Registro de corrientes eléctricas a través de la membrana plasmática de espermatozoides de mamíferos

El registro de la actividad eléctrica de la célula espermática mediante la técnica de pinza de parche ha sido fundamental para identificar diversos canales iónicos espermatozoides y comprender la electrofisiología del esperma a nivel molecular. Este método destaca en la medición de huellas dactilares electrofisiológicas y farmacológicas de los canales iónicos y es la herramienta más fiable para la identificación de canales iónicos. Dada la importancia fisiológica de los canales iónicos y los transportadores electrogénicos para la fertilidad masculina, esta técnica es una herramienta poderosa para comprender ciertos defectos espermaticos que conducen a la infertilidad.

Para la fabricación de micropipetas, comienza con capilares de vidrio borosilicato con un diámetro exterior de 1,5 milímetros, un diámetro interior de 0,86 milímetros y un filamento interno. Asegúrese de que el diámetro interior de la punta de la pipeta sea de aproximadamente dos micrómetros antes de pulir al fuego y se reduzca a 0,5 micrómetros tras un pulido adecuado. Monta un puente de agar para mantener estable el entorno alrededor del electrodo de referencia.

Haz un capilar de cristal en forma de L doblándolo bajo un pequeño fuego Bunsen y déjalo enfriar. Haz una solución de 1%agarosa en un molar de cloruro de potasio y caliéntala en un microondas hasta que la agarosa se derrita y la solución se vuelva transparente. Rellena cuidadosamente el capilar de vidrio en forma de L con la agarosa para evitar burbujas de aire y déjalo enfriar a temperatura ambiente.

Alternativamente, sumergir el capilar de vidrio en forma de L en la agarosa fundida. Haz girar el recipiente varias veces y caliéntalo de nuevo en el microondas hasta que la agarosa hierva, lo que expulsará las burbujas de aire del puente de agar. Abre la zona abdominal inferior del ratón con tijeras y extrae ambos epidídimos.

Colócalos en un recipiente de cultivo celular de 35 milímetros lleno de solución salina o HS previamente calentada a temperatura ambiente. Transfiere los epidídimos a una nueva bandeja de cultivo celular que contenga solución de HS y elimina completamente toda la grasa residual. Separa los epidídimos en caput, corpus y cauda usando una hoja de bisturí número 15.

Transfiere el cuerpo de cada epidídimo a un nuevo plato de cultivo celular que contenga solución de HS. Realiza múltiples incisiones en la parte aislada del epidídimo usando una hoja puntiaguda de bisturí número 11. Transfiere las partes de los epidídimos con múltiples incisiones a un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 1,5 mililitros de solución de HS.

Agita brevemente los espermatozoides del epidídimo para que los lleve a la solución usando pinzas Superfine Dumont Tipo 5A. Luego descarta los epidímidos y deja el tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Espera hasta que la materia sólida sedimente el fondo del tubo.

Luego transfiere el sobrenadante a otro tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros. Encuentra el espermatozoide adecuado con una gota citoplasmática usando un aumento de 600x. Asegúrate de que la gota citoplasmática sea ovalada y tenga una forma ligeramente alargada en forma de husillo.

Selecciona un espermatozoide que sea móvil con la cabeza unida al deslizamiento de la cubierta, de modo que el espermatozoide quede parcialmente fijo, pero la gota citoplasmática y el resto del flagelán continúen moviéndose con flagelos golpeando. Asegúrate de que la cabeza del esperma esté flojamente sujeta a la cubierta. Tras seleccionar visualmente un espermatozoide con una morfología adecuada, llena la micropipeta con la solución de pipeta y fijala en el soporte de la pipeta.

Para mantener la punta de la pipeta limpia de los restos, aplica presión positiva a la pipeta utilizando el conjunto en forma de tubo en U. Baja la pipeta y sumerge la punta en la solución del baño. Para visualizar claramente la célula, coloca la punta de la pipeta por encima de la gota citoplasmática de modo que la abertura de la punta quede alineada diagonalmente hacia la gota.

Baja rápidamente la punta de la pipeta hacia la gota para que estén en el mismo plano focal. En cuanto la punta de la pipeta toque la gota, aplica presión negativa para mover parte de la gota hacia la punta y formar un sello de giga-ohmios. Luego levanta el espermatozoide del vestido de la cubierta.

Compensa la transitoriedad de capacitancia dispersa usando el modo compensatorio del amplificador antes de pasar al modo de celda completa. Realiza un rodaje y transición al modo de célula completa aplicando un milisegundo, pulsos de voltaje que aumentan gradualmente combinados con una succión muy ligera. Tras la aplicación de cada pulso de tensión de rodaje, se inicia la herramienta de prueba de membrana para comprobar si aparecen mayores transitorias de capacitancia.

Ajusta la mayor transitoriedad de capacitancia para determinar la capacidad de toda la celda, así como su resistencia de acceso. Tras un éxito en la adaptación, se procede con los experimentos planificados de patch-clamp de célula entera, como aplicar diversas soluciones de baño que contienen diferentes compuestos o medir las actividades del canal usando protocolos de paso de voltaje o rampa de voltaje. Los registros CatSper se realizaron estableciendo un sello de alta resistencia entre la pipeta de parche y el espermatozoide de mamíferos en su gota citoplasmática.

Se registraron densidades de corrientes de células CatSper enteras de cesio en neuronas caudales salvajes y neuronas caudales deficientes en CatSper. Los espermatozoides de diferentes especies son diversos en su morfología y vías reguladoras internas. Los espermatozoides de primates y humanos mostraron propiedades y regulación similares de los canales CatSper.

Curiosamente, la activación de la progesterona de CatSper parece ser única en los espermatozoides primates. Los espermatozoides de jabalí, toro y roedor no mostraron ninguna alteración estimulada por progesterona en sus corrientes CatSper. En los espermatozoides de toro y jabalí, incluso la actividad basal de los canales CatSper estaba por debajo de los límites detectables, lo que sugiere que la entrada de calcio y la consiguiente hiperactivación son impulsadas por otros canales o transportadores, o que se necesita un estimulador natural diferente para activar sus canales CatSper.

Las gotas citoplasmáticas pequeñas, lisas, uniformes y no excesivamente hinchadas son más adecuadas para el patch-clamp. Deberías evitar usar esas gotitas citoplasmáticas diminutas, de un solo lado, hinchadas y totalmente transparentes, ya que resultarán en un sellado débil o nulo. Esta técnica permite el estudio detallado de canales de aire específicos en su sistema natural de expresión, y el éxito depende de las células espermáticas variables de alta calidad, regiones puras, habilidades básicas de fisiología intelectual, paciencia y, lo más importante, persistencia.