Uso de la inmunofluorescencia para detectar el daño al ADN inducido por PM2.5en corazones de embriones de pez cebra
15 de febrero de 2021
Este protocolo utiliza un ensayo de inmunofluorescencia para detectar el daño en el ADN inducido por PM2.5en los corazones disecados de embriones de pez cebra.
Este método se puede utilizar para detectar con precisión y facilidad la expresión de proteínas objetivo en el corazón del pez cebra. El cambio en la proteína diana se detecta directamente midiendo la inmunofluorescencia. Realizar la recolección y el tratamiento de embriones de pez cebra, como se describe en el texto manuscrito.
A las 72 horas después de la fertilización, transfiera los embriones a portaobjetos de vidrio y obsérquelos bajo un microscopio estereoscópico. Registre malformaciones cardíacas, como edema pericárdico, alteración del bucle y disminución del tamaño. Calcule las tasas de malformación y analice las diferencias entre los grupos utilizando ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de comparación múltiple de Turquía.
Después de anestesiar los embriones con 0,6 miligramos por mililitro MS222, registre los latidos del corazón durante 30 segundos y cuantifique las frecuencias cardíacas utilizando el software Image J. Diseccione cuidadosamente los corazones de los embriones de pez cebra con una aguja de jeringa desechable bajo un microscopio estereoscópico. Use una pluma de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo en un portaobjetos de vidrio limpio.
Agregue 50 microlitros de paraformaldehído al 4% a 1,25 microlitros de PBS para hacer una solución fijadora, luego coloque tres corazones disecados en un círculo de barrera hidrofóbico e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Decantar la solución bajo el microscopio y secar las muestras a temperatura ambiente durante al menos cinco minutos. Lave los portaobjetos tres veces en PBST durante cinco minutos por lavado.
Agregue 50 microlitros de BSA a 1, 000 microlitros de PBST para obtener una solución de BSA al 5%, e incube los portaobjetos en una cámara húmeda durante una hora para bloquear la unión de anticuerpos no específicos. Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Diluir dos microlitros de anticuerpo monoclonal de ratón contra 8-hidroxidesoxiguanosina y dos microlitros de anticuerpo policlonal de conejo contra gamma-H2AX en 296 microlitros de PBST para obtener una solución de cóctel de anticuerpos primarios en funcionamiento.
Incubar las muestras de corazón con 50 microlitros de la solución de cóctel de anticuerpos primarios en una cámara humidificada durante al menos una hora a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBST durante cinco minutos por lavado. Diluya un microlitro de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con FITC y un microlitro de anticuerpo secundario anti-conejo de cabra psy-3 en 500 microlitros de PBST para obtener una solución de cóctel de anticuerpos secundarios en funcionamiento.
Incubar las muestras con los anticuerpos secundarios durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Agregue 20 microlitros de DAPI a las muestras para la tinción nuclear e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Aplique un resbalón de cubierta al portaobjetos y séllelo con esmalte de uñas para evitar el secado y el movimiento. Imagine las muestras bajo un microscopio de fluorescencia y cuantifique la señal fluorescente del área del corazón utilizando el software ImageJ. Calcule los cambios relativos utilizando el promedio de las muestras de control DMSO y determine la significación estadística de los datos.
Los embriones expuestos a PM 2.5 en ausencia o presencia del antioxidante, N-acetil-L-cisteína, o NAC, fueron evaluados para detectar la presencia de malformaciones cardíacas. La OMA de PM 2.5 costó un aumento significativo en la teratogénesis cardíaca, como edema pericárdico, asa alterada y disminución del tamaño, en comparación con los corazones tratados con DMSO-control. La frecuencia cardíaca también disminuyó significativamente en embriones expuestos a la OMA.
Adición de defectos cardíacos inducidos por la OMA atenuada por NAC. Se utilizó un ensayo de inmunofluorescencia para evaluar el alcance del daño en el ADN en los tejidos tratados con OMA. Los niveles de 8-hidroxidesoxiguanosina y la expresión de gamma-H2AX aumentaron significativamente en los corazones de embriones de pez cebra tratados con EOM, lo que indica un aumento en el daño oxidativo del ADN y las roturas de doble cadena de ADN, respectivamente.
El daño del ADN inducido por la OMA fue parcialmente contrarrestado por la suplementación con NAC. Al intentar este protocolo, tenga cuidado al lavar las muestras con PBS, ya que el corazón del pez cebra puede desprenderse del portaobjetos.
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Resumen
Este protocolo utiliza un ensayo de inmunofluorescencia para detectar el daño en el ADN inducido por PM 2.5 en los corazones disecados de embriones de pez cebra. El método permite la detección precisa de la expresión de proteínas diana en el corazón del pez cebra.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Toxicología
Antecedentes
- La inmunofluorescencia es una técnica potente para visualizar la expresión proteica.
- Los embriones de pez cebra son un modelo valioso para estudiar los procesos del desarrollo.
- Se sabe que la exposición a PM 2.5 causa diversos problemas de salud, incluidos daños en el ADN.
- Comprender los efectos de las toxinas ambientales sobre el desarrollo es crucial para la salud pública.
Objetivo del estudio
- Evaluar el impacto de las PM 2,5 en la integridad del ADN en los corazones de pez cebra.
- Utilizar inmunofluorescencia para detectar cambios en la expresión proteica.
- Establecer un método confiable para evaluar malformaciones cardíacas en embriones de pez cebra.
Métodos Utilizados
- Recolección y tratamiento de embriones de pez cebra.
- Ensayo de inmunofluorescencia para detectar proteínas diana.
- Observación de embriones bajo un microscopio estereoscópico a las 72 horas post-fecundación.
- Análisis estadístico mediante ANOVA de un factor y la prueba de comparación múltiple de Tukey.
Resultados principales
- Detección de daño en el ADN en corazones de pez cebra debido a la exposición a PM 2.5.
- Identificación de malformaciones cardíacas como edema pericárdico y alteración del plegamiento.
- Cuantificación de las tasas de malformación en diferentes grupos de tratamiento.
- Significancia estadística de los hallazgos confirmada mediante análisis.
Conclusiones
- La exposición a PM 2.5 provoca daño significativo en el ADN de los corazones de pez cebra.
- El ensayo de inmunofluorescencia es efectivo para estudiar los cambios en la expresión de proteínas.
- Este modelo puede utilizarse para investigaciones futuras sobre toxinas ambientales y biología del desarrollo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo de inmunofluorescencia permite reducir los riesgos mecanicistas de tóxicos ambientales mediante la cuantificación de biomarcadores de daño al ADN en corazones de embriones de pez cebra, un modelo predictivo de cardiotoxicidad en desarrollo. El ensayo apoya los flujos de trabajo de validación de dianas y cribado fenotípico al vincular la exposición a PM2.5 con vías de estrés oxidativo y roturas de doble cadena del ADN. Proporciona datos traslacionales de biomarcadores para la evaluación de riesgos en fases iniciales del descubrimiento, facilitando la selección de bibliotecas químicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la detección de 8-OHdG y γH2AX como indicadores mecanicistas del daño oxidativo en el ADN y de roturas de doble cadena.
- Valor operativo: Permite la desactivación de riesgos biológicos mediante lecturas cuantitativas de inmunofluorescencia que aclaran la activación de vías en tejido cardíaco.
- Valor predictivo: Apoya la confianza en el objetivo al correlacionar los cambios en biomarcadores inducidos por PM2.5 con fenotipos de malformaciones cardíacas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara tejido cardíaco de pez cebra validado para el cribado posterior de compuestos genotóxicos mediante la detección de expresión proteica basada en inmunofluorescencia.
- Valor operativo: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados y reproducibles mediante el análisis con ImageJ de las señales fluorescentes en corazones diseccionados.
- Valor de escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma para evaluar cambios en la expresión proteica inducidos por productos químicos ambientales en un sistema relevante para enfermedades.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Demuestra la relevancia de la enfermedad mediante la detección de daño en el ADN en corazones de embriones de pez cebra, un modelo con vías conservadas de desarrollo cardíaco.
- Valor operativo: Asegura la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al proporcionar información mecanicista sobre la cardiotoxicidad inducida por PM2.5.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones de continuar o no continuar mediante la cuantificación de la atenuación del daño en el ADN a través del tratamiento coadyuvante con antioxidantes (por ejemplo, NAC).
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, proporcionando lecturas mecanicistas que respaldan la confianza predictiva en campañas de cribado en etapas iniciales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al cuantificar biomarcadores de daño del ADN en respuesta a la exposición a tóxicos ambientales.
- Selección: Ofrece disponibilidad del ensayo y resultados cuantitativos mediante tinción inmunofluorescente estandarizada y cuantificación de fluorescencia basada en ImageJ en corazones de pez cebra.
- Análisis: Genera resultados estadísticos (por ejemplo, cambios relativos en la fluorescencia, significancia derivada de ANOVA) que permiten la comparación entre condiciones y la validación de resultados positivos.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante el uso de un modelo de pez cebra con vías de desarrollo relevantes para la evaluación de cardiotoxicidad humana.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para seleccionar diversas bibliotecas químicas en busca de potencial genotóxico en un modelo de corazón vertebrado.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva mediante la reducción de riesgos mecanicistas de las vías de daño al ADN en la evaluación de toxicidad del desarrollo.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante protocolos fijos de disección, tinción e imagenología que utilizan barreras hidrófobas y microscopía de fluorescencia.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al vincular cambios en biomarcadores con resultados fenotípicos, reduciendo el riesgo biológico en etapas avanzadas de los programas de toxicología.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos según su potencial de daño al ADN en un modelo de corazón en desarrollo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de embriones de pez cebra, disección cardíaca y técnicas de inmunofluorescencia.
- Depende de microscopía de fluorescencia y del software ImageJ para la cuantificación de señales y el análisis estadístico.
- Necesita una estandarización entre equipos en cuanto al momento de la disección, la incubación con anticuerpos y los procedimientos de lavado, para prevenir la pérdida de tejido.
- Implica consideraciones de adaptación al extender el ensayo a otros tejidos de pez cebra o modelos de enfermedad.
- Incluye limitaciones prácticas, como la separación del tejido cardíaco durante el lavado, lo que requiere un manejo cuidadoso del PBS, tal como se indica en el material original.
