Name: Imágenes de células vivas de matrices unicelulares (LISCA) - una técnica versátil para cuantificar la cinética celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprende a realizar imágenes de células vivas en matrices unicelulares (LISCA) mediante microscopía de barrido time-lapse. Esta técnica permite cuantificar cinéticas celulares con gran precisión estadística en entornos controlados.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Alemana de la Ciencia (DFG) al Centro de Investigación Colaborativa (SFB) 1032. El apoyo del Ministerio Federal alemán de Educación, Investigación y Tecnología (BMBF) en el marco del proyecto cooperativo 05K2018-2017-06716 Medisoft, así como una subvención de la Bayerische Forschungsstiftung son agradecidos. Anita Reiser recibió el apoyo de una beca DFG a través de la Graduate School of Quantitative Biosciences Munich (QBM).

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Aquí describimos LISCA como una técnica versátil para seguir la cinética celular de las etiquetas fluorescentes intracelulares a nivel unicelular. Para realizar un experimento LISCA exitoso, cada uno de los pasos descritos de la sección de protocolo debe establecerse individualmente y, a continuación, se deben combinar todos los pasos. Cada uno de los tres aspectos principales de LISCA cuenta con pasos cruciales.
Fabricación de microarrays unicelulares La calidad del microarray es ...

En los últimos años, la importancia de los experimentos unicelulares se ha hecho evidente. Los datos de células individuales permiten la investigación de la variabilidad célula a célula, la resolución de correlaciones de parámetros intracelulares y la detección de cinéticas celulares que permanecen ocultas en las mediciones deconjuntos 1,2,3. Con el fin de investigar la cinética celular de miles de células individuales en paralelo, se necesitan nuevos enfoques que permitan el monitoreo de las células en condiciones estandarizadas durante un período de tiempo de varias horas hasta varios días seguido de un análisis cuantitativo de datos 4. Aquí, presentamos imágenes de células vivas de matrices unicelulares (LISCA), que combina el uso de matrices microestructuradas con microscopía de lapso de tiempo y análisis de imágenes automatizado.
Se han establecido y publicado en la literatura5,6. Aquí, describimos brevemente microescala plasma-iniciado patrón de proteínas (μPIPP). Un protocolo detallado de la fabricación de matrices unicelulares utilizando μPIPP también se encuentra en la referencia7. El uso de matrices unicelulares permite la alineación de miles de células en puntos de adhesión estandarizados que presentan microambientes definidos para cada célula y, por lo tanto, reduce una fuente de variabilidad experimental (Figura 1A). Las matrices unicelulares se utilizan para monitorear los cursos de tiempo de los marcadores fluorescentes con el propósito de indicar una variedad de procesos celulares. La microscopía a largo plazo en el modo de lapso de tiempo de barrido permite monitorear una gran área de las matrices unicelulares y, por lo tanto, tomar muestras de datos unicelulares en alto rendimiento durante un tiempo de observación de varias horas o incluso días. Esto genera pilas de línea de tiempo de imágenes de cada posición de la matriz (Figura 1B). Con el fin de reducir la gran cantidad de datos de imagen y extraer los cursos de tiempo de fluorescencia unicelular deseados de una manera eficiente, se requiere un procesamiento automatizado de imágenes que aproveche el posicionamiento de las células (Figura 1C).
El reto de LISCA es adaptar los protocolos experimentales y las herramientas computacionales para formar un ensayo de alto rendimiento que genere datos cuantitativos y reproducibles de cinética celular. En este artículo proporcionamos una descripción paso a paso de los métodos individuales y cómo se combinan en un ensayo LISCA. Como ejemplo, discutimos el curso del tiempo de la expresión mejorada de la proteína fluorescente verde (eGFP) después de la entrega artificial del mRNA. La expresión del eGFP que sigue entrega del mRNA es descrita por las ecuaciones de la tarifa de reacción que modelan la traducción y la degradación del mRNA. Ajustar la función del modelo para el curso temporal de la concentración de eGFP a la lectura LISCA de la intensidad de fluorescencia para cada célula individual a lo largo del tiempo produce las mejores estimaciones de los parámetros del modelo, como la tasa de degradación del ARNm. Como resultado representativo discutimos la eficacia de la entrega del mRNA de dos diversos agentes lípido-basados de la transfección y cómo sus distribuciones del parámetro diferencian.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62025/62025fig01.jpg"> Figura 1:Representación del flujo de trabajo lisca combinando (A) micro-patrones de matrices unicelulares (B) microscopía de lapso de tiempo de barrido y (C) análisis automatizado de imágenes de series de imágenes grabadas. Las matrices unicelulares consisten en un patrón bidimensional de cuadrados adhesivos celulares con un interespacio repelente celular que conduce a una disposición de las células en el micropatrón, como se puede ver en la imagen de contraste de fase, así como la imagen de fluorescencia de las células que expresan eGFP(A). Toda el área microestructurada se toma una imagen en un modo de lapso de tiempo de escaneo tomando repetidamente imágenes en una secuencia de posiciones (B). Las series de imágenes grabadas se procesan para leer la intensidad de fluorescencia por célula a lo largo del tiempo(C). Barras de escala: 500 μm (A), 200 μm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62025/62025fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Ingeniería de polímeros Adtech Microtubos de PTFE &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>10178071</td><td></td></tr><tr><td>horno para hornear</td><td>Binder</td><td>9010-0190</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor DL 10x</td><td>Nikon</td><td>MRH20100</td><td></td></tr><tr><td>Desecador</td><td>Roth</td><td>NX07.1</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eGFP mRNA</td><td>Trilink</td><td>L-7601</td><td></td></tr><tr><td>Conector Luer Hembra a Tubo</td><td>MEDNET</td><td>FTL210-6005</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Yo Proteins</td><td>663</td><td></td></tr><tr><td>Juego de filtros eGFP</td><td>AHF</td><td>F46-002</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Tubo de silicona translúcida curada con platino</td><td>Fisher Scientific</td><td>11768088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Okolab</td><td>OKO-H201</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Binder</td><td>9040-0012</td><td></td></tr><tr><td>L-15 sin rojo fenol</td><td>Thermo Fisher</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>11668027</tr><tr><td>Luer</td><td></td><td></td> macho <td>fabricado internamente que consta de teflón</td></tr><tr><td>Luer macho a tubo Conector</td><td>MEDNET</td><td>MTLS210-6005</td><td>alternativa a los luers macho fabricados internamente</td></tr><tr><td>NaCl (5 M)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>Válvula sin aguja a conector Luer macho</td><td>MEDNET</td><td>NVFMLLPC</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software de imagen Versión 5.02.00</td></tr><tr><td>NOA81</td><td>Thorlabs</td><td>NOA81</td><td>Adhesivo óptico de curado rápido para el montaje de sistemas</td></tr><tr><td>de tubos Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO</td><td>pco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td> <td>preparada internamente</td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Diener Femto</td><td>Oblea de silicio Pico-BRS</td><td></td></tr><tr><td>PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa)</td><td>Oblea de silicio SuSoS AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>con mircorestructuras</td><td></td><td></td><td>fabricadas internamente</td></tr> Carroza pegajosa <tr><td>Sola Light Engine</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VI 0.4&nbsp;</td><td>ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de Elastómero de Silicona</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>Tango 2</td><td>M&auml; rzh&auml; usuario</td><td>00-24-626-0000</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos sin recubrimiento</td><td></td> de agua <td></td> ultrapura preparados internamente ibidi 10813 <td></td></tr><tr><td>Injekt-F Solo, 1 mL</td><td>Omilab</td><td>9166017V</td><td>con sporn de repuesto</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes de células vivas de matrices unicelulares (lisca) - una técnica versátil para cuantificar la cinética celular

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

Imágenes de células vivas de matrices unicelulares (LISCA) es un método versátil para recopilar cursos de tiempo de señales de fluorescencia de células individuales en alto rendimiento. En general, la adquisición de cursos de tiempo unicelulares de células cultivadas se ve obstaculizada por la motilidad celular y la diversidad de formas celulares. Las micro-matrices adhesivas estandarizan las condiciones unicelulares y facilitan el análisis de imágenes. LISCA combina microarrays unicelulares con microscopía de lapso de tiempo de barrido y procesamiento automatizado de imágenes. Aquí, se describen los pasos experimentales de tomar cursos de tiempo de fluorescencia unicelular en un formato LISCA. Transfectamos las células adherentes a una matriz micropatterned utilizando la codificación de ARNm para la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) y supervisar la cinética de expresión de eGFP de cientos de células en paralelo a través de microscopía de lapso de tiempo de barrido. Las pilas de datos de imagen son procesadas automáticamente por un software recientemente desarrollado que integra la intensidad de fluorescencia sobre los contornos celulares seleccionados para generar cursos de tiempo de fluorescencia unicelulares. Demostramos que los cursos de tiempo de expresión de eGFP después de la transfección de ARNm están bien descritos por un modelo de traducción cinética simple que revela la expresión y las tasas de degradación de ARNm. Otros usos de LISCA para las correlaciones del tiempo del acontecimiento de marcadores múltiples en el contexto del apoptosis de la señalización se discuten.

El enfoque LISCA permite recoger de manera eficiente cursos de tiempo de fluorescencia de células individuales. Como ejemplo representativo, describimos cómo se aplica el método LISCA para medir la expresión de eGFP unicelular después de la transfección. Los datos del experimento LISCA se utilizan para evaluar la cinética de administración de ARNm, que es importante para el desarrollo de fármacos eficientes de ARNm.
En particular, demostramos el impacto diferente de dos sistemas de administrac...

Presentamos un método para la adquisición de cursos de tiempo reportero de fluorescencia de células individuales utilizando matrices micropatterned. El protocolo describe la preparación de matrices unicelulares, la configuración y el funcionamiento de la microscopía de lapso de tiempo de barrido de células vivas y una herramienta de análisis de imágenes de código abierto para la preselección automatizada, el control visual y el seguimiento de los cursos de tiempo de fluorescencia integrados en células por sitio de adhesión.

Imágenes de células vivas de matrices unicelulares (LISCA) - una técnica versátil para cuantificar la cinética celular

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high ...

Las imágenes de células vivas de matrices unicelulares llamadas LISCA también son una lectura automatizada de los cursos de tiempo fluorescentes de cientos de células individuales. La ventaja del enfoque es que las respuestas de las células individuales se registran a partir de células aisladas espacialmente en micro ambientes idénticos, lo que permite un análisis de emisiones eficiente con grandes estadísticas. Para fabricar una matriz unicelular, utilice un bisturí para cortar una sola obra maestra de PDMs que contiene seis micro rayas de polvo de la capa de PDMs, y coloque la obra maestra en el banco de laboratorio con el patrón micro hacia arriba.Utilice una cuchilla de afeitar para cortar cada una de las seis rayas de micropatrón en un sello de PDMs, cortando algunas de las áreas estampadas para asegurarse de que los bordes del sello están abiertos. A continuación, raye cuidadosamente la lámina protectora del deslizamiento de la cubierta de una corredera de seis cámaras para marcar las posiciones del canal de la corredera y coloque la hoja de la cubierta en el banco con la lámina protectora hacia abajo. Utilice pinzas para colocar los sellos en el resbalón de la cubierta en la

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Biología

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Aprende a realizar imágenes de células vivas en matrices unicelulares (LISCA) mediante microscopía de barrido time-lapse. Esta técnica permite cuantificar cinéticas celulares con gran precisión estadística en entornos controlados.

Imágenes de células vivas de matrices unicelulares (LISCA) - una técnica versátil para cuantificar la cinética celular

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