios cromosómicos dentro de los halos de ADN.Los cromosomas individuales se marcaron con sondas específicas de pintura de cromosomas de brazo entero para los cromosomas 1, 13, 17 y 18. Anti-pKi-67 se utilizó para marcar células en proliferación y su ausencia dentro del mismo cultivo. Aquí se muestran preparaciones de halo de ADN con telómeros en verde.Es posible observar la proporción de telómeros en el halo de ADN, particularmente en la imagen del experimento dos. El porcentaje medio de telómeros fue de aproximadamente el 17% en las células quiescentes. Se detectaron diferencias en la unión cromosómica en fibroblastos de control primario y en células enfermas con síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford típico y atípico, que expresan una isoforma Sun1 diferente y ninguna mutación de Lamin A.Los cromosomas uno y 13 muestran diferencias estadísticamente significativas en su unión dentro de los núcleos residuales en comparación con los halos de ADN controlados. La posición de todo el territorio cromosómico se correlacionó con el núcleo residual y el halo de ADN. Al intentar este protocolo, asegúrese de que las células se siembran con la densidad correcta y se extraen en el momento adecuado.Después de este procedimiento, se puede realizar inmunofluorescencia indirecta y ARN FISH.

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Todo el montaje hibridación in situ es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para analizar el patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. Se incluye un yoduro de propidio nuclear tinción de contraste para destacar la organización del tejido.

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