Name: Un ensayo rápido de preferencia alimentaria en Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprende a realizar un ensayo rápido de preferencia alimentaria en Drosophila melanogaster utilizando un plato de Petri dividido con alimentos teñidos. Este método permite evaluar comportamiento de alimentación y efectos genéticos de forma eficiente.

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Los autores quisieran agradecer al Dr. Tingwei Mi por ayudarles a optimizar el ensayo de alimentación de dos opciones. También les gustaría agradecer a Samuel Chan y Wyatt Koolmees por sus comentarios sobre el manuscrito. Este proyecto fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud otorga R03 DC014787 (Y.V.Z.) y R01 DC018592 (Y.V.Z.) y por la Fundación Ambrose Monell.

1. Montaje de las cámaras de ensayo
NOTA: Si bien este protocolo describe el uso de una placa Petri de 35 mm(Figura 1A),el efecto deseado se puede lograr utilizando cualquier recipiente estanco y de fondo liso que pueda ser bisectado y cubierto.
<ol><li>En primer lugar, bisect una placa Petri tapada de 35 mm fijando una longitud de plástico (5 mm de ancho y 3 mm de altura) por la línea media con adhesivo impermeable, formando dos compartimentos estancos. Confirme que el sello está completo para evitar fugas que puedan llevar a la mezcla de los dos sustratos alimentarios que se están probando. NOTA: Después del montaje, reutilice este aparato siempre y cuando el sello se mantenga.</li>
</ol>2. Preparación de viales de inanición
<ol><li>Preparar un número suficiente de viales de plástico vacíos; luego, compactar libremente un pedazo de papel tisú en la parte inferior. Comprima el papel tisú lo suficiente como para llenar el espacio, pero no tanto que forme una masa densa. NOTA: Asegúrese de que no haya grietas profundas o pliegues en el tejido, ya que esto puede llevar a que las moscas queden atrapadas.</li>
	<li>Agregue ~3 ml de agua pura al vial para que el tejido esté completamente saturado, pero no hay agua estancada. Asegúrese de que no haya gotas grandes de exceso de agua en la pared del vial. Alternativamente, sustituir la agarose por el papel empapado mediante la preparación de una solución de agar 1% w/v (sin sacarosa) añadiendo 5 ml de 1% de agarose a cada vial vacío y permitiendo que la agarose se solidifique a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. Inanición húmeda de moscas antes del experimento
<ol><li>Inicie la inanición 24 h antes del momento del experimento. Bajo anestesia de CO2, clasifica grupos de ~70, moscas de 2-4 días de edad en los viales de inanición preparados, etiquetando cada vial con el genotipo y el tiempo de inanición.</li>
</ol>4. Configuración de reactivos
<ol><li>Preparación de tintes NOTA: Antes de realizar cualquier experimento, es importante realizar un ensayo de control preliminar para determinar las concentraciones correctas de tintes rojos y azules a utilizar.<ol>
<li>Para el ensayo de control, prepare una gama de diluciones para cada tinte y realice el ensayo de alimentación con el mismo alimento con un color de tinte diferente. Utilice los resultados para identificar concentraciones de dos tintes (un rojo, otro azul) que producen un PI de ~0 cuando no se agrega ningún compuesto experimental (ver sección 7). NOTA: Por ejemplo, la concentración final de tinte azul se fijó en 50 μM y se probó contra una serie de concentraciones de tinte rojo. Basado en la curva de dosificación de tinte rojo, la concentración óptima de tinte rojo fue de 210 μM, lo que dio un sesgo mínimo de tinte (Figura 1B). Una mayor concentración de tinte rojo impulsa a las moscas a preferir los alimentos rojos, mientras que una menor concentración impulsa a las moscas a preferir la comida azul. Refinar cuidadosamente las concentraciones de colorante azul o rojo en incrementos de 1 μM, ya que las diferencias de esta magnitud y mayores pueden afectar a los resultados experimentales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación del 1% de agarose<ol>
<li>Combine 0,5 g de agarose y 50 ml de agua pura (o algunos de ellos múltiples) en un recipiente apto para microondas. Microondas la solución de agarose hasta que se disuelva, revolviendo según sea necesario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de otros componentes alimentarios<ol>
<li>Disolver cada componente alimentario, incluyendo sacarosa y cualquier compuesto experimental, en agua a una concentración 100 veces o mayor de la concentración final probada. NOTA: El volumen total de cada ingrediente alimenticio añadido al 1% de agar no debe exceder de 1 ml por agar fundido de 10 ml. De lo contrario, la agarose puede diluirse demasiado y no se solidificará adecuadamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de medios alimentarios<ol>
<li>Mezcle el agar, el tinte y el compuesto experimental deseado en tubos centrífugas de polipropileno cónico (15 o 50 ml); utilizar agua en lugar del tacstant experimental en el alimento de control. Haga esto mientras el agar todavía es completamente líquido y mezcle bien usando un mezclador de vórtice. Mantenga los tubos en un baño de agua de 60 °C mientras no esté en uso para evitar que la agarose se endurezca antes de ser distribuida en platos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de platos para el experimento NOTA: Asegúrese de que todos los platos estén completamente secos antes de comenzar.<ol>
<li>Pipeta 1 mL de medio de alimentos experimentales rojos en un lado del plato de ensayo (Figura 1A); repetir para el número deseado de platos. Deje que la agarose se enfríe hasta que se firme (3-5 min), y luego pipetear 1 mL de comida de control azul en el otro lado de los platos(Figura 1A). Repita este proceso con el par azul rojo/experimental de control. NOTA: Asegúrese de que todos los platos estén completamente configurados antes de comenzar el experimento. Utilice los platos en un plazo de 30 minutos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Iniciar el ensayo de alimentación bidireccional
<ol><li>Paralizar temporalmente las líneas de vuelo experimentales sobre hielo hasta que no se observen actividades motoras obvias como volar y escalar. Una vez inmovilizadas las moscas, invierta suavemente el vial y toque para transferir todas las moscas a la cámara de ensayo. NOTA: Choque frío toma ~ 3-5 min. La exposición prolongada al frío puede afectar la fisiología y la salud de la mosca y, por lo tanto, debe evitarse.</li>
	<li>Coloque rápidamente la cubierta en la cámara y reservela. Una vez que todas las moscas hayan sido transferidas, mueva todas las cámaras a un espacio oscuro y cerrado. Permita que el ensayo funcione durante 90 minutos. NOTA: Un entorno oscuro minimiza la influencia de la vía visual de la mosca en el comportamiento de alimentación y elimina cualquier señal ambiental del exterior del plato.</li>
</ol>6. Terminación del ensayo de alimentación bidireccional
<ol><li>Después de que hayan transcurrido 90 minutos, transfiera las cámaras a un congelador de -20 °C para sacrificar las moscas. Después de ~1 h, cuente las moscas. NOTA: Invertir cada placa de Petri antes de colocar el plato en el congelador para asegurarse de que no se congelarán moscas en el alimento.</li>
</ol>7. Asignar un índice de preferencias (PI) para determinar la preferencia alimentaria
<ol><li>Bajo un microscopio de disección estándar, examine el color abdominal de las moscas en cada plato individual. Cuente las moscas como rojas, azules o púrpuras según el color de su abdomen(Figura 2A). Cuente la mosca si su abdomen está más del 50% coloreado, lo que indica una alimentación robusta(Figura 2B). Excluya la mosca si su abdomen contiene sólo un pequeño punto de comida, lo que indica una mala alimentación(Figura 2C).</li>
	<li>Después de contar el número de moscas que comen alimentos azules, rojos o azules y rojos, utilice la siguiente ecuación para asignar a cada placa de Petri un índice de preferencias (PI):</li>
</ol>PI = (Número de moscas comiendo alimentos experimentales) - (Número de moscas comiendo alimentos de control) / (Número de moscas comiendo alimentos experimentales) + (Número de moscas comiendo alimentos de control) + (Número de moscas comiendo ambas)
PI > 0 indica una preferencia por el compuesto experimental, PI < 0 indica una aversión al compuesto experimental, y PI = 0 indica ningún efecto del compuesto en el comportamiento de alimentación.
8. Limpieza de las cámaras de ensayo
<ol><li>Limpie rápidamente los platos de Petri raspando el sustrato de alimentos y enjuagando con agua y jabón sin aroma. Remoje los platos de Petri durante la noche en agua destilada. Compruebe que el sello divisorio en cada plato todavía está estanco, luego deje que el plato se seque al aire. NOTA: Después de asegurarse de que no haya agarose residual o tinción de tinte, las placas Petri están listas para usarse de nuevo.</li>
</ol>

<ol><li>Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+gustatory+receptor+required+for+the+responses+to+sucrose%2C+glucose%2C+and+maltose+identified+by+mRNA+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 14110-14115 (2007).</li>
<li>Dahanukar, A., Foster, K., van der Goes van Naters, W. M., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gr+receptor+is+required+for+response+to+the+sugar+trehalose+in+taste+neurons+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Gr receptor is required for response to the sugar trehalose in taste neurons of Drosophila.</a> Nature Neuroscience. 4 (12), 1182-1186 (2001).</li>
<li>Ueno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+sensitivity+in+Drosophila+correlates+with+mutations+in+and+expression+of+the+gustatory+receptor+gene+Gr5a%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Trehalose sensitivity in Drosophila correlates with mutations in and expression of the gustatory receptor gene Gr5a.</a> Current Biology. 11 (18), 1451-1455 (2001).</li>
<li>Fujii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+sugar+receptors+in+sweet+taste+perception%2C+olfaction%2C+and+internal+nutrient+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila sugar receptors in sweet taste perception, olfaction, and internal nutrient sensing.</a> Current Biology. 25 (5), 621-627 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+representations+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Taste representations in the Drosophila brain.</a> Cell. 117 (7), 981-991 (2004).</li>
<li>Thorne, N., Chromey, C., Bray, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+perception+and+coding+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Taste perception and coding in Drosophila.</a> Current Biology. 14 (12), 1065-1079 (2004).</li>
<li>Slone, J., Daniels, J., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+receptors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sugar receptors in Drosophila.</a> Current Biology. 17 (20), 1809-1816 (2007).</li>
<li>Dus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+sensor+in+the+brain+directs+the+action+of+the+brain-gut+axis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nutrient sensor in the brain directs the action of the brain-gut axis in Drosophila.</a> Neuron. 87 (1), 139-151 (2015).</li>
<li>Toshima, N., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+preference+for+amino+acids+is+dependent+on+internal+nutritional+state+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Taste preference for amino acids is dependent on internal nutritional state in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Experimental Biology. 215 (16), 2827-2832 (2012).</li>
<li>Melcher, C., Bader, R., Pankratz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acids%2C+taste+circuits%2C+and+feeding+behavior+in+Drosophila%3A+towards+understanding+the+psychology+of+feeding+in+flies+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Amino acids, taste circuits, and feeding behavior in Drosophila: towards understanding the psychology of feeding in flies and man.</a> Journal of Endocrinology. 192 (3), 467-472 (2007).</li>
<li>Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+for+attractive+salt-taste+coding+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila.</a> Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).</li>
<li>Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila.</a> Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).</li>
<li>Moon, S. J., Kottgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taste+receptor+required+for+the+caffeine+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A taste receptor required for the caffeine response in vivo.</a> Current Biology. 16 (18), 1812-1817 (2006).</li>
<li>Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+logic+and+evolution+of+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila.</a> Current Biology. 30 (1), 17-30 (2020).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+receptors+required+for+avoiding+the+insecticide+L-canavanine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine.</a> Journal of Neuroscience. 32 (4), 1429-1435 (2012).</li>
<li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taste+of+the+Drosophila+gustatory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A taste of the Drosophila gustatory receptors.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (4), 345-353 (2009).</li>
<li>Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+taste+receptors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Candidate taste receptors in Drosophila.</a> Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).</li>
<li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+coding+of+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Peripheral coding of taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li>
<li>Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+processing+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Gustatory processing in Drosophila melanogaster.</a> Annual Review of Entomology. 63, 15-30 (2018).</li>
<li>Freeman, E. G., Dahanukar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+neurobiology+of+Drosophila+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular neurobiology of Drosophila taste.</a> Current Opinion in Neurobiology. 34, 140-148 (2015).</li>
<li>Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+sensitivity+to+trehalose+and+its+alteration+by+gene+dosage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).</li>
<li>Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+experience-induced+taste+desensitization+modulated+by+the+Drosophila+TRPL+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel.</a> Nature Neuroscience. 16 (10), 1468-1476 (2013).</li>
<li>Bantel, A. P., Tessier, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+preference+assay+for+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Taste preference assay for adult Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (115), e54403(2016).</li>
<li>Shiraiwa, T., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proboscis+extension+response+%28PER%29+assay+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193(2007).</li>
<li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prandiology+of+Drosophila+and+the+CAFE+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prandiology of Drosophila and the CAFE assay.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8253-8256 (2007).</li>
<li>Diegelmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CApillary+FEeder+assay+measures+food+intake+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The CApillary FEeder assay measures food intake in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55024(2017).</li>
<li>Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIC%3A+high-throughput%2C+continuous+analysis+of+feeding+behaviors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila.</a> PLoS One. 9 (6), 101107(2014).</li>
<li>Yoshihara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+calcium+signals+from+identified+neurons+and+feeding+behavior+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3625(2012).</li>
<li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Drosophila+food+intake%3A+comparative+analysis+of+current+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li>
<li>Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taste+circuit+that+regulates+ingestion+by+integrating+food+and+hunger+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals.</a> Cell. 165 (3), 715-729 (2016).</li>
<li>Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+quantitative+food-intake+assays+and+forcibly+activating+neurons+to+study+appetite+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Combining quantitative food-intake assays and forcibly activating neurons to study appetite in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e56900(2018).</li>
<li>Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+gustatory+receptor+essential+for+aversive+taste+and+inhibiting+male-to-male+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship.</a> Current Biology. 19 (19), 1623-1627 (2009).</li>
<li>Zhang, Y. V., Aikin, T. J., Li, Z., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+of+food+texture+sensation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The basis of food texture sensation in Drosophila.</a> Neuron. 91 (4), 863-877 (2016).</li>
<li>Itskov, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+monitoring+and+quantitative+analysis+of+feeding+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila.</a> Nature Communications. 5, 4560(2014).</li>
<li>Qi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+feeding+assay+in+adult+Drosophila+reveals+rapid+modulation+of+food+ingestion+by+its+nutritional+value%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value.</a> Molecular Brain. 8, 87(2015).</li>
<li>Simpson, J. H., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+and+optogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Functional imaging and optogenetics in Drosophila.</a> Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflictos de intereses ni intereses financieros competidores.

Este método implica varios pasos cruciales donde pueden producirse problemas. En primer lugar, asegúrese de que las moscas ingieren una cantidad suficiente de alimentos para proporcionar datos estables. Si las moscas comen mal, asegúrese de que las moscas hayan estado hambrientas durante al menos 24 h, y que el medio experimental contenga al menos una concentración mínima de sacarosa (2 mM). Para estimular aún más el consumo de alimentos, prolongue el período de inanición húmeda más allá de las 24 h, dependiendo de la co...

A pesar de las diferencias dramáticas en la estructura anatómica de los órganos gustativos entre moscas y mamíferos, las respuestas conductuales de las moscas a muchas sustancias tástricas son sorprendentemente similares a las de los mamíferos. Por ejemplo, las moscas prefieren el azúcar1,2,3,4,5,6,7,8,aminoácidos9,10y baja sal11,que indican nutrientes, pero rechazan los alimentos amargos12,13,14,15 que son desagradables o tóxicos. En las últimas dos décadas, las moscas han demostrado ser un organismo modelo muy valioso para avanzar en la comprensión de muchas cuestiones fundamentales relacionadas con la sensación del gusto y el consumo de alimentos, incluyendo la detección de tastant, la transducción del sabor, la plasticidad del sabor y la regulación de alimentación16,17,18,19,20. Notablemente, una serie de estudios han demostrado que la transducción del sabor y los mecanismos de circuito neural subyacentes a la percepción del gusto son análogos entre las moscas de la fruta y los mamíferos. Por lo tanto, la mosca de la fruta sirve como un organismo experimental ideal, permitiendo a los investigadores descubrir conceptos y principios conservados evolutivamente que rigen la detección y el consumo de alimentos en el reino animal.
Para investigar la sensación de sabor en las moscas, es fundamental establecer un ensayo rápido y riguroso para medir objetivamente la preferencia alimentaria. A lo largo de los años, varios métodos de alimentación, tales como ensayos a base de tintes11,12,13,21,22,23, el ensayo de respuesta de extensión de proboscis mosca24, el alimentador capilar (CAFE) ensayo25,26, el ensayo Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC)27y otros métodos combinatorios se han desarrollado para medir cuantitativamente la preferencia alimentaria y/o la ingesta de alimentos para moscas de la fruta28,29,30,31. Uno de los paradigmas de alimentación populares es el ensayo de alimentación a base de tinte de dos opciones utilizando una placa de microtitro multi-well12,21,32 o, como se describe aquí, una pequeña placa de Petri11,22 como cámara de alimentación. Este ensayo está diseñado sobre la base de la transparencia del abdomen de la mosca. Durante este ensayo, las moscas se colocan en la cámara de alimentación y se presentan con dos opciones de alimentos mezclados con tinte rojo o tinte azul. Una vez completado el ensayo, los abdomens de mosca aparecen rojos o azules dependiendo de los alimentos que hayan consumido.
Tanto la placa Petri como los ensayos de alimentación a base de tinte multiwell-plate son altamente robustos y producen aproximadamente los mismos resultados. Utilizando estos dos ensayos, numerosos descubrimientos importantes y avances se han hecho para descifrar los receptores y células altamente diversificados responsables de detectar los gustos de los alimentos y la textura de los alimentos11,12,21,22,32,33. En el ensayo a base de tinte, un paso experimental que requiere un tiempo y esfuerzo considerables es preparar y cargar alimentos en la cámara de alimentación. Para reducir el tiempo de preparación y carga de los alimentos, este ensayo se modificó reemplazando la placa de microtiter multiporípodo por una pequeña placa Petri, que se divide en dos compartimentos iguales. En el ensayo a base de placas de Petri, se añaden dos alimentos diferentes complementados con tinte azul o rojo a las dos mitades del plato. A continuación, ~ 70 precediendo, 2-4 días de edad moscas se colocan en el plato y se les permite elegir entre alimentos azules y rojos en la oscuridad durante unos 90 minutos. A continuación, se examina el abdomen de cada mosca y se calcula el índice de preferencias (PI).
Este ensayo de alimentación de dos opciones basado en placas Petri es asequible, simple y rápido. Una placa multi-well requiere aproximadamente 110 s para llenar, mientras que cada placa Petri toma sólo ~ 20 s. Además, la placa multipobado requiere canalizar pequeños volúmenes de alimentos en un gran número de pequeños pozos (por ejemplo, 60 o más pozos por plato), lo que requiere una precisión y atención considerables. Por el contrario, el ensayo basado en placas De Petri requiere sólo dos acciones por plato. Como el ensayo de alimentación puede implicar un gran número de réplicas, el ensayo basado en placas De Petri ahorra una cantidad notrivial de tiempo y esfuerzo. Este ensayo da resultados equivalentes a los del ensayo a base de múltiples oleajes y ha demostrado tener éxito en abordar muchas preguntas fundamentales en la sensación de sabor, incluyendo la codificación del sabor de la sal11,la plasticidad del sabor modificado por la experiencia alimentaria22,y la base molecular de la sensación de textura de los alimentos33. En resumen, este ensayo de dos opciones basado en placas de Petri es una poderosa herramienta para investigar cómo las moscas perciben los ambientes de nutrientes externos e internos para provocar un comportamiento de alimentación adecuado.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Thomas Scientific</td><td>C756P56</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo transparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9884114</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Amscope</td><td>SM-2T-6WB-V331</td><td></td></tr><tr><td>FCF Brilliant Blue</td><td>Wako Chemical</td><td>3844-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Fly CO2 configuración de anestesia</td><td>Genesee Scientfic</td><td>59-114/54-104M</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de moscas con ciclo día/noche programable</td><td>Powers Scientific Inc.</td><td>IS33SD</td><td></td></tr><tr><td>Líneas</td><td></td><td></td><td></td>de mosca</tr><tr><td>Plato de vidrio (apto para microondas)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A Botella</td><td></td></tr> de <tr><td>almacenamiento de medios</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-192-9998</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de plástico cortado para adaptarse al plato de una hoja de no más de 5 mm</td><td></td><td></td><td></td>de grosor</tr><tr><td>Viales de plástico para moscas</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-116</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamina B</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9012</td><td></td></tr><tr><td>Compuesto de interés</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tastant Mezclador de vórtice</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BV1000</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD05</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo rápido de preferencia alimentaria en drosophila

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

Para seleccionar alimentos con valor nutricional evitando al mismo tiempo el consumo de agentes dañinos, los animales necesitan un sistema de sabor sofisticado y robusto para evaluar su entorno alimentario. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un organismo modelo genéticamente tractable que se utiliza ampliamente para descifrar los fundamentos moleculares, celulares y neuronales de la preferencia alimentaria. Para analizar la preferencia de los alimentos con mosca, se necesita un método de alimentación robusto. Aquí se describe un ensayo de alimentación de dos opciones, que es riguroso, que ahorra costos y es rápido. El ensayo es a base de placa de Petri e implica la adición de dos alimentos diferentes complementados con tinte azul o rojo a las dos mitades del plato. A continuación, ~ 70 precediendo, 2-4 días de edad moscas se colocan en el plato y se les permite elegir entre alimentos azules y rojos en la oscuridad durante unos 90 minutos. El examen del abdomen de cada mosca es seguido por el cálculo del índice de preferencias. A diferencia de las placas multiwell, cada placa Petri toma sólo ~ 20 s para llenar y ahorra tiempo y esfuerzo. Este ensayo de alimentación se puede emplear para determinar rápidamente si a las moscas les gusta o no un alimento en particular.

En este ensayo, un plato de 35 mm se dividió en dos compartimentos de alimentación iguales, con cada mitad del plato que contenía alimentos agarose junto con tinte azul o rojo(Figura 1A). Para excluir el sesgo de tinte, las concentraciones de tinte azul y rojo se refinaron cuidadosamente para producir un PI aproximado "0" cuando sólo se añadieron estos dos tintes (Figura 1B). Una vez que la placa de Petri fue cargada con alimentos probados, ~ 70 moscas adultas d...

Presentamos un protocolo para un ensayo de alimentación de dos opciones para moscas. Este ensayo de alimentación es rápido y fácil de ejecutar y es adecuado no sólo para la investigación de laboratorio a pequeña escala, sino también para pantallas de comportamiento de alto rendimiento en moscas.

Un ensayo rápido de preferencia alimentaria en Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

Nuestro protocolo está diseñado para realizar un ensayo fino para la mosca de la fruta, que es un potente organismo modelo que permite diseñar para todos los genes, receptores, neuronas y una neuro-psicópatas que están involucrados en la sensación de prueba y el consumo de alimentos. Al igual que los seres humanos vuelan como alimentos que saben: dulces, ligeramente salados, ligeramente agrios o rechazan alimentos que saben amargos, demasiado salados o demasiado agrios. La potencia de esta técnica proviene de la velocidad y la comodidad.Puede probar muchas moscas diferentes en un PRH de poco tiempo sin una configuración compleja. Nuestro método es un excelente y excelente ensayo para entender si vuela como un, al igual que un alimento en particular, así como cómo ciertos productos genéticos influyen en la preferencia del gusto. Establecer si los animales aceptan o rechazan ciertos alimentos puede ser un desafío.Por lo tanto, es importante establecer un protocolo estándar para probar la preferencia del sabor animal. Para preparar viales de inanición para el ensayo, compacte libremente un trozo de tejido en la parte inferior de cada vial de mosca de plástico vacío por tipo de gen mosca que se va a probar. Tal que el papel llena este espacio sin formar una masa densa, a unos tres mililitros de agua pura a cada vial para saturar completamente los tejidos sin agua estancada.Teniendo cuidado de que no haya gotas grandes de exceso de agua en las paredes de los viales. Alternativamente, cinco mililitros de 1%Agros sin sacarosa pueden ser sustituidos por el papel empapado, 24 horas antes del experimento de dióxido de carbono anestesiado de dos a cuatro días de moscas de edad y ordenar las moscas en grupos de aproximadamente 70. A continuación, agregue cada grupo de moscas a un vil de inanición y etiquete cada vial con el genotipo y el tiempo de inicio de la inanición.Antes de realizar un experimento, prepare una gama de diluciones para cada tinte utilizando el mismo alimento con cada color de tinte diferente. Combinado 0,5 gramos de Agros con 50 mililitros de agua pura en un recipiente apto para microondas y calienta la solución Agro hasta que se haya disuelto revolviendo según sea necesario. Disolver cada componente alimentario, incluyendo sacarosa y cualquier compuesto experimental en agua a una concentración de 100 veces o mayor de la concentración final probada.Y mezcle el tinte Agro y el compuesto experimental deseado en tubos cónicos de centrífuga de polipropileno. Después de mezclar coloque los tubos en el baño de agua de 60 grados Celsius hasta su distribución y agregue un mililitro de un color de las soluciones experimentales de alimentos y tintes a un lado del primer plato de ensayo. Deje que el Agros se enfríe hasta que se firme antes de añadir un mililitro de la solución alimentaria de control, etiquetado con el segundo color de tinte al otro lado del plato.A continuación, repita la preparación del plato de ensayo, con el control opuesto y el par de solución experimental de tinte. Utilice los resultados para identificar dos concentraciones de tinte que producen un índice de preferencia de cero. Cuando no se añade ningún compuesto experimental.Para realizar un ensayo de alimentación bidireccional. Primero paralizó temporalmente una mosca experimental vil durante tres a cinco minutos sobre hielo hasta que no se observan actividades motoras obvias como volar y escalar. Una vez que las moscas han sido inmovilizadas, invierta suavemente el vial y toque para transferir las moscas a la cámara de ensayo y luego coloque rápidamente la tapa en la cámara.Cuando todos los grupos hayan sido transferidos, mueva todas las cámaras de ensayo a un espacio oscuro y cerrado durante 90 minutos. Al final del ensayo invertir las cámaras a menos 20 grados centígrados congelador, durante aproximadamente una hora. Antes de colocar cada cámara bajo un microscopio estéreo para examinar el color abdominal de las moscas en cada grupo experimental.Cuente una mosca, si el abdomen es más del 50% de color que indica una alimentación robusta, deseche cualquier mosca en la que el abdomen contenga sólo un pequeño punto de comida, lo que es indicativo de una alimentación deficiente. Cuando se hayan contado todas las moscas, utilice la ecuación para cuantificar el índice de preferencias alimentarias para cada grupo. En este ensayo, un plato de 35 milímetros se dividió en dos semanas que alimentaremos en compartimentos que contienen alimentos de Agro, junto con tinte rojo o azul.Para excluir el sesgo de tinte, las concentraciones de tinte azul y rojo se refinaron cuidadosamente para producir una preferencia cero aproximada cuando sólo se añadieron estos dos tintes, 90 minutos después de que la mosca adulta hambrienta húmeda cargando colores abdominales bly apareciera como azul o rojo. Si el animal consumió predominantemente alimentos azules o rojos, respectivamente, si una mosca consumía tanto azul como rojo, el abdomen parecía púrpura. Sólo las moscas que ingirieron una cantidad considerable de alimentos fueron puntuadas, mientras que las moscas con una ingesta insuficiente de alimentos no fueron contadas.La comparación de este ensayo basado en placas De Petri con el ensayo basado en placas de varios pozos reveló que los dos métodos de alimentación dieron esencialmente los mismos resultados de alimentación de ensayo en respuesta a alimentos dulces, amargos y salados en moscas de tipo salvaje. En particular, sin embargo, es mucho más rápido preparar y distribuir alimentos en una placa de Petri que en un plato de 60 pozos multi-pozo. Asegúrese de identificar qué concentración de tinte usar especialmente después de hacer un nuevo lote de dieta.Esta concentración puede ser diferente entre las líneas de vuelo. Nuestro par de hoy en día se basa en el ensayo de dos opciones es muy potente también. Para usted preguntando cómo las moscas, sentir tanto el marco interno-externo dañado a la alimentación y el comportamiento apropiados del estado real.

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Investigación

JoVE Journal

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