Name: Una guía paso a paso para la electroantenografía de mosquitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprende electroantenografía en mosquitos para estudiar respuestas olfativas usando Aedes aegypti y otras especies. Este protocolo permite medir sensibilidad a químicos y aplicar el método a otros insectos.

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Agradezco al Dr. Clément Vinauger y al Dr. Jeffrey Riffell por sus útiles discusiones. Los siguientes reactivos se obtuvieron a través de BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Strain STE2, MRA-128, contribución de Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, contribución de David W. Severson; Culex quinquefasciatus, cepa JHB, huevos, NR-43025. El autor agradece al Dr. Jake Tu, a la Dra. Nisha Duggal, al Dr. James Weger y a Jeffrey Marano por proporcionar huevos de mosquito Culex quinquefasciatus y Anopheles stephensi (cepa: Liston). Aedes albopictus y Toxorhynchites rutilus septentrionalis se derivan de mosquitos de campo recolectados por el autor en el área de New River Valley (VA, EUA). Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Bioquímica y el Instituto de Ciencias de la Vida Fralin.

1. Preparación de la solución salina
<ol><li>Preparar la solución salina con antelación y guardar en la nevera.</li>
	<li>Siga a Beyenbach y Masia26 para preparar la solución. NOTA: Receta salina en mM: 150.0 NaCl, 25.0 HEPES, 5.0 glucosa, 3.4 KCl, 1.8 NaHCO3, 1.7 CaCl 2 y 1.0 MgCl2. El pH se ajusta a 7,1 con 1 M NaOH. No agregue glucosa o sacarosa a la preparación en este momento para aumentar el almacenamiento en el estante. Agregue la cantidad necesaria a la solución salina justo antes de ejecutar los EAG (alrededor de 50 ml por experimento).</li>
</ol>2. Preparación y almacenamiento de olores
<ol><li>Preparar las mezclas odorantes o diluciones de un solo compuesto por adelantado en viales de 1,5 ml de ámbar y almacenar a -20 °C para evitar la degradación del compuesto. NOTA: Las concentraciones dependerán de la prueba a realizar. 0.1% o 1% se usan comúnmente para determinar si un compuesto puede ser detectado o no. Para una curva dosis-respuesta, prepare diluciones seriadas de una sustancia química determinada y pruébelas desde las concentraciones más bajas hasta las más altas.</li>
	<li>Prepare las diluciones en agua, etanol, hexano, aceite de parafina o aceite mineral, dependiendo de la solubilidad del producto químico probado.</li>
	<li>Asegúrese de preparar un control de disolvente (un vial que contenga sólo el disolvente) para el experimento.</li>
	<li>Retire los odorantes del congelador 30 minutos antes de comenzar los experimentos para permitir que se descongelen. Vortex cada vial antes de usarlo para mezclar bien el producto químico y el solvente.</li>
	<li>Pipetear 10 μL de solución en un trozo de papel de filtro (0,5 cm x 2 cm) cargado dentro de una jeringa de vidrio etiquetada o pipeta Pasteur.</li>
	<li>Cargue cada compuesto o mezcla en una pipeta o jeringa Pasteur específica para evitar la contaminación. NOTA: Cargue 10 minutos antes de comenzar el experimento para que el olor pueda difundirse en la jeringa, pero no por más tiempo para evitar la degradación. Deje que la pipeta o jeringa Pasteur permanezca tapada en este momento para permitir una buena difusión del producto químico antes de que comience el experimento.</li>
	<li>Después de cada ejecución de EAG, deseche el trozo de papel de filtro y reemplácelo por uno nuevo para evitar que el papel se empape demasiado y corra el riesgo de bloqueo de la aguja. Reemplace las agujas regularmente (cada 10 corridas).</li>
</ol>3. Separación de mosquitos
<ol><li>Aislar a los mosquitos el día de los experimentos.</li>
	<li>Use mosquitos que tengan al menos 6 días de edad el día de los experimentos para aumentar las posibilidades de que las hembras se apareen para mejorar su respuesta a los olores relacionados con el huésped. NOTA: Ajuste la edad del mosquito en el momento de la prueba dependiendo del proyecto. Verificar y armonizar el estado fisiológico (por ejemplo, alimentado con sangre, hambriento, nunca alimentado previamente, etc.).</li>
	<li>Matar de hambre a los mosquitos hasta 12 h (es decir, sin acceso al azúcar) para aumentar su motivación y sensibilidad.</li>
	<li>Coloque el recipiente para mosquitos en la nevera (4 °C) hasta que deje de volar para que las personas puedan transferirse fácilmente a tazas individuales con fórceps. NOTA: Las especies con una mayor tolerancia al frío se pueden sacrificar utilizando una almohadilla deCO2 . Asegúrese de que los mosquitos no permanezcan en él durante mucho tiempo para evitar la desecación, lo que disminuiría la capacidad de respuesta de la preparación de EAG del mosquito.</li>
	<li>Guarde las tazas que contienen mosquitos individuales a temperatura ambiente antes de realizar los EAG y deseche cualquier mosquito que no se pueda usar durante el día.</li>
</ol>4. Soporte de electrodo y preparación capilar
<ol><li>Tracción, preparación y almacenamiento capilar<ol><li>Utilizar capilares de borosilicato con filamentos (I.D: 0,78 mm, O.D: 1 mm). Tire de ellos dependiendo del equipo27. NOTA: Almacene los capilares extraídos en una placa de Petri. Coloque la placa de Petri sobre trozos de cera o arcilla de modelar sin perfume para evitar que se muevan y se rompan.</li>
		<li>Antes de ejecutar el experimento EAG, rompa suavemente la punta de 2 capilares con un par de pinzas bajo el microscopio. NOTA: Asegúrese de que uno sea ligeramente más grande que el otro para adaptarse al cuello (capilar más grande) o a las puntas de las antenas (capilar más pequeño). Asegúrese de que el corte esté limpio sin grietas presentes en la pared capilar. Esto requiere paciencia y práctica.</li>
		<li>Si aún están intactos, reutilice estos capilares después de enjuagar con agua desionizada (DI) después de que termine el experimento. Retire el exceso de agua aplicando suavemente una toallita limpiadora contra la punta. Vuelva a colocar en la placa de Petri almacenada. Si la punta está torcida, deseche el capilar.</li>
	</ol></li>
	<li>Soporte de electrodo y montaje capilar<ol><li>Etiquete los dos soportes de electrodos como "grabación" y "referencia" utilizando trozos de cinta de laboratorio de diferentes colores. Esto ayudará a guiar el montaje de la cabeza del mosquito y los electrodos.</li>
		<li>Asegúrese de que los soportes de electrodos estén limpios en el interior y que no haya restos de borosilicato.</li>
		<li>Clordidización: Remoje los cables plateados de los soportes de electrodos en lejía pura durante unos 5 minutos. Los cables cambian de gris claro brillante a gris oscuro mate.</li>
		<li>Afloje el tapón de goma y llene el interior del capilar con solución salina al 10% con una aguja de 20 G.</li>
		<li>Llene el capilar de borosilicato con la solución salina usando una jeringa. Asegúrese de que no haya burbujas ni en el soporte del electrodo ni en el capilar extraído. NOTA: Para reducir las posibilidades de tener burbujas en el capilar, siga empujando la solución salina en el capilar mientras tira suavemente de la aguja y use capilares con un filamento. Es posible cargar los capilares con una solución compuesta de gel de electrodo 1:3 y solución salina. Esto puede ayudar a prevenir la evaporación de la solución salina y puede ser particularmente útil cuando se aprenden y practican EAG, ya que el experimentador necesitará más tiempo para completar los diferentes pasos.</li>
		<li>Después de remojar, enjuague los alambres plateados con agua DI e insértelos en los dos capilares. Asegúrese de que la punta del cable esté a menos de 1 mm de la punta del capilar. Asegúrese de que el capilar pase el anillo de goma dentro del soporte del electrodo sin romperse. Apriete suavemente el tapón de goma. Verifique que no haya burbujas de aire.</li>
		<li>Utilice el capilar con la abertura más ancha en el soporte del electrodo de referencia (cuello) y la abertura más pequeña en el soporte del electrodo de grabación (antenas).</li>
		<li>Deje los dos portaelectrodos montados en una toallita de limpieza húmeda para evitar que la punta se seque hasta que esté lista para montar el cabezal.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Preparación de la plataforma EAG (Figura 1)
<ol><li>Asegúrese de que la mesa de aire esté arriba, que no haya bloqueo en la aerolínea. Asegúrese de que el tanque de aire medicinal todavía esté lleno para evitar cambiarlo en medio del experimento. Asegúrese de que haya burbujas en el humidificador.</li>
	<li>Sistema de suministro de aire y pulso<ol><li>Encienda el tanque de gas de aire medicinal.</li>
		<li>Compruebe el nivel de los dos caudalímetros. NOTA: El caudalímetro que controla la corriente de aire principal que baña la preparación durante todo el experimento debe estar a 140 ml / min y el otro relacionado con el pulso de olor debe leer 15 ml / min.</li>
	</ol></li>
	<li>Si realiza GC-EAD, encienda la máquina, los tanques de gas y cree / cargue el archivo / método.</li>
	<li>Encienda las computadoras, las aplicaciones de software, la fuente de alimentación de la válvula y verifique la conexión a Internet para que la aplicación de software funcione.<ol><li>Aplicación de software: Se puede escribir un breve guión para entregar el pulso.</li>
		<li>Software EAG: utilice cualquier software de electrofisiología.</li>
		<li>Implemente los parámetros en el software (por ejemplo, amplificador, duración de la grabación, duración de los pulsos, etc.).</li>
	</ol></li>
	<li>Entregar un pulso de control para verificar que la válvula que emite los pulsos es funcional.</li>
	<li>Ajuste la fuente de alimentación a 5,2 V. Verifique los parámetros del amplificador. NOTA: Los parámetros utilizados para los datos presentados aquí son: filtro de corte bajo de 0.1 Hz; filtro de corte alto de 500 Hz; Ganancia de x100.</li>
</ol>6. Preparación y montaje de la cabeza del mosquito (Figura 2)
<ol><li>Coloque una placa de aluminio sobre hielo y coloque un trozo de toallita de limpieza húmeda sobre ella.</li>
	<li>Coloque una pequeña cucharada de gel de electrodo en una esquina.</li>
	<li>Coloque una taza para mosquitos en hielo y deje que el mosquito se enfríe durante un par de minutos, o hasta que deje de volar. NOTA: Algunas especies son resistentes al frío y pueden requerir una anestesia rápida sobre una almohadilla deCO2 para bajar. Cuanto menos permanezca el mosquito, mejor.</li>
	<li>Coloque el mosquito en su espalda y recorte la punta de cada antena (solo una pequeña porción del último segmento) con micro tijeras.</li>
	<li>Use pinzas para arrastrar el mosquito junto a la cucharada de gel del electrodo y sumerja suavemente la punta de cada antena en el gel. Evite sumergir más que solo el último segmento en el gel del electrodo.</li>
	<li>Usando fórceps, saque las antenas de mosquitos mientras las mantiene una al lado de la otra. Deja que salgan juntos del gel. Asegúrese de que las antenas no toquen la superficie de la toallita de limpieza, o podrían separarse.</li>
	<li>Coloque el mosquito de lado y corte la cabeza con micro tijeras o una hoja de afeitar. NOTA: Una vez cortado el cabezal, proceda rápidamente a los siguientes pasos y al equipo EAG para iniciar las grabaciones. La preparación debe permanecer receptiva durante unos 30 minutos.</li>
	<li>Tome el electrodo de referencia y profundice suavemente la punta en el gel. Manténgase en contacto con los tejidos del cuello y deje que la cabeza se pegue sobre él.</li>
	<li>Mueva los soportes de electrodos bajo el microscopio EAG y vea a través del microscopio para colocar el electrodo de cabeza (es decir, de referencia) en un micromanipulador. Asegúrese de que las antenas estén en el centro.</li>
	<li>Agarre el electrodo de grabación, colóquelo frente a las puntas de las antenas. Muévelo y alinearlo lo más cerca posible de las puntas usando el micromanipulador. Usando el microscopio, mueva la punta del electrodo de grabación hacia las antenas.</li>
	<li>Conecte ambos soportes de electrodos al amplificador antes de insertar las puntas para evitar que se muevan después de la inserción.</li>
	<li>Inserte las puntas de las antenas en el electrodo de grabación. Asegúrese de que solo entren en contacto con la solución salina y el gel del electrodo y que sean visibles por transparencia a través del capilar. La antena entra por el "efecto de succión".</li>
	<li>Ajuste la posición de la cabeza y las puntas con fórceps bajo el microscopio, si es necesario.</li>
	<li>Coloque el tubo de la aerolínea cerca de la preparación de la cabeza del mosquito (distancia: 1 cm). NOTA: Si la cabeza se cae, regrese a la estación de disección y vuelva a montar la cabeza o prepare una nueva si se ha perdido o si han pasado más de 5 minutos desde que se cortó la cabeza. Una buena conexión entre el capilar y el cuello / antenas es esencial para un bajo nivel de ruido y una grabación confiable. Idealmente, las puntas de las antenas estarán a menos de 1 mm del cable del electrodo de grabación una vez insertado.</li>
	<li>Apague la fuente de luz, si la utiliza.</li>
	<li>Coloque la línea de vacío cerca de la preparación de la cabeza del mosquito (distancia: 20 cm) y alinee con la aerolínea principal. NOTA: El vacío ayudará a eliminar los productos químicos que rodean la preparación de la cabeza después del estímulo, lo que podría conducir a respuestas EAG después de que se aplicaron los pulsos.</li>
</ol>7. Grabaciones
<ol><li>Después de insertar las puntas de las antenas, encienda el amplificador y el reductor de ruido. Observe la señal de referencia y asegúrese de que no sea ruidosa. NOTA: Observe si hay grandes oscilaciones en la señal eléctrica. Ajuste la posición de la cabeza y las puntas de las antenas según sea necesario hasta que la señal esté limpia. Use pinzas de cocodrilo para conectar a tierra cualquier cosa que introduzca ruido en la jaula de Faraday o en la mesa de aire. Una señal de referencia de menos de 0,01 mV de amplitud es ideal para detectar y discriminar respuestas EAG diminutas.</li>
	<li>Una vez que el nivel de ruido sea satisfactorio, inserte la primera jeringa de olor para probar en el orificio de la aerolínea.</li>
	<li>Cierre la jaula de Faraday. No se quede delante de la preparación, para reducir el ruido.</li>
	<li>Haga clic en Grabar en el software EAG.</li>
	<li>Entregue el pulso (s) utilizando la aplicación de software. NOTA: El número y la duración de los pulsos variarán dependiendo de los experimentos. Aquí, se han utilizado pulsos individuales de 1 s. por odorante. Los odorantes estaban separados por 45 s.</li>
	<li>Tenga en cuenta la respuesta de las antenas de mosquitos en el cuaderno de laboratorio. NOTA: Si las antenas del mosquito detectan el olor, se observa una clara desviación en la señal (ver Figura 3A).</li>
	<li>Proceda con el siguiente olor o concentración. No olvide aleatorizar la presentación de los odorantes a menos que se realice una curva dosis-respuesta. NOTA: En los experimentos se debe utilizar un control negativo y un control positivo. Esto asegurará que las respuestas observadas sean realmente respuestas olfativas y no debidas a ruido mecánico o eléctrico.</li>
	<li>Al final de la grabación, aplique un control positivo para verificar que las antenas aún responden. NOTA: Use benzaldehído al 0.1% o 1% ya que todas las especies de mosquitos analizadas hasta ahora han respondido a este compuesto.</li>
	<li>Proceda con la siguiente preparación del mosquito.</li>
</ol>8. Limpieza
<ol><li>Apague el amplificador, el reductor de ruido, la aerolínea y la computadora.</li>
	<li>Devuelva los odorantes al congelador.</li>
	<li>Retire los papeles de filtro de las jeringas de vidrio y limpie con etanol al 100% si hay residuos visibles en las paredes. Deje secar en una toallita de limpieza durante la noche.</li>
	<li>Limpie los portaelectrodos con agua DI para eliminar cualquier posible rastro de sal. Secar aplicando suavemente contra un trozo de toallita limpiadora.</li>
	<li>Coloque los restos de mosquitos en el congelador y deséchelos 24 h después. NOTA: Si trabaja con mosquitos infectados, siga los requisitos de seguridad de su institución.</li>
</ol>9. Análisis de datos
<ol><li>Mida manual o automáticamente las respuestas del EAG. NOTA: La amplitud EAG (-mV) se mide aquí. Promedia si se han aplicado múltiples pulsos para cada compuesto. Dependiendo del software utilizado, los EAG se pueden detectar y medir automáticamente. Sin embargo, es esencial inspeccionar cada respuesta individualmente para verificar la forma de la respuesta y evaluar el posible arrastre, la respuesta tardía, etc. La respuesta EAG ideal está alineada con el pulso, muestra una clara desviación y es repetible entre las preparaciones de mosquitos (Figura 3).</li>
	<li>Presente los datos sin procesar para mostrar una variabilidad mínima, una señal de bajo ruido y respuestas claras (Figura 3B). NOTA: Los datos también se pueden normalizar (por ejemplo, puntuación Z). El valor de control negativo (por ejemplo, aceite mineral) (es decir, la línea de base) se puede restar de la respuesta y, si no, debe presentarse en las figuras. También se debe presentar un control positivo.</li>
	<li>Realizar análisis estadísticos utilizando cualquier software de estadística28.</li>
</ol>

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</ol>

El autor no tiene nada que revelar.

Los comportamientos mediados olfativos se ven afectados por muchos factores, incluidos los fisiológicos (por ejemplo, edad, hora del día) y ambientales (por ejemplo, temperatura, humedad relativa)30. Por lo tanto, al realizar EAGs, es esencial utilizar insectos que se encuentren en el mismo estado fisiológico (es decir, monitorear la edad, morir de hambre, aparearse)31 y también mantener un ambiente cálido y húmedo alrededor de la preparación para evitar la desecación. Una ...

Los mosquitos son los organismos más mortales de la tierra, cobran la vida de más de un millón de personas por año y ponen a más de la mitad de la población mundial en riesgo de exposición a los patógenos que transmiten, mientras pican1. Estos insectos dependen de una amplia gama de señales (es decir, térmicas, visuales, mecánicas, olfativas, auditivas) para localizar un huésped del que alimentarse (tanto vegetal como animal), para aparearse y oviponerse, así como para evitar depredadores tanto en la etapa larvaria como en la adulta 2,3. Entre estos sentidos, el olfato juega un papel crítico en los comportamientos antes mencionados, en particular para la detección de moléculas odoríferas de mediano a largo alcance 2,3. Los olores emitidos por un huésped o un sitio de oviposición son detectados por varios receptores olfativos específicos (por ejemplo, GRs, ORs, IRs) localizados en los palpos del mosquito probóscide, tarso y antenas 2,3.
Como el olfato es un componente clave de sus comportamientos de búsqueda de huéspedes (plantas y animales), apareamiento y oviposición, constituye un objetivo ideal para estudiar el desarrollo de nuevas herramientas para el control de mosquitos4. La investigación sobre repelentes (por ejemplo, DEET, IR3535, picaridina) y cebos (por ejemplo, señuelo humano centinela BG) es extremadamente prolífica5, pero debido a los desafíos actuales en el control de mosquitos (por ejemplo, resistencia a insecticidas, especies invasoras), es esencial desarrollar nuevos métodos de control eficientes informados por la biología del mosquito.
Se han utilizado muchas técnicas (por ejemplo, olfatómetro, ensayos de aterrizaje, electrofisiología) para evaluar la bioactividad de compuestos o mezclas de compuestos en mosquitos. Entre ellos, la electroantennografía (o electroantennogramas (EAG)) se puede utilizar para determinar si los olores son detectados por las antenas del mosquito. Esta técnica fue desarrollada inicialmente por Schneider6 y se ha utilizado en muchos géneros de insectos diferentes desde entonces, incluidas las polillas 7,8,9, los abejorros 10,11, las abejas melíferas 12,13 y las moscas de la fruta 14,15, por nombrar algunas. La electroantennografía también se ha empleado utilizando varios protocolos, incluyendo antenas únicas o múltiples en mosquitos 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Los mosquitos son insectos relativamente pequeños y delicados con antenas bastante delgadas. Si bien realizar EAG en insectos más grandes como polillas o abejorros es relativamente fácil debido a su mayor tamaño y antenas más gruesas, la realización de EAG en mosquitos puede ser un desafío. En particular, mantener una buena relación señal-ruido y una preparación receptiva duradera son dos requisitos principales para la reproducibilidad y fiabilidad de los datos.
La guía paso a paso para los EAG de bajo ruido propuesta aquí ofrece directamente soluciones a estas limitaciones y hace que este protocolo sea aplicable a varias especies de mosquitos de varios géneros, incluidos Aedes, Anopheles, Culex y Toxorhynchites, y describe la técnica tanto para hembras como para machos. La electroantennografía ofrece una forma rápida pero confiable de detectar y determinar compuestos bioactivos que luego pueden aprovecharse en el desarrollo del cebo después de que se haya determinado la valencia con ensayos de comportamiento.

<table><tbody><tr><td>Mesa de aire Clean Bench</td><td>TMC</td><td>https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess</td><td>Reductor de ruido</td></tr><tr><td>Placa analógica a digital</td><td>National Instruments</td><td>BNC-2090A</td><td></td></tr><tr><td>Flowbuddy de sobremesa Completo</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>Para anestesiar mosquitos</td></tr><tr><td>Capilar de vidrio de borosilicato</td><td>Instrumento</td> <td>SutterB100-78-10</td><td>Para realizar el registro y referencias capilares</td></tr><tr><td>Productos químicos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Benzaldehído: 418099-100 mL; Ácido butírico: B103500-100 ml; 1-Hexanol: 471402-100mL; Aceite mineral: M8410-1L</td><td>Productos químicos utilizados para los experimentos presentados aquí</td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas o Praxair</td><td>N/A</td><td>Para anestesiar mosquitos</td></tr><tr><td>Fuente de luz fría</td><td>Volpi</td><td>NCL-150</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas desechables</td><td>BD</td><td>1 mL (309628)&nbsp; / 3 mL (309657)</td><td></td></tr><tr><td>Cables de electrodos</td><td>World Precision Instruments</td><td>5371</td><td></td></tr><tr><td>Gel de electrodos sin sal</td><td>Parkerlabs</td><td>12-08-Spectra-360</td><td></td></tr><tr><td>Jaula de Faraday</td><td>TMC</td><td>https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages</td><td>Reductor de ruido</td></tr><tr><td>Caudalímetros</td><td>Bel-art</td><td>65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075)</td><td>Uno de cada</td></tr><tr><td>vial y tapón GCMS</td><td>Thermo-fisher scientific</td><td>2-SVWKA8-CPK</td><td>Para preparar diluciones de odorantes</td></tr><tr><td>Jeringas de vidrio (Fortuna)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z314307</td><td>Para la entrega de olores a la preparación EAG</td></tr><tr><td>Humbug</td><td>Quest Scientific</td><td>http://www.quest-sci.com/</td> <td>Reductor de ruido</td></tr> 2 <tr><td>mm Soporte de gato, estrecho, 90 grados, con cable</td><td>Sistemas A-M</td><td>675748</td><td>Portaelectrodos</td></tr><tr><td>Bases magnéticas</td><td>Kanetec</td><td>MB-FX</td><td>x 2</td></tr><tr><td>MATLAB + Toolboxes</td><td>Mathworks</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>Para la entrega de los pulsos</td></tr><tr><td>Aire medicinal</td><td>Airgas o Praxair</td><td>N/A</td><td>Para las principales líneas aéreas</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikkon</td><td>SMZ-800N</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipuladores Micromanipulador compacto grueso/fino de tres ejes</td><td>Narishige</td><td>MHW-3</td><td>x 2</td></tr><tr><td>Amplificador de microelectrodo con cabecera</td><td>Sistemas A-M</td><td>Modelo 1800</td><td></td></tr><tr><td>Suministros para la cría de mosquitos</td><td>Bioquip</td><td>https://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp</td><td></td></tr><tr><td>Agujas</td><td>BD</td><td>25G (305127) / 21G (305165)</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Para la entrega de olores a la preparación EAG</td></tr><tr><td>Tubos de PTFE de diferentes diámetros</td><td>Mc Master Carr</td><td>N/A</td><td>Para conectar la válvula solenoide, caudalímetro, línea aérea, etc.</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación de 30 V/5 A CC</td><td>Dr. Meter</td><td>PS-305DM</td><td></td></tr><tr><td>R versión 3.5.1</td><td>R proyecto</td><td>https://www.r-project.org/</td> <td>Para análisis de datos</td></tr><tr><td>Relé para electroválvula</td><td>N/A</td> Alambre de plata <td>hecho</td><td></td>a medida</tr><tr><td>0.01"</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>Válvula solenoide (3 vías)</td><td>The Lee Company</td><td>LHDA0533115H</td><td></td></tr><tr><td>Software WinEDR</td><td>Software de electrofisiología Strathclyde</td><td>WinEDR V3.9.1</td><td>Para grabación EAG</td></tr><tr><td>Papel Whatman</td><td>Cole Parmer</td><td>UX-06648-03</td><td>Para cargar productos químicos en jeringa de vidrio / pipeta Pasteur</td></tr></tbody></table>

una guía paso a paso para la electroantenografía de mosquitos

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Los mosquitos hembra son los animales más mortales de la tierra, cobrando la vida de más de 1 millón de personas cada año debido a los patógenos que transmiten al adquirir una harina de sangre. Para localizar un huésped del que alimentarse, los mosquitos dependen de una amplia gama de señales sensoriales, incluidas visuales, mecánicas, térmicas y olfativas. El estudio detalla una técnica, la electroantenografía (EAG), que permite a los investigadores evaluar si los mosquitos pueden detectar sustancias químicas individuales y mezclas de sustancias químicas de una manera dependiente de la concentración. Cuando se combina con cromatografía de gases (GC-EAG), esta técnica permite exponer las antenas a una mezcla completa de espacio de cabeza / complejo y determina qué productos químicos presentes en la muestra de interés, el mosquito puede detectar. Esto es aplicable a los olores corporales del huésped, así como a los ramos florales de plantas u otros olores ecológicamente relevantes (por ejemplo, odorantes de sitios de oviposición). Aquí, describimos un protocolo que permite largas duraciones de tiempo de respuesta de preparación y es aplicable tanto a mosquitos hembras como machos de múltiples géneros, incluidos los mosquitos Aedes, Culex, Anopheles y Toxorhynchites . Como el olfato juega un papel importante en las interacciones mosquito-huésped y la biología del mosquito en general, los EAG y GC-EAG pueden revelar compuestos de interés para el desarrollo de nuevas estrategias de control de vectores de enfermedades (por ejemplo, cebos). Complementado con ensayos de comportamiento, se puede determinar la valencia (por ejemplo, atrayente, repelente) de cada sustancia química.

La electroantennografía es una herramienta poderosa para determinar si una antena de insectos detecta un producto químico o una mezcla de productos químicos. También se puede utilizar para determinar el umbral de detección para una sustancia química determinada utilizando un aumento gradual de la concentración (es decir, respuesta de la curva de dosis, Figura 4B). Además, es útil probar los efectos del repelente en la respuesta a los olores relacionados con el huésped29</su...

El presente artículo detalla un protocolo paso a paso para electroantennogramas exitosos y de bajo ruido en varios géneros de mosquitos, incluyendo hembras y machos.

Una guía paso a paso para la electroantenografía de mosquitos

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

Para la electroantenografía, el uso de mosquitos en un estado fisiológico específico y consistente es fundamental para obtener resultados confiables. El protocolo paso a paso permite registros electroantennográficos duraderos en mosquitos. El método se puede utilizar en varias especies de mosquitos, y tanto en machos como en hembras.La técnica electroantennográfica también se puede trasladar a otros modelos de insectos, incluidos escarabajos, moscas, vinchucas y hormigas. Para comenzar, retire los viales de ámbar de 1,5 mililitros que contienen las mezclas odorantes y un control de solvente del congelador de 20 grados centígrados en el que se almacenan para evitar la degradación. A continuación, pipetear 10 microlitros de la solución odorante en un trozo de papel de filtro cargado dentro de una jeringa de vidrio etiquetada.Aísle los mosquitos el día del experimento. Trabajando bajo el microscopio, rompa suavemente la punta de dos capilares de borosilicato con filamentos usando un par de pinzas. Antes de ejecutar la electroantenografía, o experimento EAG, asegúrese de que los soportes de electrodos estén limpios en el interior, sin restos de borosilicato.Luego realice la cloridización empapando los cables plateados de los soportes de electrodos en lejía pura durante cinco minutos, hasta que los cables se vuelvan oscuros, gris mate. Luego enjuague los cables. Afloje el tapón de goma y use una aguja de calibre 20 para llenar el interior del capilar con solución salina.Enjuague los capilares e inserte los cables en los dos capilares. Mantenga la punta del cable a menos de un milímetro de la punta del capilar. Pase el capilar a través del anillo de goma dentro del soporte del electrodo sin romperlo y apriete suavemente el tapón de goma, después de verificar que no haya burbujas de aire.Utilice el capilar con la abertura más ancha en el soporte del electrodo de referencia y la abertura más pequeña en el soporte del electrodo de grabación. Deje los dos portaelectrodos montados en una toallita de limpieza húmeda para evitar que la punta se seque hasta que esté lista para montar el cabezal. Asegúrese de que la mesa de aire esté levantada.No hay bloqueo en la aerolínea y el aire está encendido. Verifique que el tanque de aire medicinal esté lleno para evitar cambiarlo en medio del experimento y confirme las burbujas en el humidificador. Encienda las computadoras, las aplicaciones de software y la fuente de alimentación de la válvula.Después de verificar la conexión a Internet, entregue un pulso de control para verificar que la válvula que entrega los pulsos sea funcional. Coloque una placa de aluminio sobre hielo con un trozo de limpieza húmeda sobre ella y coloque una pequeña cucharada de gel de electrodo en una esquina. Coloque una taza para mosquitos en hielo para dejar que el mosquito se enfríe.Recorte la punta de cada antena del mosquito con micro tijeras. Use pinzas para arrastrar el mosquito junto a la cucharada de gel del electrodo y sumerja suavemente la punta de cada antena en el gel. Usando fórceps, saque las antenas de mosquitos, mientras las mantiene una al lado de la otra.Picar la cabeza del mosquito con micro tijeras. Sumerja suavemente la punta del electrodo de referencia en el gel y colóquelo en contacto con el cuello, dejando que la cabeza se pegue a él. Coloque el electrodo de cabeza de referencia en un micromanipulador.Conecte ambos portaelectrodos al amplificador. Utilice el micromanipulador para colocar el electrodo de grabación lo más cerca posible de las puntas de la antena. Luego inserte las puntas de la antena en el electrodo de grabación.Coloque el tubo de la aerolínea cerca de la preparación de la cabeza del mosquito, a un centímetro. Encienda el amplificador y el reductor de ruido y asegúrese de que la señal de línea de base no sea ruidosa. Una vez que el nivel de ruido sea satisfactorio, inserte la primera jeringa de olor en el orificio de la aerolínea para realizar la prueba y cierre la jaula de Faraday.Luego haga clic en grabar en el software EAG para entregar el pulso. Mida las respuestas EAG como amplitud en milivoltios y luego proceda con el siguiente olor o concentración. El experimento demuestra con éxito que las especies de mosquitos pueden exhibir respuestas olfativas variables a diferentes productos químicos.Hubo una ausencia de respuesta al aceite mineral, que se utilizó como control negativo. El error en los resultados debido al ruido eléctrico se puede reducir conectando a tierra los elementos a la jaula de Faraday, utilizando pinzas de cocodrilo. El umbral de respuesta al mismo olor puede variar en magnitud para diferentes especies de mosquitos.Por ejemplo, los mosquitos Toxorhynchites rutilus septentrionalis producen EAG muy grandes, en comparación con Aedes aegypti, Anopheles stephensi y Culex quinquefasciatus. Se observó una gran desviación en respuesta al control positivo, benzaldehído. Si bien hubo una falta de respuesta al control negativo, el aceite mineral.Estas respuestas antenales promedio se muestran en un diagrama de barras. Además, el umbral de detección de una sustancia química específica para cada especie de mosquito se determinó presentando la antena, las concentraciones crecientes de la sustancia química y trazando una curva de dosis-respuesta. Es importante comenzar la grabación tan pronto como sea posible después de que la cabeza haya sido cortada y montada, para garantizar una gran capacidad de respuesta de la preparación.EAG permite determinar si las antenas del mosquito responden a una sustancia química dada a una concentración dada. Sin embargo, no permite determinar el equilibrio de este producto químico. Por ejemplo, si es un atrayente o un arrepentimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Las respuestas electrofisiológicas de las neuronas sensoriales olfativas a los olores pueden ser medidos en los insectos a partir de grabaciones individuales sensillum. En este artículo de vídeo vamos a demostrar cómo realizar grabaciones individuales sensillum en las antenas de la mosca del vinagre...

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Sistemas olfativos de insectos proporcionan oportunidades únicas para el registro de olor inducida por las respuestas en las formas de electroantennograms (EAG) y las grabaciones individuales sensillum (SSR), que se resumen las respuestas de todas las neuronas del receptor odorante (ORNs), ubicado en la antena y de los alojados en individuales sensilla, respectivamente.

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Señales olfativas mediar muchas conductas diferentes en los insectos, y son a menudo mezclas complejas compuestas de decenas a cientos de compuestos volátiles. Utilizando cromatografía de gases con la grabación de múltiples canales en el lóbulo antenal de insectos, se describe un método para la identificación de compuestos bioactivos.

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Presentamos un novedoso procedimiento quirúrgico para implantar electrodos en Manduca sexta durante sus primeras etapas metamórficas. Esta técnica permite el acoplamiento mecánicamente estable y eléctricamente fiable con el tejido neuromuscular para estudiar la dinámica de la neurofisiología del vuelo. También presentamos una novedosa plataforma de levitación magnética para estudios atados de guiñadas de insectos.

Tecnología de Inserción Metamórfica temprana para insectos de vuelo Supervisión del comportamiento

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El uso de insectos electroantenograma Sensores de Robots Autónoma de Búsquedas olfativas

El uso de dos métodos para estimar la expresión génica en las principales apéndices gustativas de Aedes aegypti, hemos identificado el conjunto de genes supuestamente subyacentes a las respuestas neuronales a compuestos amargos y repulsivas, como se determina por examen electrofisiológico.

Fisiológicos Grabaciones y RNA Secuenciación de los apéndices gustativas del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti

Este protocolo describe las metodologías detrás del ensayo de Ramsay, los microelectrodos selectivos de iones, la técnica de electrodo selectivo de iones de barrido (SIET) y los ensayos de contracción in vitro, aplicados para estudiar el sistema excretor de mosquitos adultos, compuesto por los túbulos de Malpighian y el intestino posterior, para medir colectivamente las tasas de secreción de iones y líquidos, la actividad contráctil y el transporte de iones transepiteliales.

Estudio de la actividad de los neuropéptidos y otros reguladores del sistema excretor en el mosquito adulto

Este estudio introduce protocolos experimentales para un dron bio-híbrido de detección de olores basado en antenas de seda. Se presenta el funcionamiento de un dispositivo experimental de electroantenograma con antenas de sedamo, además de la estructura de un dron biohíbrido diseñado para la localización de fuentes de olor utilizando el algoritmo de sobretensión en espiral.

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Se describen procedimientos para estudiar los comportamientos de sondeo e ingestión de mosquitos Culex tarsalis en manos humanas utilizando electropenetrografía AC-DC.

Electropenetrografía AC-DC para el estudio de los comportamientos de sondaje e ingestión de mosquitos Culex tarsalis en manos humanas

Aprende electroantenografía en mosquitos para estudiar respuestas olfativas usando Aedes aegypti y otras especies. Este protocolo permite medir sensibilidad a químicos y aplicar el método a otros insectos.

Una guía paso a paso para la electroantenografía de mosquitos

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