Name: Ensayo de fuga fluorescente para investigar la desestabilización de la membrana por péptido que penetra en las células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprende el ensayo de fuga fluorescente para investigar la desestabilización de membranas por péptidos que penetran células usando liposomas con colorantes encapsulados. Este método permite estudiar la internalización celular y evaluar la translocación directa.

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Los autores desean agradecer a Emilie Josse por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la fundación "La Ligue contre le Cancer", la "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" y el "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS).

1. Preparación de vesículas unilamelares grandes (LUV)
<ol><li>Prepare luVs para su uso como imitadores de membrana celular para el ensayo de fuga de fluorescencia.</li>
	<li>Mezclar con una jeringa de vidrio Hamilton fosfatidilcolina (DOPC, 786.11 g/mol), esfingomielina (SM, 760.22 g/mol) y colesterol (Chol, 386.65 g/mol) en la relación molar 4:4:2. La solución lipídica se obtiene a partir de una solución stock de cada lípido solubilizado en un disolvente de metanol/cloroformo (3/1; volumen/volumen) a 25 mg/ml en un matraz de fondo redondo de vidrio de 25 ml. Sobre la base de 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM y 2 μmol de Chol, la solución lipídica se obtiene de la solución stock mezclando 126 μL, 117 μL y 31 μL, respectivamente. PRECAUCIÓN: El metanol es un disolvente tóxico e inflamable y el cloroformo es tóxico y cancerígeno. Ambos deben manipularse con la protección adecuada bajo un capó.</li>
	<li>Evaporar metanol/cloroformo utilizando un evaporador rotativo al vacío durante 45-60 min a 60 °C hasta la formación de una película lipídica seca.</li>
	<li>Prepare dos soluciones de búfer HEPES de stock. Prepare el tampón HEPES 1 mezclando 20 mM HEPES (238,3 g/mol) y 75 mM NaCl (58,44 g/mol) y ajuste el pH a 7,4. Prepare el tampón HEPES 2 mezclando HEPES de 20 mM y NaCl de 145 mM y ajuste el pH a 7.4. Los tampones HEPES se pueden almacenar a 4 °C durante 1 mes. NOTA: Se recomienda comprobar la osmolaridad de los buffers utilizando un osmómetro.</li>
	<li>Preparar la solución de hidratación lipídica disolviendo la membrana impermeable fluorescente colorante-quencher couple, 8-aminonaphthalene-1, 3, ácido 6-trisulfónico, sal disódica a 12.5 mM (ANTS, 427.33 g / mol) y bromuro de p-xileno-bispiridinio a 45 mM (DPX, 422.16 g / mol) en solución tampón HEPES. La mezcla de ANTS con DPX conduce a una solución de color amarillo. Para alcanzar las concentraciones de 12,5 mM de ANTS y 45 mM de DPX, disolver 21,4 mg y 76 mg, respectivamente en 4 mL de tampón HEPES 1. NOTA: La solución de hidratación lipídica se puede almacenar durante 2 semanas a 4 °C envolviendo el tubo con papel de aluminio.</li>
	<li>Reconstituir vesículas multilamelares (MLV) resuspiendo la película lipídica seca con 1 ml de la solución de hidratación lipídica y vórtice hasta la disolución de la película lipídica seca. Asegúrese de que la solución esté completamente solubilizada, ya que los pequeños agregados lipídicos tendrán un impacto negativo en los pasos anteriores. Además, revise la pared del matraz de fondo redondo de vidrio para asegurarse de que no quede una película lipídica. NOTA: La solución aparecerá opalescente y de color amarillo claro después de la solubilización.</li>
	<li>Someta las vesículas a cinco ciclos de congelación/descongelación para obtener vesículas unilamelares. Realice cada ciclo colocando el matraz de fondo redondo de vidrio durante 30 s en nitrógeno líquido para el paso de congelación, luego dejándolo en un baño de agua durante 2 minutos para el paso de descongelación. NOTA: La temperatura del agua del baño debe ser 5-10 ° C más alta que la temperatura de fusión de los lípidos.</li>
	<li>Prepare la extrusora de lípidos insertando dos soportes de filtro humidificados preliminares con tampón HEPES en cada pieza extrusora de politetrafluoroetileno (PTFE) colocada en el recipiente de la extrusora de metal.</li>
	<li>Coloque una membrana de policarbonato humidificado HEPES (tamaño de poro de 0,1 μm, diámetro de 25 mm) en la parte superior de un soporte de filtro.</li>
	<li>Monta los dos botes de extrusora de metal y atornícalos.</li>
	<li>Coloque la extrusora ensamblada en el soporte e introduzca una jeringa de 1 ml en el orificio apropiado en la extremidad de cada pieza extrusora de politetrafluoroetileno. La extrusión corresponde al paso del líquido probado de una jeringa a la otra a través de la membrana de policarbonato.</li>
	<li>Pruebe la extrusora con 1 ml de tampón HEPES cargado en una de las jeringas de 1 ml para asegurarse de que no haya fugas ni problemas.</li>
	<li>Reemplace el búfer HEPES de 1 ml con la muestra MLV.</li>
	<li>Realice la extrusión pasando la muestra de MLV de una jeringa a la otra a través de la membrana de policarbonato al menos 21 veces para obtener LUV uniformes del mismo tamaño. NOTA: La extrusión debe realizarse a una temperatura superior a la temperatura de fusión de la mezcla lipídica.</li>
</ol>2. Purificación de LUVs
<ol><li>Prepare una purificación de columna para eliminar el exceso de ANTS y DPX no encapsulados.</li>
	<li>Introducir gel de dextrano reticulado (G-50) resuspendido en medio acuoso con 0,01% de NaN3 (65 g/mol) en una columna de cromatografía líquida (Luer Lock, sin camisa, 1,0 cm x 20 cm, volumen de cama 16 mL) hasta 1 cm por debajo de la parte superior de la parte incolora de la columna.</li>
	<li>Abra el grifo y deje que el líquido fluya para asentar el gel de dextrano reticulado.</li>
	<li>Lave la columna eluyendo con 20 ml de tampón HEPES 2 y descarte el flujo de salida de la columna.</li>
	<li>Cierre el grifo una vez que se minimice el volumen muerto de disolvente por encima de la columna (<100 μL) pero suficiente para evitar cualquier secado del gel de dextrano reticulado.</li>
	<li>Coloque las UD recién extruidas (amarillas) en la columna y déjelas entrar en el gel de dextrano reticulado.</li>
	<li>Agregue continuamente el búfer HEPES 2 a la columna para realizar la purificación luV.</li>
	<li>Elute aproximadamente 2 ml de tampón HEPES 2 (no olvide llenar regularmente la parte superior de la columna para evitar secar el gel de dextrano reticulado): la solución de ANTS y DPX amarillo libre migra más lentamente que los liposomas.</li>
	<li>Comience a recolectar LUV purificadas en tubos (1.5 ml).</li>
	<li>Observe las gotas de eluyente de la columna y cuando se vuelven opalescentes, contienen liposomas. Cambie el tubo para recuperar la fracción que contiene LUV.</li>
	<li>Elute hasta que las gotas ya no sean opalescentes (~1 mL). Después, eluir otros 0,5 ml en una fracción separada y luego dejar de eluir. NOTA: Los estándares ahora están disponibles en una amplia gama de pesos moleculares, como kits o pesos moleculares individuales para calibrar el volumen de elución de los LUV.</li>
	<li>Envuelva los tubos con los LUV en papel de aluminio para evitar el blanqueo del tinte de fluorescencia.</li>
	<li>Lavar la columna con tampón HEPES 2 de 20 ml.</li>
	<li>Los UDV se pueden almacenar durante una semana a 4 °C. NOTA: Dado que la estabilidad de la LUV puede depender de la concentración y composición de la LUV, así como de la fuerza iónica, el tamaño de las LUV debe controlarse mediante un instrumento de dispersión dinámica de la luz (DLS) (ver sección 4. Caracterización del tamaño y homogeneidad de LUV) antes de cada prueba.</li>
</ol>3. Cuantificación de la concentración de UDV
<ol><li>Estimar la concentración de LUV mediante un kit de cuantificación de fosfolípidos, que permite la evaluación de la concentración de colina19. Este ensayo podría aplicarse cuando los fosfolípidos con colina que contienen cabeza polar son sustanciales (>50% de las LU).</li>
	<li>Prepare el reactivo de color disolviendo 18 mg de sustrato de cromógeno en 3 ml de tampón proporcionado.</li>
	<li>Cargue una cubeta de poliestireno, 10 x 10 x 45 mm, con 3 ml de reactivo de color.</li>
	<li>Utilice el reactivo de color puro como condición en blanco (Blank). Añadir 20 μL de muestra de LUV (ensayo) o 20 μL de solución patrón de concentración conocida de colina (estándar).</li>
	<li>Mezclar bien e incubar durante 5 min a 37 °C todas las condiciones (Blank, Test y Standard).</li>
	<li>Mida la absorbancia (densidad óptica, OD) de la muestra de prueba y la solución estándar con la solución en blanco como control a 600 nm con un espectrofotómetro.</li>
	<li>Compruebe los valores de OD que permiten estimar la concentración de lípidos de las UDV, C[LUV], en equivalente de colina en comparación con el estándar de concentración conocida.</li>
	<li>Realice el cálculo utilizando la siguiente ecuación: C[LUV] (mol / l) = (Muestra OD / Estándar OD) x C[Estándar] (mol / l) NOTA: El kit de cuantificación de fosfolípidos proporcionó una solución estándar de cloruro de colina (139,6 mg/l) a 54 mg/dL correspondiente a la concentración molar de C[Standard] = 3,87 mmol/L. Muestra de OD y Estándar de OD son las absorbancias medidas a 600 nm para las soluciones de LUV y colina, respectivamente.</li>
</ol>4. Caracterización del tamaño y homogeneidad de luV
<ol><li>Realice una medición utilizando un instrumento DLS para determinar el tamaño de LUV (en nm) y el índice de polidispersidad (PdI).</li>
	<li>Programe el "procedimiento de operación estándar" (SOP) apropiado indicando la viscosidad del solvente / tampón y la cubeta utilizada.</li>
	<li>Coloque 500 μL de la solución de LUV en una cubeta semi-micro de poliestireno.</li>
	<li>Inserte la cubeta semi-micro de poliestireno en un instrumento DLS.</li>
	<li>A temperatura ambiente, mida la distribución del tamaño en términos de tamaño medio (promedio Z) de la distribución de partículas y de homogeneidad (índice de polidispersidad, PdI).</li>
	<li>Todos los resultados se obtienen a partir de dos mediciones independientes realizadas cada una en tres ciclos repetitivos. NOTA: Los valores estándar para luVs serán un tamaño medio de 137 ± 7 nm con un PdI de 0.149 ± 0.041.</li>
</ol>5. Preparación de soluciones peptídicas
<ol><li>Prepare una solución de stock del péptido, que debe analizarse para el ensayo de fuga.</li>
	<li>Disolver el polvo peptídico (>95% de pureza) en agua pura (por ejemplo, 1 mg de péptido en agua pura de 500 μL). NOTA: Se recomienda diluir los péptidos en agua pura y evitar la solubilización con dimetilsulfóxido (DMSO), que podría inducir artefactos (por ejemplo, permeabilización de membrana20).</li>
	<li>Vórtice la solución peptídica durante 5 s.</li>
	<li>Sonicar la solución peptídica en un baño de sonicación en agua durante 5 min y luego centrifugar durante 5 min a 12,225 x g. Recoger el sobrenadante para la determinación de la concentración.</li>
	<li>Mida la absorbancia a 280 nm de tres diluciones peptídicas independientes y luego calcule la concentración de péptidos utilizando su coeficiente de extinción molar ε (dependiendo del contenido de triptófano y tirosina en la secuencia peptídica) y la regla de Beer-Lambert. NOTA: Si el péptido contiene triptófano y tirosina, el coeficiente de extinción molar ε se calcula sobre la base de triptófano ε = 5.690 M-1cm-1 y tirosina ε = 1.280 M-1cm-1. Si la secuencia peptídica no contiene triptófano ni tirosina, se podría realizar otro ensayo colorimétrico para medir la concentración (por ejemplo, BCA o Bradford).</li>
	<li>Diluir la solución peptídica en agua pura hasta una solución final de 100 μM y almacenar a 4 °C. NOTA: En agua pura, no se produce degradación peptídica durante el almacenamiento a 4 °C. Sin embargo, la concentración de péptidos debe medirse cada 2 semanas para garantizar que no se produzca evaporación del agua.</li>
</ol>6. Ensayo de fuga de fluorescencia
<ol><li>El ensayo de fuga de fluorescencia se mide en un espectrofluorómetro a temperatura ambiente. La longitud de onda de excitación y emisión se fija en Ex = 360 nm ± 3 nm y Em = 530 nm ± 5 nm, respectivamente.</li>
	<li>Diluya las LUV en 1 ml del tampón HEPES 2 a una concentración final de 100 μM en una cubeta de fluorescencia de cuarzo. Agregue un agitador magnético para homogeneizar la solución durante el experimento.</li>
	<li>Mida las UDVs solas durante los primeros 100 s, entre t = 0 s y t = 99 s para acceder a la fluorescencia de fondo. NOTA: Las LUVs por sí solas también se pudieron medir durante todo el experimento (15 min) para acceder a la fluorescencia de fondo y las posibles fugas.</li>
	<li>A partir de entonces, mida la fuga como un aumento en la intensidad de la fluorescencia tras la adición de alícuotas de solución peptídica durante los próximos 900 s (15 min). Este protocolo se lleva a cabo para cada concentración de péptido ensayada de 0,1 μM a 2,5 μM.</li>
	<li>Finalmente, se logró una fluorescencia del 100% mediante la solubilización de las LUV mediante la adición de 1 μL de Tritón X-100 (0,1%, v/v), dando como resultado la sonda completamente insaciada entre t = 1.000 s y t = 1.100 s.</li>
</ol>7. Cuantificación de la fuga
<ol><li>Suprimir los valores obtenidos después de t = 1.090 s con el fin de mantener el mismo número de puntos para cada condición probada.</li>
	<li>Calcule la fluorescencia mínima, Fmin,haciendo el promedio de 50 puntos entre t = 0 s y t = 49 s (LUVs solas).</li>
	<li>Calcular la fluorescencia máxima, Fmax,haciendo la media de 50 puntos entre t = 1.041 s y t = 1.090 s (LUVs con Tritón X-100).</li>
	<li>Calcule el porcentaje de fuga (%Fuga) en cada punto de tiempo (t = x), de acuerdo con la siguiente ecuación: %Fuga(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100</li>
	<li>Calcular la media y la desviación estándar para los valores obtenidos con diferentes preparaciones de LUV (n ≥ 2) para la misma condición.</li>
	<li>Trazar el porcentaje de fuga, %Fuga(t=x), en función del tiempo (s).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

El ensayo de fuga de fluorescencia presentado es un método simple y rápido para abordar la desestabilización de la membrana por péptido que penetra en la célula. Fácil de hacer, también permite una comparación indirecta entre diferentes péptidos que interactúan con la membrana u otras moléculas que interactúan con la membrana. En cuanto a los pasos críticos del protocolo, ya que este ensayo proporciona valores relativos entre la línea de base (LUVs solas) y la liberación máxima de fluorescencia (condición de Triton), gen...

Después de su descubrimiento en los años noventa, se desarrollaron péptidos penetrantes en las células (CPP) para promover una entrega celular eficiente de cargas a través de la membrana plasmática1,2. Los CPP suelen ser péptidos cortos, generalmente de 8 a 30 aminoácidos, que tienen una amplia variedad de orígenes. Primero se definieron como portadores de "translocación directa", lo que significa que pudieron cruzar la membrana plasmática y transferir una carga a las células independientemente de cualquier vía endocitótica, ni el requerimiento de energía ni la participación del receptor. Sin embargo, investigaciones posteriores revelaron que estas primeras observaciones provenían principalmente de la sobreestimación de la fluorescencia debido al artefacto experimental y / o a los protocolos de fijación utilizando metanol3. Hoy en día, es ampliamente aceptado que la captación de CPP tiene lugar tanto por endocitosis como por translocación independiente de la energía4,5,6,7 dependiendo de diferentes parámetros como la naturaleza de la carga, el enlace utilizado entre CPP y carga, la línea celular estudiada, etc.
Los CPP se pueden utilizar como agentes de transfección de acuerdo con dos estrategias, ya sea que impliquen un enlace químico (estrategia covalente) o interacciones electrostáticas/hidrofóbicas (estrategia no covalente) entre el CPP y su carga8,9,10,11. Aunque ambas estrategias han demostrado su eficiencia en la transferencia celular de varias cargas, la comprensión del mecanismo de internalización por parte de los CPPs aún está en controversia y el equilibrio entre las vías de endocitosis o la penetración directa sigue siendo difícil de medir12,13. Aunque se dispone de un conjunto de herramientas y estrategias experimentales para abordar claramente la implicación de los procesos endocíticos, la translocación directa parece, sin embargo, más difícil de caracterizar ya que implica interacciones más discretas con los componentes de la membrana plasmática. Las membranas biológicas suelen estar compuestas por numerosos componentes, desde fosfolípidos hasta proteínas de membrana, que pueden variar según el tipo celular y/o el entorno (condiciones de estrés, división celular, etc.). Esta diversidad de composición, y en consecuencia la ausencia de un modelo universal de membrana celular no permite estudios de una sola manera. Sin embargo, para eludir estas limitaciones, se desarrollaron enfoques paso a paso con membrana artificial o extractos de membrana. Desde pequeñas vesículas unilamelares hasta enfoques monocapa, cada modelo era claramente pertinente para responder preguntas específicas14,15. Entre ellas, las grandes vesículas unilamelares (LUV) constituyen un modelo de imitación de membrana apropiado para estudiar las interacciones péptido/membrana como un punto clave en el proceso de internalización.
En este contexto, el siguiente protocolo describe la investigación de los efectos de los péptidos y las interacciones péptido/membrana sobre la integridad de las LUV a través de la monitorización tanto de un colorante fluorescente aniónico como de su correspondiente quencher policationico encapsulado en liposomas. Esta herramienta se utiliza para estudiar las interacciones CPP/membrana con el fin de comprender si son capaces de realizar una translocación directa de membrana. Aunque generalmente se aplica para comparar diferentes péptidos que interactúan con la membrana, este ensayo de fuga de fluorescencia LUV también podría usarse para investigar tanto conjugados CPP-carga (estrategia covalente) como complejos CPP:carga (estrategia no covalente).
Por lo tanto, el presente protocolo se ejemplificará por primera vez con los péptidos anfipáticos (WRAP) ricos en triptófano (W) y arginina (R) recientemente desarrollados16. WRAP es capaz de formar nanopartículas basadas en péptidos para entregar rápida y eficientemente pequeño ARN interferente (siRNA) en varias líneas celulares16. Se monitorearon las propiedades de fuga de fluorescencia del péptido WRAP solo o las nanopartículas basadas en WRAP cargadas de siRNA para caracterizar su mecanismo de internalización celular. Demostramos que su mecanismo de internalización implicaba principalmente la translocación directa7. En un segundo ejemplo, el péptido WRAP se conjudicó covalentemente con el péptido interferente proteína/proteína iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 y su capacidad para desestabilizar membranas se comparó en un ensayo de fuga de fluorescencia con iCAL36 acoplado a Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), otro CPP.
Finalmente, se discutirán las ventajas y limitaciones del método tanto desde un punto de vista tecnológico como con respecto a la relevancia biológica.

<table><tbody><tr><td>Matraz de vidrio de fondo redondo de 25</td><td>mL Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-aminonaftaleno-1, 3, 6-trisulfónico, sal disódica (ANTS)</td><td>Invitrogen</td><td>A350</td><td>Proteger de la luz&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloroformo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DOPC (dioleoilfosfatidilcolina)</td><td>Avanti Polar</td><td>850375P</td><td>Proteger del aire</td></tr><tr><td>Extrusora</td><td>Avanti Polar</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorímetro</td><td>PTI Serlabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &micro; L jeringa de vidrio</td><td>Hamilton</td><td>705N</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>LabAssay Fosfolípido&nbsp;</td><td>WAKO&nbsp;</td><td>296-63801</td><td></td></tr><tr><td>columna de cromatografía líquida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414902</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de policarbonato Nuclepore (0.1 &micro; m tamaño de poro, 25 mm de diámetro)</td><td>Cubeta</td><td></td> de poliestireno Whatman 800309<td></td></tr><tr><td>, 10 x 10 x 45 mm</td><td>Grener Bio-One</td><td>614101</td><td></td></tr><tr><td>semimicro cubeta de poliestireno, DLS</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB55924</td><td></td></tr><tr><td>bromuro de p-xileno-bispiridinio (DPX)</td><td>Invitrogen</td><td>X1525</td><td>Proteger de la luz&nbsp;</td></tr><tr><td>cubeta de fluorescencia de cuarzo</td><td>Hellma</td><td>109.004F-QS</td><td></td></tr><tr><td>sistema rotavapor&nbsp;</td><td>Heidolph</td><td>Z334898</td><td></td></tr><tr><td>Resina Sephadex G-50</td><td>Amersham</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Bañera Sonicator USC300T</td><td>VWR</td><td>142-6001</td><td></td></tr><tr><td>Esfingomielina</td><td>Avanti Polar</td><td>860062P</td><td>Protégete del aire</td></tr><tr><td>Tritón X-100&nbsp;</td><td>Eromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Zetaziser NanoZS&nbsp;</td><td>Malvern</td><td>ZEN3500</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de fuga fluorescente para investigar la desestabilización de la membrana por péptido que penetra en las células

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Los péptidos penetrantes en las células (CPP) se definen como portadores que son capaces de cruzar la membrana plasmática y transferir una carga a las células. Una de las principales características comunes requeridas para esta actividad resultó de las interacciones de los CPP con la membrana plasmática (lípidos) y más particularmente con componentes de la matriz extracelular de la propia membrana (sulfato de heparápalo). De hecho, independientemente de la translocación directa o de la internalización dependiente de la endocitosis, las bicapas lipídicas están implicadas en el proceso de internalización tanto a nivel de la membrana plasmática como a nivel del tráfico intracelular (vesículas endosómicas). En este artículo, presentamos un protocolo detallado que describe los diferentes pasos de una gran formulación, purificación, caracterización y aplicación de vesículas unilamelares (LUV) en el ensayo de fuga de fluorescencia para detectar una posible desestabilización / interacción de la membrana CPP y abordar su papel en el mecanismo de internalización. Las UDV con una composición lipídica que refleja el contenido de la membrana plasmática se generan para encapsular tanto un tinte fluorescente como un quencher. La adición de péptidos en el medio extravesicular y la inducción de interacciones péptido-membrana en las UDV podrían inducir de manera dependiente de la dosis un aumento significativo de la fluorescencia que revela una fuga. Aquí se proporcionan ejemplos con los péptidos anfipáticos (WRAP) ricos en triptófano (W) y arginina (R) recientemente desarrollados, que mostraron una entrega rápida y eficiente de siRNA en varias líneas celulares. Finalmente, se discute la naturaleza de estas interacciones y la afinidad por los lípidos para comprender y mejorar la translocación de la membrana y / o el escape endosomal.

El principio del ensayo de fuga de fluorescencia se muestra en la Figura 1. En detalle, las grandes vesículas unilamelares (LUV) que encapsulan un tinte fluorescente y un quencher (sin señal de fluorescencia) se tratan con la biomolécula de interés. Debido a la interacción del péptido con las membranas lipídicas, lo que podría implicar permeabilidad de la membrana, reorganización o incluso ruptura, el colorante de fluorescencia y el quencher se liberan de las...

El ensayo de fuga de fluorescencia es un método simple que permite la investigación de las interacciones péptido/membrana con el fin de comprender su participación en varios procesos biológicos y especialmente la capacidad de los péptidos que penetran en las células para alterar las bicapas de fosfolípidos durante un proceso de translocación celular directa.

Ensayo de fuga fluorescente para investigar la desestabilización de la membrana por péptido que penetra en las células

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

Este ensayo de fuga de fluorescencia es un método sencillo para tratar la desestabilización de la membrana a través de biomoléculas. Usando liposomas encapsulados en colorantes fluorescentes, se puede usar para comparar diferentes péptidos que interactúan con membranas. Este método es especialmente útil para investigar la desestabilización de la membrana por péptidos que penetran en las células con el fin de comprender el mecanismo de internalización celular y evaluar su participación en la translocación directa de la membrana.En comparación con las membranas biológicas, los liposomas permiten controlar la composición de los fosfolípidos para imitar diferentes valores de lípidos, como las membranas plasmáticas, endosómicas o mitocondriales. Para preparar los LUV para su uso como imitadores de la membrana celular para un ensayo de fuga de florescencia, use una jeringa de vidrio Hamilton para mezclar fosfatidilcolina, esfingomielina y colesterol en una proporción molar de 4:4:2. Utilice un evaporador rotativo para evaporar el metanol cloroformo al vacío durante 46 a 50 minutos a 60 grados centígrados hasta que se forme una película lipídica seca.Para reconstituir las vesículas multilaminares, vuelva a suspender la película lipídica seca con un mililitro de solución de hidratación lipídica y vórtese completamente hasta que la película lipídica seca se haya disuelto. Después de confirmar que se ha incorporado todo el lípido y que no queda ninguna película en los lados del matraz, congele y descongele las vesículas cinco veces durante 30 segundos en nitrógeno líquido y dos minutos en un baño de agua a 30 grados por ciclo. Para preparar la extrusora de lípidos, inserte dos soportes de filtro con tampón HEPES en cada pieza de la extrusora de PTFE dentro del recipiente metálico de la extrusora y coloque una membrana de policarbonato humidificado HEPES de poro de 0,1 micras en la parte superior de un soporte de filtro.Atornille los dos recipientes metálicos del extrusor y coloque el extrusor ensamblado en el soporte. Para verificar que la extrusora no tenga fugas u otros problemas, introduzca una jeringa vacía de un mililitro en el orificio apropiado en un extremo de la pieza de la extrusora de PTFE y otra jeringa de un mililitro cargada con un mililitro de tampón HEPES en el otro extremo, luego entregue la muestra de vesícula multilaminar a la extrusora de la misma manera y empuje la muestra de una jeringa a la otra a través de la membrana de policarbonato al menos 21 veces para obtener LUV uniformes. Para purificar los LUV, agregue LUV recién extruidos en una columna de cromatografía líquida y deje que las vesículas ingresen al gel de dextrano reticulado.Agregue continuamente el tampón HEPES dos a la columna y comience a eluir aproximadamente dos mililitros del tampón HEPES dos. La solución amarilla libre de ANTS y DPX migrará más lentamente que los liposomas. Después de eluir un mililitro, comience a recolectar los LUV purificados en tubos de 1,5 mililitros.Cuando las gotas de eluyente se vuelvan opalescentes, cambie el tubo para recuperar la fracción que contiene LUV. Cuando las gotas ya no sean opalescentes, eluya otros 500 microlitros en una fracción separada antes de detener la elución. Para determinar el tamaño del LUV y el índice de polidispersidad, indique la viscosidad del solvente en la semimicrocubeta de poliestireno que se utilizará en el experimento y el sistema de dispersión dinámica de luz y agregue 500 microlitros de la solución LUV a la cubeta, luego cargue la cubeta en el instrumento y mida la distribución del tamaño en términos del tamaño medio de la distribución de partículas y la homogeneidad.Para medir la fuga de fluorescencia, diluya los LUV en un mililitro de tampón HEPES dos en una cubeta de fluorescencia de cuarzo hasta una concentración final de 100 micromolares y agregue un agitador magnético para facilitar la homogeneización de la solución durante el experimento. Mida los LUV solos durante los primeros 100 segundos para evaluar la fluorescencia de fondo antes de medir la fuga como un aumento en la intensidad de la fluorescencia tras la adición de alícuotas de solución peptídica durante los siguientes 900 segundos. Para medir el 100% de la fuga de florescencia como control positivo, agregue un microlitro de Triton X-100 a los LUV para solubilizar las vesículas, lo que resulta en un apagado completo de la sonda durante los últimos 100 segundos del análisis.A continuación, utilice la fórmula para calcular el porcentaje de fugas en cada punto de tiempo. En ausencia de péptidos, no se observa fuga de fluorescencia de los LUV. La adición de WRAP a los LUV induce un aumento significativo de la fluorescencia, revelando una importante fuga de LUV y liberación de ANTS.Después de 15 minutos, se obtiene una fuga de aproximadamente el 67% en presencia de WRAP de 2,5 micromolares en comparación con el control positivo de Triton. Por el contrario, cuando WRAP se ensambla a la misma concentración con un pequeño ARN interferente para formar nanopartículas basadas en péptidos, la fuga es 1,5 veces más débil en comparación con el péptido libre. Cuando se utiliza el péptido conjugado Penetratin-iCAL, no se detecta un aumento significativo de la fluorescencia, mientras que la adición del péptido WRAP-iCAL induce una fuga neta caracterizada por una señal fluorescente muy fuerte a la misma concentración de 2,5 micromolares.Estos resultados indican que el ensayo de fuga de fluorescencia se puede utilizar para revelar la capacidad de algunos péptidos que penetran en las células para realizar interacciones entre la membrana peptídica y dar lugar a una permeabilidad de la membrana más o menos pronunciada. Este método favorece una rápida identificación de las interacciones de los péptidos de membrana que conducen a la desestabilización de la membrana con el fin de descifrar el mecanismo de internalización de los péptidos que penetran en las células u otros péptidos activos de membrana como los fotogénicos o antimicrobianos. En caso de interacción péptido-lípido sin inducción de fugas, se requieren otros enfoques como experimentos de fluorescencia de triptófano.Este ensayo de fuga de fluorescencia se usa ampliamente en el campo de la CPP y puede proporcionar información importante sobre la translocación celular o el escape endosomal.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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