Montaje Y Operación De Un Dispositivo Acoustofluidic Para La Entrega Mejorada De Compuestos Moleculares A Las Células

Este protocolo describe el montaje y la operación de un sistema acoustofluidic que pueda entregar eficientemente las biomoléculas para una variedad de investigación y de usos terapéuticos célula-basados. La principal ventaja de este sistema es que permite la entrega rápida de biomoléculas a las células mientras mantiene su viabilidad. Es una tecnología de plataforma que permite transformar las células para una variedad de aplicaciones terapéuticas celulares, como el tratamiento del cáncer.

Comience combinando 54 gramos de base pdms y seis gramos de agente de curado en una taza. Mezcle vigorosamente y bien con una espátula durante al menos un minuto, luego coloque la taza con la solución pdms en un desecador durante aproximadamente 30 minutos o hasta que se eliminen las burbujas de aire remanentes. Coloque una oblea recubierta de fotorresistencia con los patrones hacia arriba en una placa de Petri de 150 milímetros, luego vierta la solución pdms sobre el molde.

Si es necesario, coloque la placa de Petri dentro de un desecador y aplique vacío hasta que desaparezcan las burbujas de aire remanentes. Transfiera la placa de Petri a un horno de laboratorio y hornee durante dos horas a 60 grados Celsius para curar el PDMS. Después de curar, retire cuidadosamente el PDMS de la placa de Petri cortando alrededor de los bordes de la oblea con una cuchilla de afeitar.

Corte cada dispositivo individual con un cuchillo o una cuchilla de afeitar, luego haga agujeros a través de los puertos de entrada y salida con un punzón de biopsia de 2.5 milímetros. Después de tratar el dispositivo PDMS con plasma de oxígeno, coloque inmediatamente cada dispositivo en un portaobjetos de microscopio de vidrio de cal de soda limpia con canales que dan a la superficie del vidrio. Permita que los dispositivos se unan durante la noche a temperatura ambiente.

Aplique suavemente silicona a la superficie del transductor piezoeléclico de un centímetro de diámetro a un espesor de uno a dos milímetros, luego alinee cuidadosamente el transductor con una espiral concéntrica y presione suavemente en la parte inferior del portaobjetos del microscopio de vidrio. Conecte un microcontrolador a una computadora con un cable USB A a B. Un indicador LED de energía verde debe iluminarse.

Utilice el software asociado en el equipo para cargar un programa que genera una señal de ocho megahercios. Suerda un cable de una pulgada calibre 22 al extremo de cada cable en el transductor PZT. A continuación, utilícalo para conectar el cable terminal negativo del transductor PZT a un pin GND.

Conecte el cable terminal positivo del transductor PZT al pin de salida a través del cable soldado. Corte las secciones de tres a seis pulgadas de tubo de plástico blando de PVC tygon y empuje el tubo en los puertos de entrada y salida. Puede ser necesario rotar el tubo mientras se aplica presión hasta que encaje en la abertura.

Opcionalmente, se puede aplicar pegamento en la unión para unir el PDMS y el tubo. Opcionalmente, monte el dispositivo acoustofluidic y el microcontrolador en una caja impresa en 3D. Monte el depósito de microfluídico de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Corte una sección de tres a seis pulgadas de 1/16 de pulgada de diámetro interior tygon PVC soft plastic tubing y empuje sobre el tubo de diámetro interior de 1/32 pulgadas de la salida del depósito microfluídico. Opcionalmente, envuelva la unión con película de parafina para evitar fugas. Llene una jeringa de 60 mililitros con aire ambiente en el lado del reservorio microfluídico.

Ajuste la bomba de la jeringuilla a una tarifa de 200 mililitros por hora para empujar las soluciones del agente de contraste a través del dispositivo acoustofluidic en un caudal volumétrico de 50 mililitros por hora y recoja las muestras de la salida del dispositivo en un tubo de la centrífuga del 50 mililitros. Prepare una solución de fofolípidos en un vial de centelleo de 20 mililitros agregando 25 miligramos de DSPC, 11.6 miligramos de DSEPC, 0.26 miligramos de DSPG y 0.88 miligramos de estearato de polioxietileno40. Añadir cloroformo hasta que se disuelvan todos los fosfolípidos.

Evaporar el cloroformo en un desecador durante 48 horas para formar una película lipídica seca. Rehidrate la espuma con 10 mililitros de PBS estéril, luego sonice la solución lipídica durante tres minutos al 40% de amplitud para formar una solución micelar catiónica. Después de la sonicación, la solución de folípidos se puede almacenar a dos a seis grados Centígrados durante un mes.

Para preparar agentes de contraste de ultrasonido, agregue 200 microlitros de solución micelar catiónica en 600 microlitros de PBS estéril a un vial de septo de vidrio de dos mililitros. Selle el vial engarzando la tapa. Use una aguja calibre 20 de 1.5 pulgadas para llenar el espacio de la cabeza del vial con gas decafluorobutano durante 30 segundos.

Amalgamar el vial para formar agentes de contraste de ultrasonido llenos de gas perfluorobutano. Añadir 25 microlitros de solución de agente de contraste de ultrasonido por mililitro de solución celular. A continuación, bombee inmediatamente el agente de contraste combinado y la mezcla celular a través del dispositivo acoustofluidic.

Este protocolo produce un sistema acoustofluidic que se puede utilizar para aumentar entrega molecular intracelular en variedades de células múltiples. La entrega intracelular de un compuesto fluorescente, fluoresceína, a las células de T humanas primarias fue mejorada con el tratamiento acoustofluidic comparado a un grupo de control no tratado. La intensidad de la fluorescencia de las células de T aumentó en cinco veces después del tratamiento, indicando la entrega aumentada de la fluoresceína.

La viabilidad de la célula disminuyó levemente después de un tratamiento acoustofluidic, pero permanecía sobre el tratamiento de Acoustofluidic del 80% aumentó la entrega intracelular de una trehalosa compuesta conservante a las células humanas del carcinoma del pulmón A549 comparadas al flujo solamente y a las células en el grupo de control no tratado. La adición de las microburbujas catiónicas a la solución celular es fundamental. La entrega intracelular de biomoléculas se limitará sin microburbujas catiónicas en solución.

Esta plataforma permite la entrega intracelular de diversas biomoléculas, que pueden alterar la función celular con fines de investigación o terapéuticos. Después de completar este procedimiento, se puede realizar una caracterización celular adicional para evaluar el impacto de la entrega de varias biomoléculas.