Name: Uso de la inmunofluorescencia para detectar el daño al ADN inducido por PM2.5en corazones de embriones de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprende a detectar daño al ADN inducido por PM2.5 en corazones de embriones de pez cebra mediante inmunofluorescencia. Este método permite evaluar con precisión la expresión de proteínas objetivo y estudiar malformaciones cardíacas en Danio rerio.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (número de subvención: 81870239, 81741005, 81972999) y el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu.

El pez cebra de tipo salvaje (AB) utilizado en este estudio se obtuvo del Centro Nacional de Recursos de Pez Cebra en Wuhan, China. Todos los procedimientos de animales descritos aquí han sido revisados y aprobados por la Institución de Cuidado Animal del Comité de Ética de la Universidad de Soochow.
1. Muestreo de PM2.5 y extracción de compuestos orgánicos
NOTA: PM2.5 se recolectó en un área urbana en Suzhou, China, del 1 al 7 de agosto de 2015, como se describió anteriormente5.
<ol><li>Hornea filtros de membrana de cuarzo de 47 mm en un horno de silenciador de 500 °C durante 2 h para eliminar los componentes orgánicos.</li>
	<li>Coloque un filtro en un muestreador PM2.5 durante 24 h de muestreo ininterrumpido.</li>
	<li>Retire el filtro y séquelo durante 24 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cuantificar el filtro con una balanza analítica.</li>
	<li>Extraer componentes orgánicos del filtro mediante extracción Soxhlet utilizando diclorometano como disolvente19.</li>
	<li>Secar la EJ mediante una evaporación rotativa en un baño de agua de 60 °C y un flujo de nitrógeno. Disolver la EOM en DMSO y conservar a -20 °C.</li>
</ol>2. Recolección y tratamiento de embriones de pez cebra
<ol><li>Mantener el pez cebra a 28,5 ± 0,5 °C en un sistema de acuicultura de recirculación con un ciclo de fotoperíodo de luz de 14 h y fotoperíodo oscuro de 10 h.</li>
	<li>Coloque el pez cebra adulto sano en un tanque en una proporción de 2: 1 macho a hembra.</li>
	<li>Al día siguiente, recoja los embriones y lávelos con agua del sistema (es decir, agua de cría de pez cebra).</li>
	<li>Seleccionar y dividir aleatoriamente embriones de pez cebra que demuestren un desarrollo normal (tamaño uniforme, granos completos y sin coagulación de huevos) en 4 grupos en placas de Petri de vidrio individuales con un diámetro de 7 cm (aproximadamente 50 embriones por plato).</li>
	<li>Tratar los embriones con PM2,5 (5 mg/L) en presencia o ausencia de NAC a 0,25 μM desde 2 hpf hasta 72 hpf. Utilice DMSO como control del vehículo hasta una concentración final al 0,1% (v/v).</li>
</ol>3. Observación morfológica de embriones de pez cebra y disección cardíaca
<ol><li>A 72 hpf, transfiera embriones a portaobjetos de vidrio y observe bajo un microscopio estereoscópico. Registre malformaciones cardíacas, como edema pericárdico, alteración del bucle y disminución del tamaño.</li>
	<li>Calcular las tasas de malformación (el porcentaje de embriones con defectos cardíacos del total de embriones vivos) y analizar las diferencias entre los grupos utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Turquía (p < 0,05 = estadísticamente significativo).</li>
	<li>Anestesiar los embriones con 0,6 mg/ml MS-222 para inmovilizarlos en portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Registre los latidos del corazón durante 30 s y cuantifique las frecuencias cardíacas utilizando el software ImageJ5,20.</li>
	<li>Diseccionar corazones de embriones de pez cebra con una aguja de jeringa desechable bajo un microscopio estereoscópico. Precaución: Evite destruir la forma del corazón.</li>
</ol>4. Ensayo de inmunofluorescencia
<ol><li>Para usar un ensayo de inmunofluorescencia para detectar el daño del ADN inducido por PM2.5 en el corazón de embriones de pez cebra, use una pluma de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo en un lado de vidrio limpio.</li>
	<li>Agregue 50 μL de paraformaldehído al 4% a 1,25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para hacer una solución fijadora.</li>
	<li>Coloque 3 corazones diseccionados en un círculo de pluma de barrera hidrofóbica e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Decantar la solución bajo el microscopio y secar las muestras a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos, de modo que los corazones se adhieran completamente a los portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Lave las diapositivas tres veces en PBS con 0.1% Tween 20 (PBST) durante 5 minutos por lavado.</li>
	<li>Añadir 50 μL de albúmina sérica bovina (BSA) a 1000 μL de PBST para obtener una solución de BSA al 5% e incubar los portaobjetos en una cámara húmeda durante 1 h para bloquear la unión de anticuerpos no específicos.</li>
	<li>Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBST durante 5 min por lavado.</li>
	<li>Diluir 2 μL de anticuerpo monoclonal de ratón contra 8-OHdG y 2 μL de anticuerpo policlonal de conejo contra γH2AX en 296 μL de PBST para obtener una solución de cóctel de anticuerpos primarios en funcionamiento.</li>
	<li>Incubar las muestras de corazón con 50 μL de la solución de cóctel de anticuerpos primarios contra 8-OHdG y γH2AX en una cámara humidificada durante al menos una hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C (la incubación nocturna puede aumentar la intensidad de la señal).</li>
	<li>Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBST durante 5 min por lavado.</li>
	<li>Diluir 1 μL de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con FITC y 1 μL de anticuerpo secundario anti-conejo de cabra cy3 en 498 μL de PBST para obtener una solución cóctel de anticuerpos secundarios en funcionamiento e incubar las muestras con los anticuerpos secundarios (1:500 en PBST) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBS durante 5 min por lavado protegido de la luz.</li>
	<li>Añadir 20 μL de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) a las muestras para la tinción nuclear durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aplique un cubrebocas para deslizar y selle con esmalte de uñas para evitar el secado y el movimiento. A continuación, imagine las muestras bajo un microscopio de fluorescencia y cuantifique la señal de fluorescencia del área del corazón utilizando el software ImageJ. Calcule los cambios relativos con el promedio de muestras de control DMSO. Determine la significación estadística de los datos como en el paso 3.2.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/</a> (2018).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).</li>
<li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li>
<li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs%3A+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+AhR+and+wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li>
<li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+senescence%2C+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li>
<li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+%28PM2.5%29+collected+in+Abidjan%2C+Cote+d%27Ivoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li>
<li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li>
<li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation%2C+apoptosis%2C+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li>
<li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+biochemistry+and+physiology.+Part+B%2C+Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li>
<li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diabetology%22%5BJournal%5D)">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46(2014).</li>
<li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine%2C+reactive+oxygen+species+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).</li>
<li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li>
<li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li>
<li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li>
<li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097(2020).</li>
<li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li>
<li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li>
<li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque el pez cebra es un excelente modelo de vertebrados para estudiar la toxicidad del desarrollo cardíaco de los productos químicos ambientales, debido al pequeño tamaño del corazón embrionario, es difícil obtener suficiente proteína para el análisis de western blot. Por lo tanto, presentamos un método de inmunofluorescencia sensible para cuantificar los niveles de expresión de proteínas de los biomarcadores de daño al ADN en los corazones de embriones de pez cebra expuestos a PM2.5.
<p class="jove_cont...

La contaminación del aire es ahora un grave problema ambiental que enfrenta el mundo. Las partículas finas ambientales (PM2.5),que es uno de los indicadores más importantes de la calidad del aire, pueden transportar una gran cantidad de sustancias nocivas y entrar en el sistema circulatorio de la sangre, causando graves daños a la salud humana1. Los estudios epidemiológicos han demostrado que la exposición a PM2.5 puede conducir a un mayor riesgo de defectos cardíacos congénitos (CHD)2,3. La evidencia de experimentos con animales también mostró que PM2.5 puede causar un desarrollo cardíaco anormal en embriones de pez cebra y la descendencia de ratones, pero los mecanismos moleculares de la toxicidad del desarrollo cardíaco de PM2.5 aún se desconocen en gran medida4,5,6.
El daño en el ADN puede causar la detención del ciclo celular e inducir apoptosis, lo que puede destruir ampliamente el potencial de las células progenitoras y, en consecuencia, afectar el desarrollo del corazón7). Se ha documentado bien que los contaminantes ambientales, incluyendo PM2.5,tienen el potencial de atacar el ADN a través de mecanismos de estrés oxidativo8,9. Tanto el desarrollo cardíaco humano como el pez cebra son sensibles al estrés oxidativo10,11,12. 8-OHdG es un marcador de daño oxidativo del ADN, y la señal γH2AX es un marcador de roturas de doble cadena de ADN. La N-acetil-L-cisteína (NAC), un precursor sintético de la cisteína intracelular y el glutatión, es ampliamente utilizado como compuesto antioxidante. En este estudio, utilizamos NAC para investigar el papel del estrés oxidativo en PM2.5- daño inducido por el ADN13.
El pez cebra como vertebrado modelo ha sido ampliamente utilizado para estudiar el desarrollo cardíaco y las enfermedades cardiovasculares humanas porque los mecanismos del desarrollo cardíaco están altamente conservados entre los vertebrados14,15. Las ventajas de usar el pez cebra como modelo incluyen su pequeño tamaño, fuerte capacidad reproductiva y bajo costo de alimentación. De particular interés para estos estudios, los embriones de pez cebra no dependen del sistema circulatorio durante el desarrollo temprano y pueden sobrevivir a una malformación cardíaca grave14. Además, su transparencia permite observar directamente todo el cuerpo bajo un microscopio. Por lo tanto, los embriones de pez cebra brindan una excelente oportunidad para evaluar los mecanismos moleculares involucrados en la inducción de la toxicidad del desarrollo cardíaco como resultado de la exposición a diversos productos químicos ambientales5,16,17. Hemos informado previamente que el estrés oxidativo inducido por PM2.5conduce al daño del ADN y la apoptosis, lo que resulta en malformaciones cardíacas en el pez cebra18. En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado para investigar el daño al ADN inducido por PM2.5en el corazón de embriones de pez cebra.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo 8-OHdG</td><td>Santa Cruz Biotechnology, EE. UU.</td><td>SC-66036</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>Sartorius, China</td><td>BSA124S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Solarbio, Beijing, China</td><td>SW3015</td><td>Para bloquear</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam, EE. UU</td>. <td>ab104139</td><td>Para contratinción nuclear.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Solarbio,Pekín,China</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Olympus, Japón</td><td>IX73</td><td>Para la obtención de imágenes de señales de fluorescencia/</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Conejo IgG Cy3</td><td>Carlsbad,EE.UU.</td><td>CW0159</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Cabra Anti-Conejo IgG FITC</td><td>Carlsbad,EE.UU.</td><td>RS0003</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína(NAC)</td><td>Adamas-Beta, Shanghai, China</td><td>616-91-1</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>QILINBEIER, China</td><td>TS-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído Sigma</td><td>, China</td><td>P6148</td><td>Hacer 4% de paraformaldehído para la fijación.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>HyClone, EE. UU.</td><td>SH30256.01</td><td>Prepare 0.1% Tween en PBS para el lavado.</td></tr><tr><td>Muestreador de PM2.5</td><td>TianHong, Wuhan, China</td><td>TH-150C</td><td>Para muestreo ininterrumpido de PM2.5 las 24 horas.</td></tr><tr><td>Sistema de acuicultura de recirculación</td><td>HaiSheng, Shanghai, China</td><td></td><td>El pez cebra se mantuvo en él.</td></tr><tr><td>Extractor Soxhlet</td><td>ZhengQiao, Shanghai, China</td><td>BSXT-02</td><td>Para la extracción de componentes orgánicos.</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon, Canadá</td><td>SMZ645</td><td>Para la disección del corazón de embriones de pez cebra.</td></tr><tr><td>Metanosulfonato de tricaína (MS222)</td><td>Sigma,China</td><td>E10521</td><td>Para anestesiar embriones de pez cebra</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma,China</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&gamma; Anticuerpo H2AX</td><td>Abcam, EE. UU</td>. <td>ab26350</td><td>Anticuerpo primario</td></tr></tbody></table>

uso de la inmunofluorescencia para detectar el daño al adn inducido por pm2.5en corazones de embriones de pez cebra

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

La exposición a partículas finas ambientales (PM2.5)puede conducir a toxicidad para el desarrollo cardíaco, pero los mecanismos moleculares subyacentes aún no están claros. La 8-hidroxi-2'desoxigenasa (8-OHdG) es un marcador de daño oxidativo del ADN y γH2AX es un marcador sensible para las roturas de doble cadena del ADN. En este estudio, nuestro objetivo fue detectar cambios en PM2.5-inducidos por 8-OHdG y γH2AX en el corazón de embriones de pez cebra utilizando un ensayo de inmunofluorescencia. Los embriones de pez cebra fueron tratados con materia orgánica extraíble (EOM) a partir de PM2.5 a 5 μg/mL en presencia o ausencia de antioxidante N-acetil-L-cisteína (NAC, 0.25 μM) a las 2 h después de la fertilización (hpf). DMSO se utilizó como control de vehículos. A 72 hpf, los corazones se diseccionaron de embriones usando una aguja de jeringa y se fijaron y permeabilizaron. Después de ser bloqueadas, las muestras fueron sondeada con anticuerpos primarios contra 8-OHdG y γH2AX. Las muestras se lavaron e incubaron con anticuerpos secundarios. Las imágenes resultantes se observaron bajo microscopía de fluorescencia y se cuantificaron utilizando ImageJ. Los resultados muestran que la OMA de PM2.5 mejoró significativamente las señales 8-OHdG y γH2AX en el corazón de los embriones de pez cebra. Sin embargo, NAC, actuando como un eliminador de especies reactivas de oxígeno (ROS), contrarrestó parcialmente el daño del ADN inducido por la OMA. Aquí, presentamos un protocolo de inmunofluorescencia para investigar el papel del daño en el ADN en los defectos cardíacos inducidos por PM2.5que se pueden aplicar a la detección de cambios en la expresión de proteínas inducidas por químicos ambientales en los corazones de embriones de pez cebra.

Este ensayo de inmunofluorescencia es un método sensible y específico para medir los cambios en la expresión de proteínas en los corazones de embriones de pez cebra expuestos a productos químicos ambientales.
En este análisis representativo, se evaluaron embriones expuestos a PM2.5 en ausencia o presencia del antioxidante NAC para la presencia de malformaciones cardíacas (Figura 1). Como ...

Este protocolo utiliza un ensayo de inmunofluorescencia para detectar el daño en el ADN inducido por PM2.5en los corazones disecados de embriones de pez cebra.

Uso de la inmunofluorescencia para detectar el daño al ADN inducido por PM2.5en corazones de embriones de pez cebra

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

Este método se puede utilizar para detectar con precisión y facilidad la expresión de proteínas objetivo en el corazón del pez cebra. El cambio en la proteína diana se detecta directamente midiendo la inmunofluorescencia. Realizar la recolección y el tratamiento de embriones de pez cebra, como se describe en el texto manuscrito.A las 72 horas después de la fertilización, transfiera los embriones a portaobjetos de vidrio y obsérquelos bajo un microscopio estereoscópico. Registre malformaciones cardíacas, como edema pericárdico, alteración del bucle y disminución del tamaño. Calcule las tasas de malformación y analice las diferencias entre los grupos utilizando ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de comparación múltiple de Turquía.Después de anestesiar los embriones con 0,6 miligramos por mililitro MS222, registre los latidos del corazón durante 30 segundos y cuantifique las frecuencias cardíacas utilizando el software Image J. Diseccione cuidadosamente los corazones de los embriones de pez cebra con una aguja de jeringa desechable bajo un microscopio estereoscópico. Use una pluma de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo en un portaobjetos de vidrio limpio.Agregue 50 microlitros de paraformaldehído al 4% a 1,25 microlitros de PBS para hacer una solución fijadora, luego coloque tres corazones disecados en un círculo de barrera hidrofóbico e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Decantar la solución bajo el microscopio y secar las muestras a temperatura ambiente durante al menos cinco minutos. Lave los portaobjetos tres veces en PBST durante cinco minutos por lavado.Agregue 50 microlitros de BSA a 1, 000 microlitros de PBST para obtener una solución de BSA al 5%, e incube los portaobjetos en una cámara húmeda durante una hora para bloquear la unión de anticuerpos no específicos. Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Diluir dos microlitros de anticuerpo monoclonal de ratón contra 8-hidroxidesoxiguanosina y dos microlitros de anticuerpo policlonal de conejo contra gamma-H2AX en 296 microlitros de PBST para obtener una solución de cóctel de anticuerpos primarios en funcionamiento.Incubar las muestras de corazón con 50 microlitros de la solución de cóctel de anticuerpos primarios en una cámara humidificada durante al menos una hora a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBST durante cinco minutos por lavado. Diluya un microlitro de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con FITC y un microlitro de anticuerpo secundario anti-conejo de cabra psy-3 en 500 microlitros de PBST para obtener una solución de cóctel de anticuerpos secundarios en funcionamiento.Incubar las muestras con los anticuerpos secundarios durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Agregue 20 microlitros de DAPI a las muestras para la tinción nuclear e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.Aplique un resbalón de cubierta al portaobjetos y séllelo con esmalte de uñas para evitar el secado y el movimiento. Imagine las muestras bajo un microscopio de fluorescencia y cuantifique la señal fluorescente del área del corazón utilizando el software ImageJ. Calcule los cambios relativos utilizando el promedio de las muestras de control DMSO y determine la significación estadística de los datos.Los embriones expuestos a PM 2.5 en ausencia o presencia del antioxidante, N-acetil-L-cisteína, o NAC, fueron evaluados para detectar la presencia de malformaciones cardíacas. La OMA de PM 2.5 costó un aumento significativo en la teratogénesis cardíaca, como edema pericárdico, asa alterada y disminución del tamaño, en comparación con los corazones tratados con DMSO-control. La frecuencia cardíaca también disminuyó significativamente en embriones expuestos a la OMA.Adición de defectos cardíacos inducidos por la OMA atenuada por NAC. Se utilizó un ensayo de inmunofluorescencia para evaluar el alcance del daño en el ADN en los tejidos tratados con OMA. Los niveles de 8-hidroxidesoxiguanosina y la expresión de gamma-H2AX aumentaron significativamente en los corazones de embriones de pez cebra tratados con EOM, lo que indica un aumento en el daño oxidativo del ADN y las roturas de doble cadena de ADN, respectivamente.El daño del ADN inducido por la OMA fue parcialmente contrarrestado por la suplementación con NAC. Al intentar este protocolo, tenga cuidado al lavar las muestras con PBS, ya que el corazón del pez cebra puede desprenderse del portaobjetos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Una forma rápida para llevar a cabo la inmunotinción del corazón embrionario del pez cebra se describe. En comparación con el enfoque de montaje inmunotinción todo, este método aumenta considerablemente la penetración de los anticuerpos, lo que permite obtener imágenes de alta resolución que revelan la estructura celular / subcelular en el corazón dentro de un tiempo de procesamiento muy reducida.

Inmunotinción de Disección del corazón embrionario de pez cebra

Este video muestra un ensayo altamente sensible basado en inmunofluorescencia para detectar el daño oxidativo inducido por PM2.5 en el corazón de embriones de pez cebra midiendo los niveles de 8-OHdG y γH2AX, que indican daño en el ADN y roturas de ADN de doble cadena, respectivamente.

Ensayo de inmunofluorescencia para detectar daños en el ADN mediados por PM2.5 en embriones de peces

Ciertas perturbaciones genéticas o la exposición a toxinas pueden interrumpir los procesos normales de desarrollo y provocar la muerte de tipos específicos de células. El análisis de la caspasa 3 activada por inmunofluorescencia de montaje completo en embriones de pez cebra revela la localización específica de la etapa y el tejido de las células que experimentan específicamente la apoptosis.

Análisis de la apoptosis en embriones de pez cebra en Todo el montaje de inmunofluorescencia para detectar la caspasa 3 activada

Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

Para analizar los perfiles de expresión de genes cardiacos durante el desarrollo del corazón del pez cebra, el ARN total tiene que ser extraído de corazones aislados. A continuación, presentamos un protocolo de recogida funcionales corazones / batiendo por disección manual de rápida a partir de embriones de pez cebra para obtener ARNm específico del corazón.

A gran escala de pez cebra embrionario del corazón Disección de Análisis transcripcional

Los niveles de proteína en células y tejidos son a menudo estrechamente regulada por el equilibrio de la producción y eliminación de proteínas. Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), la cinética de eliminación de proteínas pueden ser medidos experimentalmente in vivo.

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

El objetivo de este protocolo es detallar un método novedoso para la evaluación de la función cardíaca segmentaria en peces cebra embrionarios tanto en condiciones fisiológicas como patológicas.

El análisis de desplazamiento de la deformación mecánica miocárdica (DIAMOND) revela la heterogeneidad segmentaria de la función cardíaca en el pez cebra embrionario

Describimos herramientas optimizadas para estudiar el corazón de pez cebra in vivo con microscopía de fluorescencia de lámina de luz. Específicamente, sugerimos líneas transgénicas cardíacas brillantes y presentamos nuevas técnicas suaves de incrustación e inmovilización que evitan defectos de desarrollo y cardíacos. También se proporciona una posible línea de adquisición y análisis de datos adaptada a las imágenes cardíacas.

Microscopía de hoja de luz de dinámica cardíaca rápida en embriones de pez cebra

La manipulación optogenética de las vías de señalización puede ser una estrategia poderosa para investigar cómo se decodifica la señalización en el desarrollo, la regeneración, la homeostasis y la enfermedad. Este protocolo proporciona pautas prácticas para el uso de activadores de señalización de proteínas morfogénicas óseas (BMP) basados en el dominio de detección de luz-oxígeno-voltaje en el embrión temprano de pez cebra.

Activación de la señalización optogenética en embriones de pez cebra

Este estudio establece un método sensible de imagen basado en inmunofluorescencia para cuantificar la metilación global del ADN en corazones embrionarios individuales de pez cebra. Este enfoque supera el reto del material tisular limitado y evita la necesidad de conversión de bisulfito.

Detección de metilación global del ADN en los corazones de larvas de pez cebra

Aprende a detectar daño al ADN inducido por PM2.5 en corazones de embriones de pez cebra mediante inmunofluorescencia. Este método permite evaluar con precisión la expresión de proteínas objetivo y estudiar malformaciones cardíacas en Danio rerio.

Uso de la inmunofluorescencia para detectar el daño al ADN inducido por PM_2.5en corazones de embriones de pez cebra

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