Aislamiento e imágenes de regiones de marcapasos intactas y vivas de la pelvis renal del ratón mediante seccionamiento del vibratomo

Este protocolo produce regiones intactas de marcapasos de la pelvis renal, el órgano del músculo liso dentro del riñón que bombea la orina al uréter y a la vejiga. A diferencia del aislamiento de células de la pelvis renal, este enfoque proporciona ambientes intactos in situ de regiones de marcapasos de pelvis renal y una preparación más fisiológica para estudiar la marcapasos de la pelvis renal. Un individuo que nunca ha realizado esta técnica puede tener dificultades para cortar secciones uniformes.

Un usuario primerizo debe asegurarse de que el riñón esté nivelado en la etapa de vibratomo y no acelere el proceso de corte. Usando pinzas de tejido interno y tijeras de disección interna, pellizque los intestinos y levántelos lejos de la pared abdominal. Corte simultáneamente la parte inferior de los intestinos libres del cuerpo en el duodeno proximal y el colon distal para obtener acceso al espacio retroperitoneal que contiene los riñones.

Pellizque suavemente y levante el extremo distal del uréter con pinzas de tejido. Usando las tijeras de disección, corte debajo del uréter pellizcado hacia el riñón hasta que se haya liberado del tejido conectivo circundante. Una vez que los riñones están expuestos, extráigalos individualmente.

Llene un plato recubierto de elastómero de silicio con una solución de KRB helada. Transfiera el riñón al plato de disección y asegúrese de que esté completamente sumergido. Use tijeras de resorte fino y pórceps internos para eliminar el tejido adiposo de la base del riñón para exponer la pelvis renal distal, o RP, y el uréter proximal.

Retire el uréter proximal y una porción de la RP distal de la base con tijeras de resorte fino y pórceps. Perfore la cápsula renal externa con pórceps de punta fina, inclinando las puntas lejos del cuerpo renal. Usando pinzas con cada mano, pellizque los extremos sueltos de la cápsula y pélelos hasta que la membrana de la cápsula renal restante se elimine por completo.

Inserte una cuchilla de afeitar en el soporte de la cuchilla del instrumento vibratome y ajuste el ángulo de holgura de la cuchilla a aproximadamente 18 grados. Ajuste los parámetros de la cuchilla como se menciona en el manuscrito de texto, asegurando que el grosor de la sección renal no exceda los 150 micrómetros, lo que afectaría negativamente los experimentos de imágenes de iones de calcio. Use forrórceps de extremo romo para agarrar suavemente y extraer el riñón preparado de la solución de KRB helada.

Coloque inmediatamente el riñón sobre papel absorbente durante aproximadamente dos a cuatro segundos para eliminar el exceso de humedad externa. Enrolle suavemente el riñón a través del papel absorbente para asegurarse de que todos los lados del parénquima se hayan secado para que haya una adhesión óptima del riñón a la etapa de vibratomo. Aplique inmediatamente una capa delgada de pegamento de cianoacrilato a la base de la placa de muestra de vibratomo y use forzapas de extremo romo para colocar el uréter renal hacia abajo en el área cubierta de pegamento.

Aplique suavemente presión hacia abajo en la parte superior del riñón con el borde plano de las pórceps durante aproximadamente 10 a 20 segundos para secar el pegamento. Asegure firmemente la placa de muestra en la parte inferior de la bandeja tampón y ajuste el nivel de solución KRB para que la parte superior del riñón esté completamente sumergida. Para la sección automática del vibratomo, seleccione las posiciones inicial y final del ciclo de corte de la cuchilla del vibratomo de 0,5 a 1 centímetro de altura del riñón para asegurarse de que todo el plano renal se esté seccionando.

Inicie el proceso de corte automático, asegurándose de que la cuchilla haga contacto con el riñón. Usando forrórceps, recoja las secciones que se liberan del riñón y transfiéralas inmediatamente a los pozos individuales. Continúe con el protocolo de seccionamiento y use un microscopio de luz para identificar las regiones de PKJ en las rebanadas de riñón hasta que las regiones de PKJ se vuelvan más evidentes.

Llene una placa de imágenes recubierta de elastómero de silicio con una solución de KRB helada. Transfiera una rebanada de riñón individual al plato. Inserte alfileres Minutien alrededor de la periferia de una rebanada de riñón para asegurar la sección a la base del plato de imágenes.

Coloque la placa de imágenes en el escenario de un microscopio confocal de disco giratorio vertical e inmediatamente comience a perfundir con la solución KRB. Use una lente de objetivo de inmersión en agua de bajo aumento para localizar la rebanada de riñón. Centrar el campo de imágenes en las áreas de la rebanada donde el PKJ está presente utilizando puntos de referencia.

Una vez que se encuentre el PKJ, use una lente de objetivo de inmersión en agua de mayor aumento para ampliar el área de interés. Distinguir diferentes células de interés en diferentes tipos de duraciones transitorias de iones de calcio en la pared PKJ. Una vez que se hayan identificado las células de interés, ajuste la intensidad del láser para obtener una buena relación señal-ruido y grabe imágenes a una frecuencia de muestreo temporal entre 16 y 32 Hertz.

Las imágenes microscópicas ligeras de secciones renales enteras muestran puntos de referencia anotados de una sola región PKJ. Múltiples regiones PKJ se presentan cerca de la médula interna y el riñón distal. Las ubicaciones de las arterias renales de PKJ y los límites de PKJ se muestran aquí.

Aquí se muestra una sección de PKJ de un ratón que expresa GCaMP en células PDGFR alfa positivas. La delgada pared PKJ suspendida entre el tejido parenquimatoso se puede distinguir utilizando puntos de referencia como la arteriola renal. La expresión de GCaMP6f en este tejido transgénico específico se extiende a lo largo de todo el ancho del PKJ a través de las capas musculares y adventicias.

En las rodajas renales PDGFR alfa GCaMP6f positivas, una red de células que generalmente se extiende a lo largo del ancho de la pared PKJ es fluorescente y muestra transitorios oscilantes de iones de calcio de varias duraciones y frecuencias. En las rodajas renales positivas para SMC GCaMP3, una capa de células positivas para GCaMP3 está presente en la capa muscular. Un mapa espaciotemporal muestra que las células PDGFR alfa positivas ubicadas en la adventicia PKJ provocan transitorios de iones de calcio de baja frecuencia de larga duración, mientras que las SM activan transitorios de iones de calcio de menor duración con mayor frecuencia.

Del mismo modo, también se observó una serie de señales fluorescentes de iones de calcio dentro y alrededor de los conductos coléctiles y transitorios oscilantes de iones de calcio en los SMIC. Al intentar este procedimiento, es importante que el riñón esté lo más nivelado posible durante la sección del vibratoma para garantizar que se liberen cortes de riñón uniformes del bloqueo. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el aislamiento unicelular, la inmunohistoquímica y los estudios moleculares para aumentar nuestra comprensión de los mecanismos de marcapasos en la pelvis renal.