Visualización Del SARS-CoV-2 Usando Inmuno ARN-Fluorescencia Hibridación In Situ
23 de diciembre de 2020
Aquí, describimos un método simple que combina el hibridación in situ de la fluorescencia del ARN (RNA-PESCADO) con la inmunofluorescencia para visualizar el ARN agudo severo del coronavirus 2 del coronavirus del síndrome respiratorio (SARS-CoV-2). Este protocolo puede aumentar la comprensión de las características moleculares de las interacciones ARN-huésped SARS-CoV-2 a nivel unicelular.
Este protocolo permitió visualizar el ARN del SARS-CoV-2 en líneas celulares y en cultivos tridimensionales de epitelio de las vías respiratorias humanas totalmente diferenciados, proporcionando una herramienta para comprender mejor la patogénesis viral y la replicación a nivel de una sola célula. Debido a su alta especificidad, sensibilidad y resolución, este método es útil no solo para estudios de ciencia básica del SARS-coronavirus-2, sino también para proyectos aplicativos, como el diagnóstico. La demostración del procedimiento estará a cargo de Agnieszka Suder, una estudiante de doctorado de mi laboratorio.
Después de fijar y permeabilizar las células como se describe en el manuscrito de texto, retire la solución 1X PBS de los pocillos y agregue al menos 300 microlitros de tampón de amplificación a cada pocillo. Incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente. Prepare cada horquilla HCR enfriando a presión el volumen deseado en tubos separados.
Para preparar 300 microlitros de solución de amplificación, use 18 picomoles de cada horquilla. Transfiera la solución de horquilla a tubos e incube a 95 grados centígrados durante 90 segundos. Luego enfríe a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.
Prepare una mezcla de horquillas añadiendo las horquillas H1 y H2 enfriadas a presión al tampón de amplificación. Coloque gotas de 30 a 50 microlitros de mezcla de horquilla en Parafilm. Coloque los cubreobjetos con células sobre las gotas de mezcla de horquilla e incube las muestras durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.
Para montar los portaobjetos, coloque dos gotas de 10 microlitros de medio de montaje en un portaobjetos, asegurándose de que las gotas estén lo suficientemente separadas para permitir que se coloquen dos cubreobjetos en un solo portaobjetos. Retire el exceso de líquido golpeando los cubreobjetos con una toalla limpia. A continuación, colóquelos en un medio de montaje antidecoloración con las celdas hacia abajo.
Coloque las muestras montadas sobre una superficie seca y plana en la oscuridad y déjelas curar. Después de fijar y permeabilizar las células de AEH como se describe en el manuscrito del texto, preamplifique las muestras incubándolas con tampón de amplificación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Use 30 picomoles de cada horquilla para preparar 500 microlitros de solución de amplificación.
Transfiera la solución de horquilla a los tubos e incube a 95 grados centígrados durante 90 segundos. Luego enfríelos a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. Prepare la solución de horquilla agregando todas las horquillas enfriadas a presión a 500 microlitros de tampón de amplificación a temperatura ambiente.
Retire la solución de preamplificación y agregue la solución de horquilla completa. A continuación, incubar las muestras durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Coloque la membrana recortada de los insertos Transwell en 10 microlitros de medio de montaje antidecoloración con las celdas hacia arriba y agregue medio de montaje adicional a la membrana.
A continuación, cubra las membranas con cubreobjetos. Este protocolo inmuno-RNA-FISH se llevó a cabo en dos sistemas celulares, una línea celular Vero y un cultivo 3D de epitelio de vías respiratorias humanas. Aquí se muestra la localización del ARN subgenómico del SARS-coronavirus-2 en células Vero infectadas y simuladas.
El ARN viral se puede ver en rojo. Aquí se muestra la localización del ARN subgenómico del SARS-coronavirus-2 en células epiteliales de las vías respiratorias humanas infectadas e inoculadas simuladamente. El protocolo de permeabilización se optimizó en células Vero.
La permeabilización con detergente da como resultado una señal clara y específica para el ARN subgenómico del SARS-coronavirus-2, mientras que el uso de etanol da como resultado una imagen borrosa y desenfocada. Al montar las guías con celdas Vero, es importante colocar un cubreobjetos con las celdas hacia abajo. Al montar los portaobjetos de AEH, la membrana debe colocarse con las células hacia arriba.
Esta técnica se puede modificar fácilmente para permitir la detección de cualquier ARN, incluidos los ARN no codificantes y los virus de ARN que puedan surgir en el futuro. Junto con la inmunofluorescencia, se puede utilizar para estudiar las interacciones proteína-ARN a nivel de una sola célula.
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Visión general
Este artículo presenta un método que integra la hibridación in situ fluorescente de ARN (RNA-FISH) con inmunofluorescencia para visualizar el ARN del SARS-CoV-2. Este enfoque mejora la comprensión de las interacciones ARN-huésped del SARS-CoV-2 a nivel de célula individual.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Virología
- Biología celular
Antecedentes
- Comprender la patogénesis viral es crucial para desarrollar diagnósticos y tratamientos efectivos.
- El SARS-CoV-2 tiene implicaciones significativas para la salud pública.
- Visualizar el ARN a nivel de célula individual puede proporcionar información sobre la replicación viral.
- Combinar RNA-FISH con inmunofluorescencia ofrece alta especificidad y sensibilidad.
Propósito del estudio
- Visualizar el ARN del SARS-CoV-2 en varios modelos celulares.
- Mejorar la comprensión de las interacciones virales dentro de las células huésped.
- Proporcionar una herramienta tanto para la investigación básica como aplicada en virología.
Métodos utilizados
- Fijación y permeabilización de células.
- Aplicación de tampón de amplificación para la visualización del ARN.
- Uso de horquillas HCR para la detección específica de ARN.
- Técnicas de inmunofluorescencia para complementar RNA-FISH.
Resultados principales
- El ARN del SARS-CoV-2 se visualizó con éxito en líneas celulares y cultivos de epitelio de vías respiratorias humanas.
- El método demostró alta especificidad y sensibilidad.
- Los resultados contribuyen a una mejor comprensión de la patogénesis viral.
- Este protocolo es aplicable tanto para fines de investigación como de diagnóstico.
Conclusiones
- El método combinado es efectivo para estudiar el SARS-CoV-2 a nivel de célula individual.
- Proporciona información valiosa sobre las interacciones ARN-huésped.
- Este enfoque puede ayudar en el desarrollo de herramientas diagnósticas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
High-resolution visualization of SARS-CoV-2 RNA in both cell lines and 3D human airway epithelium cultures enables precise mapping of viral replication and host-pathogen interactions at the single-cell level. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in infectious disease research pipelines. The protocol's adaptability for diverse RNA targets positions it as a reusable asset for rapid response to emerging viral threats.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of viral replication and localization in physiologically relevant systems.
- Supports functional validation of host-virus interaction targets at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific infection events from background.
- Provides high-confidence data for triaging antiviral targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts for viral RNA detection in cell-based assays.
- Supports assay standardization and reproducibility across cell lines and 3D cultures.
- Enables multiplexed detection of RNA and protein targets for comprehensive screening.
- Prepares robust biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant airway models for translational continuity.
- Enables mapping of infection and host response in preclinical tissue systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing predictive, single-cell data.
- Facilitates biomarker discovery through simultaneous RNA and protein visualization.
Pipeline & Workflow Integration
This immuno-RNA-FISH protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Provides high-specificity detection of viral RNA for pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables single-cell resolution measurements and multiplexed readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro and ex vivo models for preclinical validation of infection and host response.
- Enterprise Reuse: Adaptable for detection of any RNA, supporting rapid deployment against emerging pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral pathogenesis studies.
- Operational Value: Standardizes sensitive, multiplexed detection workflows across diverse biological models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to confocal imaging platforms and validated amplification reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across cell and tissue models.
- Adaptable to various RNA targets with protocol optimization for new systems.
- Dependent on careful permeabilization and mounting to ensure signal specificity and clarity.
