Name: Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprende a etiquetar y visualizar los ocho polipéptidos codificados por el genoma mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae mediante marcaje radiactivo y electroforesis en gel. Este método permite estudiar la biosíntesis de proteínas mitocondriales.

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Esta investigación fue financiada por la Fundación Rusa para la Investigación Básica, concesión número 18-29-07002. P.K. fue apoyado por la Asignación Estatal del Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación de Rusia, número de subvención AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación de Rusia, número de subvención 075-15-2019-1659 (Programa del Centro Kurchatov de Investigación del Genoma). El trabajo se realizó en parte en el equipo comprado en el marco del Programa de Desarrollo de la Universidad Estatal de Moscú. I.C., S.L., y M.V.B. recibieron además el apoyo de la beca de la Universidad Estatal de Moscú "Leading Scientific School Noah's Ark".

1. Preparación de la cultura de levadura
<ol><li>Levadura de rayas de los cultivos de caldo congelado en platos frescos con el medio adecuado. Ponga las placas en una incubadora de cultivo a 30 °C durante 24-48 h. NOTA: Deje que los mutantes sensibles a la temperatura crezcan a la temperatura permisiva.</li>
	<li>Inocular cultivos de levadura en 2 ml de media YPGal (2% peptona, 1% extracto de levadura, 2% galactosa) de la veta fresca en tubos de 15 ml e incubarlos durante la noche agitando a 200 rpm a 30 °C.</li>
	<li>Mida la densidad óptica del cultivo a una longitud de onda de 600 nm (OD600).</li>
	<li>Tome el volumen correspondiente a 0,2 unidades de absorbancia en tubos estériles, células de levadura de pellets a 9.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Lave las células con 0,5 ml de agua estéril por vórtice durante 5 s. Células de levadura de pellets a 9.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Diluir las células en 2 ml de medio YPGal fresco.</li>
	<li>Incubar agitando a 200 rpm y 30 °C hasta que OD600 alcance valores de 1,5–1,9. NOTA: Las tasas de crecimiento de levadura varían, así que prepárate para esperar. Es razonable hacer los pasos 1.3–1.6 temprano en la mañana. Por lo general, toma 4-5 h, pero puede tomar más tiempo.</li>
</ol>2. Incorporación de isótopos radiactivos
<ol><li>Transfiera el volumen de cultivo equivalente a una unidad óptica en un tubo de microcentrífuga. Gire los tubos a 3.000 x g durante 1 minuto y deseche el sobrenadante. Lavar con 0,5 ml de agua estéril por vórtice durante 5 s.<ol>
<li>Células de levadura de pellets a 9.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Células de levadura resuspend en 0,5 ml de búfer de traducción estéril. Coloque la suspensión en un tubo de 15 ml. NOTA: El búfer de traducción es una solución que contiene 2% de galactosa (w/v) y fosfato de potasio de 50 mM con pH 6.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir cicloheximida a la suspensión celular hasta una concentración final de 0,2 mg/ml. Incubar durante 5 minutos agitando a 200 rpm y 30 °C para inhibir la traducción citosólica. NOTA: La solución de cicloheximida (20 mg/ml, en etanol) debe prepararse fresca antes del experimento. El cloranfenicol se puede sustituir con éxito por anisomicina en la misma concentración7.</li>
	<li>Añadir 25–30 μCi de 35S-metionina a la suspensión celular e incubar durante 30 minutos agitando a 200 rpm y 30 °C. NOTA: También se puede utilizar la mezcla de 35S-metionina y 35S-cisteína. Pura 35S-metionina resulta en la señal más fuerte y la mejor relación señal-ruido. Generalmente, la metionina es más eficaz que la cisteína porque el contenido de este aminoácido en proteínas mitocondriales es mayor. Sin embargo, la mezcla EasyTag de 35S-metionina y cisteína es menos costosa y da resultados comparables7. PRECAUCIÓN: 35S-metionina es radiactiva. Siga las prácticas de seguridad habituales para el manejo de materiales radiactivos. NOTA: Es bien sabido que la incorporación de radiactividad alcanza un límite debido al cual las señales totales se nivelan con el tiempo. Una vez alcanzado este límite, es casi imposible determinar las tarifas por las que se sintetizan los diferentes productos de traducción. Para analizar la tasa de traducción mitocondrial, es imperativo estar en una condición en la que la intensidad de la señal aumenta con el tiempo de incubación con 35S-metionina de una manera lineal. Para cepas comunes de tipo salvaje de laboratorio, la señal ya está saturada para tiempos de incubación mucho más cortos que los 30 minutos. Los mutantes traslacionales pueden comportarse de manera muy diferente. Se debe realizar un curso de tiempo para establecer la cinética de la incorporación de radiactividad y, por lo tanto, la tasa de traducción, al menos cuando se trabaja con una nueva cepa. Para ello, sugerimos tomar muestras con un intervalo de varios minutos (por ejemplo, 2,5, 5,0, 7,5, 10 y 20 minutos).</li>
	<li>Añadir metionina "fría" sin etiquetar (la concentración final debe ser de 20 mM) y puromycine (la concentración final debe ser de 1-10 μg/ml) para detener el etiquetado. Incubar durante 10 minutos agitando a 200 rpm y 30 °C. NOTA: Este paso es fundamental para dar a los ribosomas tiempo para terminar de traducir los péptidos. De lo contrario, todos los polipéptidos más cortos que la longitud completa se detectarán a un tamaño diferente. Un experimento de tiempo (pulso-persecución) se puede hacer en este paso para determinar la estabilidad de los productos de traducción mitocondrial. Para ello, continúe la incubación tomando muestras con un intervalo de 30 min (por ejemplo, 30, 60, 90 y 120 min).</li>
</ol>3. Lisis celular de levadura y extracción de proteínas
<ol><li>Recoger las células de levadura por centrifugación a 9.000 x g durante 30 s. Lave las células con 0,5 ml de agua estéril por vórtice durante 5 s. Células de levadura de pellets a 9.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. nota. El protocolo se puede pausar aquí. Almacene las muestras a -20 °C.</li>
	<li>Añadir 75 μL de tampón de lisis al pellet y vórtice durante 5-10 s. NOTA: El tampón de lisis es una solución de 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoetanol y 1 mM PMSF en agua. Evite la incubación excesiva con el amortiguador de lisis que conduce a la hidrólisis alcalina de proteínas. Proceda inmediatamente al paso 3.3.</li>
	<li>Añadir 500 μL de búfer Tris-HCl de 0,5 M con pH 6.8. Vórtice brevemente.</li>
</ol>4. Precipitación de proteínas
PRECAUCIÓN: El metanol y el cloroformo son disolventes orgánicos. Siga las prácticas de seguridad habituales para el manejo de sustancias orgánicas.
<ol><li>Añadir 600 μL de metanol a la muestra. Vórtice para 5 s.</li>
	<li>Añadir 150 μL de cloroformo a la muestra. Vórtice para 5 s.</li>
	<li>Centrífuga las muestras durante 2 min a 12.000 x g. Deseche cuidadosamente la fase superior con un muestreador.</li>
	<li>Añadir 600 μL de metanol a la muestra. Mezcle cuidadosamente invirtiendo el tubo varias veces.</li>
	<li>Centrífuga las muestras durante 2 min a 12.000 x g. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Seque al aire el pellet durante 2 min a 80 °C. NOTA: Todo el líquido debe evaporarse. Existe el riesgo de tener una separación aberrante de proteínas en el gel si el pellet se secó insuficientemente. Sin embargo, no es posible secar en exceso el pellet, por lo que incluso se puede almacenar durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Disolver proteínas precipitadas en 60 μL de 1x tampón de muestra Laemmli.</li>
	<li>Caliente durante 10 minutos a 40 °C. NOTA: Evite hervir las muestras a 95 °C, ya que esto provoca agregación. Si los agregados todavía se forman, gire las muestras a 12.000 x g durante 2 minutos y recoja el sobrenadante. Las muestras se pueden almacenar a -20 °C. El protocolo se puede pausar aquí.</li>
</ol>5. SDS-PAGE
<ol><li>Laemmli SDS-polyacrylamide gel al 17,5%. NOTA: 6 M urea se puede añadir al gel para resolver mejor atp8 y atp9. Gradiente 15%–20% geles también puede dar una mejor resolución.</li>
	<li>Cargue 15 μL (40–50 μg) de cada muestra en los bolsillos. NOTA: No es necesario medir la concentración de proteínas si los valores de OD600 estaban cerca en el paso 1.6. Si no es así, mida las concentraciones de proteínas utilizando el ensayo con reactivos compatibles con detergente.</li>
	<li>Ejecute el gel en una habitación fría hasta que el tinte azul alcance aproximadamente el 65% de la longitud del gel. NOTA: Para el sistema utilizado (por ejemplo, celda Protean II xi), utilizamos cualquiera de los dos modos: 16-17 h a 5 V/cm o 5 h a 15 V/cm. Ninguna proteína funciona más rápido que el tinte azul bromophenol, pero las carreras largas pueden resultar en el desenfoque de las señales atp8 y atp9.</li>
	<li>Manchar el gel con Coomassie azul brillante y hacer un escaneo o foto, que se requiere como un control de carga. NOTA: Una forma alternativa de hacer un control de carga es el inmunoblotting con un anticuerpo al gen mitocondrial "house-keeping", por ejemplo, la porína 1.</li>
</ol>6. Autoradiografía
<ol><li>Seque el gel en un gel-secador. Guárdalo en el cassette con una pantalla de fósforo de almacenamiento durante 3-5 días. NOTA: Una alternativa a la detección del gel seco es la transferencia de proteínas a una membrana nitrocelulosa mediante electro-hinchazón y cribado a partir de entonces. Resulta en señales más fuertes y bandas más nítidas.</li>
	<li>Escanee la pantalla en un fosforimagen. NOTA: Como alternativa a las imágenes de fósforo, la película de rayos X también se puede utilizar para revelar las señales.</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li>
<li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li>
<li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li>
<li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li>
<li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li>
<li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aim-less+translation%3A+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3%2FAim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749(2016).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li>
<li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li>
<li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li>
<li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876(2012).</li>
<li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ribosome+%28mitoribosome%29+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li>
<li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las investigaciones sobre la expresión génica ocupan una parte central en las ciencias de la vida modernas. Se han desarrollado numerosos métodos que proporcionan información sobre este complejo proceso. Aquí, describimos el método que permite acceder a la biosíntesis proteica en la levadura de panadero S. cerevisiae mitocondrias. Por lo general, se aplica para comparar las eficiencias de traducción de los ARNM en las mitocondrias de la cepa de levadura mutante frente al tipo salvaje para acceder a las consecuen...

Las mitocondrias son los orgánulos profundamente involucrados en el metabolismo de una célula eucariota. Su cadena de transferencia de electrones suministra a la célula ATP, la principal moneda energética utilizada en múltiples vías bioquímicas. Además, están involucrados en apoptosis, síntesis de ácidos grasos y hemo, y otros procesos. La disfunción de las mitocondrias es una fuente bien conocida de la enfermedad humana1. Puede ser el resultado de mutaciones en genes nucleares o mitocondriales que codifican componentes estructurales o reglamentarios de los orgánulos2. La levadura saccharomyces cerevisiae de Baker es un excelente organismo modelo para estudiar la expresión génica mitocondrial debido a varias razones. En primer lugar, su genoma está completamente secuenciado3,bien anotado, y una gran suma de datos ya está disponible en la literatura gracias a la larga historia de investigaciones llevadas a cabo con este organismo. En segundo lugar, las manipulaciones con su genoma nuclear son relativamente rápidas y fáciles debido a su rápida tasa de crecimiento y su sistema de recombinación homóloga altamente eficiente. En tercer lugar, la levadura de panadero S. cerevisiae es uno de los pocos organismos para los que se desarrollan las manipulaciones con genomas mitocondriales. Por último, la levadura de panadero es un organismo facultativo aerobe-anaerobe, que permite el aislamiento y estudio de mutantes respiratorios defectuosos, ya que pueden crecer en medios que contienen fuentes de carbono fermentables.
Describimos el método para estudiar la expresión génica mitocondrial de la levadura de panadero S. cerevisiae en el nivel traslacional4. Su principio principal proviene de varias observaciones. En primer lugar, el genoma mitocondrial de levadura codifica sólo ocho proteínas: tres subunidades del citocromo c oxidasa (Cox1p, Cox2p y Cox3p), tres subunidades de la sintasa ATP (Atp6p, Atp8p y Atp9p), una subunidad de la enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductasa, citocromo b (Cytb) y la proteína ribosomal mitocondrial Var1p5. Este número es pequeño, y todos ellos pueden ser separados por electroforesis en un solo gel en las condiciones adecuadas. En segundo lugar, los ribosomas mitocondriales pertenecen a la clase procariota en lugar de eucariota6,y por lo tanto, la sensibilidad a los antibióticos es diferente para los ribosomas citoplasmáticos y mitocondriales de levadura. Permite la inhibición de la traducción citoplasmática con cicloheximida, proporcionando las condiciones cuando el aminoácido etiquetado(35S-metionina) se incorpora sólo en productos de traducción mitocondrial. Como resultado, el experimento proporciona información sobre la tasa de incorporación de aminoácidos en proteínas mitocondriales sintetizadas de novo, reflejando la eficiencia general de la traducción mitocondrial para cada uno de los ocho productos

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Agar bacteriológico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Densímetro celular Biowave CO8000</td><td>BIOCHROM US BE</td><td>80-3000-45</td><td></td></tr><tr><td>CUBETAS desechables estándar de MARCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z330361</td><td></td></tr><tr><td>cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich 288306</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cicloheximida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>calefactor de bloque digital</td><td>Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>EasyTag L-[35S]-Metionina, 500&micro; Ci (18.5MBq), solución acuosa estabilizada</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG709A500UC</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga Eppendorf 5425</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-864-457</td><td></td></tr><tr><td>GE Cribas de fósforo de almacenamiento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE29-0171-33</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilendiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-Metilenebisacrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Incubadora Shaker New</td><td>Brunswick Peptona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>científica de carne, bacteriológica</td><td>Millipore</td><td>91249&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetanosulfonilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Pierce de 660 nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>22662</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Fuente de alimentación básica</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651802</td><td></td></tr><tr><td>Dihidrocloruro de puromicina de Streptomyces alboniger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Generador de imágenes de fósforo Storm 865</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Secador de gel calentado al vacío Cleaver</td><td>Scientific</td><td>CSL-GDVH</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de panadero saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Las mitocondrias son orgánulos esenciales de células eucariotas capaces de respirar aeróbicos. Contienen genoma circular y aparatos de expresión génica. Un genoma mitocondrial de la levadura de panadero codifica ocho proteínas: tres subunidades del citocromo c oxidasa (Cox1p, Cox2p y Cox3p), tres subunidades de la sintasa ATP (Atp6p, Atp8p y Atp9p), una subunidad de la enzima oxidorreductasa ubiquinol-citocromo c, citocromo b (Cytb) y la proteína ribosomal mitocondrial Var1p. El propósito del método descrito aquí es etiquetar específicamente estas proteínas con metionina 35S, separarlas por electroforesis y visualizar las señales como bandas discretas en la pantalla. El procedimiento implica varios pasos. En primer lugar, las células de levadura se cultivan en un medio que contiene galactosa hasta que llegan a la etapa de crecimiento logarítmico tardío. A continuación, el tratamiento con cicloheximida bloquea la traducción citoplasmática y permite la incorporación de metionina 35S solo en productos de traducción mitocondrial. Luego, todas las proteínas se extraen de las células de levadura y se separan por electroforesis de gel de poliacrilamida. Finalmente, el gel se seca e incuba con la pantalla de fósforo de almacenamiento. La pantalla se escanea en un fosforimagen que revela las bandas. El método se puede aplicar para comparar la tasa de biosíntesis de un solo polipéptido en las mitocondrias de una cepa de levadura mutante en comparación con el tipo salvaje, que es útil para estudiar defectos de expresión génica mitocondrial. Este protocolo proporciona información valiosa sobre la tasa de traducción de todos los mRNAs mitocondriales de levadura. Sin embargo, requiere varios controles y experimentos adicionales para sacar conclusiones apropiadas.

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, asignamos productos de traducción mitocondrial de dos cepas S. cerevisiae: el tipo salvaje (WT) y una eliminación de rodamientos mutantes del gen AIM23 (AIM23Δ), que codifica el factor de iniciación de traducción mitocondrial 3 (Cuadro 1)8. Los productos de traducción mitocondrial fueron etiquetados radiactivamente y separados en SDS-PAAG9. Las muestras se recogieron cada 2,5 minutos antes de la sat...

El genoma mitocondrial de levadura de Baker codifica ocho polipéptidos. El objetivo del protocolo actual es etiquetarlos todos ellos y posteriormente visualizarlos como bandas separadas.

Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Las mitocondrias son orgánulos esenciales de células eucariotas capaces de respirar aeróbicas. Su disfunción es una fuente bien conocida de enfermedad humana. Las mitocondrias de levadura de Baker contienen un genoma circular que codifica ocho proteínas.En este video, describimos el protocolo utilizado para ensayo de biosíntesis proteica en mitocondrias de levadura mediante etiquetado radiactivo de productos traslacionales y posterior separación por electroforesis de gel. El procedimiento incluye varios pasos principales. Levadura de rayas de cultivos de caldo congelados en platos frescos con el medio adecuado.Ponga las placas en la incubadora de cultivo a 30 grados durante 24 a 48 horas. Inocular estos cultivos en dos mililitros de medio de la veta fresca en un tubo de 15 mililitros e incubarlos durante la noche agitando a 200 RPM a 30 grados. Mida la densidad óptica del cultivo en la longitud de onda de 600 nanómetros.Tome el volumen correspondiente a 0,2 unidades de absorbencia en tubos estériles Las células de levadura paleta a 9.000 G durante 30 segundos a temperatura ambiente. Desecha este sobrenadante. Lave las células con 0,5 mililitros de agua estéril vórtice durante cinco segundos.Células de levadura de palet a 9.000 G durante 30 segundos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante. Diluir las células en dos mililitros de agar de toallita fresca medio.Incubar el borde tomado a 200 RPM y 30 grados hasta que la densidad óptica alcance de 1,5 a 1,9 de 1,5 a 1,9 valores. Transfiera el volumen de cultivo equivalente a una unidad óptica en tubo de micro centrífuga. Gire los tubos a 3000 G durante un minuto.Deseche el sobrenadante. Lave las células con 0,5 mililitros de agua estéril vórtice durante cinco segundos. Células de levadura de palete a 9.000 G durante 30 segundos a temperatura ambiente Deseche el sobrenadante.Vuelva a suspender las células de levadura en 0,5 mililitros de búfer de traducción estéril. Coloque la suspensión en un tubo de 15 mililitros. Añadir cicloheximida a la suspensión celular hasta la concentración final de 0,2 miligramos por mililitro Incubar durante cinco minutos borde tomado a 200 RPM y 30 grados para inhibir la traducción citosólica.Añadir de 25 a 30 Añadir de 25 a 30 microcurie de metionina S35 de metionina S35 a suspensión celular e incubar durante 30 minutos borde tomado a 200 RPM y 30 grados. Añadir metionina fría sin etiquetar y borymicina para detener la incubación de etiquetado durante 10 minutos borde tomado a 200 RPM y 30 grados. Recoger las células de levadura por centrifugación a 9.000 G durante 30 segundos.Lave las células con 0,5 mililitros de agua estéril vórtice durante cinco segundos. Células de levadura de palet a 9.000 G durante 30 segundos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante.Agregue 75 microlitros de búfer de lisis a la paleta y vórtice durante cinco a 10 segundos. Añadir 500 microlitros de 0,5 tampón tris molar de 0,5 tampón tris molar con pH 6,8. Con pH 6.8.Vórtice brevemente. Agregue 600 microlitros de metanol a la muestra. Vórtice durante cinco segundos.Añadir 150 microlitros de cloroformo a la muestra. Vórtice durante cinco segundos. Centrífuga las muestras durante dos minutos a 12.000 G.Deseche cuidadosamente la opafa con un muestreador.Agregue 600 microlitros de metanol a la muestra. Mezcle cuidadosamente invirtiendo el tubo varias veces. Muestras de centrífuga durante dos minutos a 12.000 G.Discard sobrenadante.Seque el palet durante dos minutos a 80 grados. Disolver proteínas precipitadas en 60 microlitros del búfer de la muestra Laemmli. Caliente las muestras durante 10 minutos a 14 grados.Causa el gel de poliacrilamida 17.5% Laemmli SDS. Cargue 15 microlitros de cada muestra en los bolsillos. Ejecute el gel en el cuarto frío hasta que el tinte azul alcance aproximadamente el 65% de la linfa de gel.Manchar el gel con kumasi azul brillante y hacer escaneo o foto que se requiere como control de carga. Seque el gel en el secador de gel. Guárdalo en el cassette con pantalla de fósforo de almacenamiento durante tres a cinco días.Escanee la pantalla en el imager de fósforo. Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, asignamos productos de traducción mitocondrial de dos cepas saccharomyces cerevisiae. El tipo salvaje y la eliminación de variantes mutantes del gen Aim23 codifican el factor de iniciación de traducción mitocondrial tres.Los productos de traducción mitocondrial ya estaban etiquetados activamente y separados en el gel de poliacrilamida desnaturalizado. Las muestras se recogieron cada dos minutos y medio antes de la saturación para construir el curso de tiempo. El gel fue manchado, seco y examinado después de la exposición de cinco días.En el caso de un experimento exitoso, la imagen muestra ocho bandas asignadas de acuerdo con el patrón estándar. Sin embargo, las intensidades de las bandas individuales pueden ser altamente variables dependiendo de la tensión y las condiciones experimentales. Cada banda corresponde a un producto de traducción.Los datos sugieren que la cepa mutante es capaz de síntesis de proteína mitocondrial porque todos los productos que aparecen en el tipo salvaje son visibles en este mutante. Sin embargo, las intensidades de las bandas son diferentes del tipo salvaje, lo que significa que esta eliminación de Aim23 afecta la expresión génica mitocondrial. Kumasi se elabora en mancha azul y sirve como control de carga.Su resultado en datos se puede cuantificar para identificar diferencias entre cepas o condiciones experimentales utilizando el software Image G o Image Quan. Para estos, la relación de la señal correspondiente a cada producto se calcula a la señal total. Los valores medios y las desviaciones estándar se calculan en al menos tres experimentos independientes.La cinética de la proteína sintetizada volteada se estudia en un experimento del año pasado. Las muestras se recogen en los puntos de tiempo indicados después de que la reacción de etiquetado se detiene por metionina fría y borymicina. Este control es necesario para estimar la estabilidad del producto.La inmuno-tinción con anticuerpos Anti-Porin one es un control de carga. Describimos el método, que a menudo se utiliza para estudiar biosíntesis proteica en mitocondrias de levadura. Este protocolo es relativamente simple y rápido de realizar.Al mismo tiempo, permite obtener información valiosa sobre la tasa de traducción de cuatro mRNAs mitocondriales de levadura, lo cual es altamente ventajoso. Sin embargo, tiene varias limitaciones que requieren experimentos adicionales y se encuentra en estos niveles interestatales de proteínas y mRNAs. Puede proporcionar la información sobre estas funciones en el sistema de traducción mitocondrial, pero se deben utilizar técnicas más avanzadas para descubrir el mecanismo.

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Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal

Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

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