Optimización de reacciones radioquímicas utilizando matrices de gotitas

Los sintetizadores de radio automatizados actuales están diseñados para producir grandes lotes de radiofármacos ampliamente utilizados, como FDG. Debido al número limitado de síntesis posibles por día, y el consumo relativamente alto de reactivos, estos sistemas, sin embargo, no son adecuados para realizar estudios de optimización de la síntesis. Con esta técnica, el rendimiento se incrementa significativamente al realizar hasta 16 reacciones simultáneas en paralelo y el consumo de reactivos se reduce cien veces.

Además, mediante la realización de reacciones en paralelo, se necesitan lotes justos de radioisótopos para completar un estudio. El aumento del rendimiento permite una exploración más amplia de las condiciones de reacción con un mayor número de réplicas cada una en comparación con el uso de instrumentos convencionales. Si bien este protocolo muestra la optimización de la concentración de precursores en la síntesis de falpírida, la técnica se puede utilizar para optimizar otras condiciones y otros radiofármacos.

Comience fabricando lotes de chips de microgotas multirrea reacción a partir de obleas de silicio de cuatro pulgadas utilizando técnicas de fotolitografía estándar. En este protocolo, la optimización de alto rendimiento de la concentración de precursores se demuestra con la síntesis del radiofármaco Fallypride. Se pueden realizar 16 reacciones simultáneas en un solo chip.

Las condiciones a comparar se asignan a los sitios de reacción. Preparar una solución común del disolvente de reacción que consiste en alcohol de xil y acetonitrilo en una mezcla de uno a uno por volumen. Asegúrese de que el volumen es suficiente para crear la serie de dilución planificada.

Preparar una solución de 30 microlitros de precursor en el disolvente de reacción con la concentración máxima a explorar. A partir de la solución de stock precursor y disolvente de reacción realizar diluciones en serie dos veces en un conjunto de tubos de microcentrífuga para preparar las diferentes concentraciones de la solución precursora. Prepare otro conjunto de tubos de microcentrífuga para recoger cada producto de reacción crudo utilizando un marcador permanente para etiquetar cada tubo con un número único.

Asegúrese de que el número total de tubos de microcentrífuga coincide con el número de condiciones multiplicado por el número de réplicas. Prepare un stock de 10 mililitros de solución de recolección que comprende de nueve a un metanol a agua desionizada. Alícuota 50 microlitros de cada uno en un conjunto adicional de 16 tubos de microcentrífuga etiquetados como solución de recolección.

Prepare una solución común de fluoruro mezclando alrededor de siete milicuries de la fuente de fluoruro con 56 microlitros de 75 milimolares de bicarbonato de tetrabutilamonio y diluyendo con agua DI hasta 140 microlitros. Usando una micropipeta, cargue una gota de ocho microlitras de solución madre de fluoruro en el primer punto de reacción de un chip de reacción múltiple. Mida la actividad del chip colocándolo en un calibrador de dosis y registre el momento en que se realiza la medición.

Retire el chip del calibrador de dosis y cargue una gota de ocho microlitros de solución madre de fluoruro en el segundo punto de reacción. Mida la actividad en el chip y registre el tiempo en el que se realiza la medición. Repita este proceso para todos los demás sitios de reacción.

Calcule la actividad cargada por punto de reacción tomando la medición de actividad después de cargar el radioisótopo y restando la medición anterior antes de que se cargara ese sitio. Para alinear el chip multirretor en el calentador, agregue una capa delgada de pasta térmica en la parte superior del calentador de cerámica. Coloque cuidadosamente el chip en la parte superior del calentador usando pinzas alineando la esquina de referencia del chip con la esquina de referencia del calentador.

El chip debe sobresalir del calentador por una pequeña cantidad. Calentar el chip durante un minuto poniendo el calentador a 105 grados Centígrados en el programa de control para evaporar las gotitas, dejando un residuo seco de fluoruro y tetrabutilamamonio bicarbonato. Luego, enfrió el chip ajustando el calentador a 30 grados Celsius y encendiendo el ventilador de enfriamiento con el programa de control.

Usando una micropipeta, agregue una solución de seis microlitros de precursor de falypride encima del residuo seco en el primer sitio de reacción. Repita esto para todos los demás sitios de reacción en el chip. Utilice el plan de optimización para determinar qué concentración de la serie de dilución se utiliza para cada sitio de reacción.

Caliente el chip a 110 grados Celsius durante siete minutos usando el programa de control para realizar la reacción de radiofluoración, luego enfríe el chip ajustando el calentador a 30 grados Celsius y encendiendo el ventilador de enfriamiento con el programa de control. Recoja el producto crudo en el primer sitio de reacción añadiendo 10 microlitros de solución de recolección del tubo de microcentrífuga designado. Después de esperar cinco segundos, aspirar el producto crudo diluido y transferirlo al tubo de microcentrífuga de recolección correspondiente.

Repita este proceso un total de cuatro veces utilizando la misma punta de pipeta y luego cierre el tubo de microcentrífuga. Repita estos pasos para recoger el producto crudo de todos los demás sitios de reacción en el chip. Para determinar la eficiencia de recolección para la primera reacción en el chip, coloque el tubo de microcentrífuga con el producto crudo recogido del primer punto de reacción en el calibrador de dosis para medir la actividad.

Registre la medición y el tiempo de la medición. Repita este proceso para cada uno de los productos crudos recogidos. Calcular la eficiencia de recolección dividiendo la actividad del producto crudo recolectado por la actividad inicial medida para el mismo sitio de reacción.

Repita esto para todos los demás sitios de reacción en el chip. A continuación, analice la composición de cada producto crudo recolectado. Con un lápiz, dibuje una línea a 15 milímetros del borde inferior de la placa TLC y otra línea a 50 milímetros del mismo borde.

La primera línea es la línea de origen y la segunda es la primera línea de disolvente. Dibuje ocho X pequeñas a lo largo de la línea de origen con un espaciado de cinco milímetros para definir la posición de detección de la muestra para cada uno de los ocho carriles. Usando una micropipeta, transfiera 0.5 microlitros del primer producto crudo a la placa TLC en la X para el primer carril.

Repita esto para productos crudos adicionales, luego espere a que las manchas se sequen. Desarrolle cada placa TLC utilizando una fase móvil del 60% de acetonitrilo en formiato de amonio 25 milimolares con TEA al 1% hasta que el frente del solvente alcance la primera línea del solvente. En ese momento, retire la placa TLC de la cámara y espere a que el disolvente en la placa TLC se seque, luego coloque la placa TLC en el sistema de imágenes Cerenkov y cúbrala con un portaobjetos de microscopio de vidrio.

Obtenga una imagen de radiactividad de cada placa TLC configurando el sistema de imágenes Cerenkov a una exposición de cinco minutos, luego seleccione el archivo producido de la imagen en la placa TLC y realice correcciones de imagen estándar. Utilice el análisis de la región de interés para el primer carril de la primera placa TLC. Dibuje regiones alrededor de cada banda visible en el carril y, a continuación, calcule la fracción de intensidad integrada de cada región en comparación con la intensidad integrada total de todas las regiones.

Determinar la eficiencia de fluoración como la fracción de actividad en la banda de Falypride. Repita este análisis para todos los demás carriles en todas las placas TLC. Luego, calcule el rendimiento radioquímico crudo para cada reacción y elija la concentración óptima de precursores examinando el rendimiento radioquímico crudo en función de la concentración de precursores.

Los estudios de optimización del fallypride radiofarmacéutico se realizaron variando la concentración de precursores en el acetonitrilo de alcohol xil. Las reacciones fueron realizadas en 110 grados de centígrado por siete minutos. La eficiencia de la recolección y la composición de la muestra se muestran aquí.

La eficacia de la fluoración aumentó con el aumento de la concentración del precursor y la concentración de fluoruro sin reaccionar disminuyó. Había una pequeña cantidad de producto secundario radiactivo a bajas concentraciones de precursores, que no se formó a las concentraciones más altas de precursores. La eficiencia de la recolección fue casi cuantitativa para la mayoría de las condiciones, aunque disminuyó ligeramente a bajas concentraciones de precursores.

El mayor rendimiento radioquímico crudo se logró con una concentración de precursores de 39 milimolares. En esta condición, la eficiencia de fluoración fue del 96%El RCY crudo fue del 87% y no se observó formación de productos secundarios radiactivos. Es fundamental tener un plan de mapa de qué condición de reacción corresponde a qué gota de reacción en el chip y tener tubos reactivos debidamente etiquetados y tubos de recolección de productos que se puedan verificar dos veces durante el experimento.

El procedimiento se puede utilizar para la optimización de otras condiciones de reacción, como la cantidad de base, el tipo de disolvente o el volumen de reacción. También se puede utilizar para optimizar la síntesis de otros radiofármacos.