Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

El gusano del algodón es una de las plagas más destructivas en todo el mundo. La edición del genoma con la tecnología CRISPR / Cas9 permite una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes en este organismo. Las dos principales ventajas de esta técnica son que tiene una alta especificidad y es hereditable.

Para elegir los objetivos de sgRNA, vaya al sitio web en línea de CRISPR para buscar posibles sitios guía y los exones cercanos a la región principal no traducida del gen. Introduzca la secuencia de exones en el cuadro de texto y seleccione el genoma objetivo de Helicoverpa armigera. Elija la opción PAM para 20 BPNGG y deje las otras configuraciones en los parámetros predeterminados, de acuerdo con los manuales de usuario del sitio web.

Compare las secuencias de guía predichas desde el software y elija una secuencia guía de 20 pares de bases que contengan una o dos guaninas cerca de la región no traducida de cinco primos con la mayor eficiencia predicha y el menor número de desajustes para mejorar la eficiencia de edición y reducir la edición fuera del objetivo. Para la preparación del embrión, seleccione 50 individuos sanos de machos de tres días de edad y hembras de dos días de edad, y mézclelos en una jaula de red limpia. Coloque un trozo de algodón húmedo que contenga una solución de azúcar al 10% en la jaula.

Cubra las jaulas de la red con una gasa y fije la gasa con una banda elástica. Rocíe agua sobre la gasa para mantenerla húmeda. Corte un paño negro en un tamaño apropiado y reemplace la gasa húmeda con este paño negro para permitir la posición libre de óvulos durante 30 minutos.

Pegue la cinta adhesiva de doble cara en un portaobjetos de microscopio. Con fórceps, pegue los parches con huevos en una fila en la superficie de la cinta de doble cara. Presione el margen de cada parche para asegurarse de que se adhieran firmemente a la cinta.

Recolecte de 50 a 100 huevos por portaobjetos de microscopio. Antes de la microinyección, mantenga el portaobjetos del microscopio sobre hielo para retrasar el desarrollo de los embriones. Prepare la aguja tirando de un vidrio capilar con un extractor de micro pipeta como se describe en el manuscrito de texto.

Moler la punta de la aguja con una micro amoladora a una punta de borde afilado. Prepare soluciones de inyección agregando dos microlitros de proteína Cas9 comercializada y sgRNA al agua libre de RNace en un tubo de PCR para obtener una mezcla de volumen de 10 microlitros. Mezclar bien mediante pipeteo y ponerlo sobre hielo.

Establezca los parámetros del microinyector electrónico. Cargue dos microlitros de la mezcla en una aguja usando una punta de pipeta de microcargador, agotando la mayor cantidad de aire residual posible en la punta de la aguja. Conecte la aguja de inyección a un micromanipulador y asegúrese de una conexión estrecha entre las dos partes.

Coloque un portaobjetos en una placa de Petri y colóquelo en el escenario del microscopio. Inserte cuidadosamente la punta de la aguja en el hemisferio superior de un embrión en un ángulo de 45 grados. Presione el pedal para entregar la mezcla en el embrión, lo que lleva a una ligera expansión del embrión.

Retraiga la aguja inmediatamente del embrión y mueva la placa de Petri con una mano hasta que el siguiente embrión esté cerca de la aguja. Inyecte al menos 300 embriones utilizando el mismo procedimiento para garantizar una cantidad suficiente de eclosión. Cubra la tapa de las placas de Petri después de la inyección.

Cuando el color de la superficie de los embriones se haya oscurecido, coloque la dieta artificial en la placa de Petri alrededor del portaobjetos del microscopio. Prepare placas de cultivo de 24 pocillos y llene cada pozo a 1/3 de su capacidad volumétrica con dieta artificial. Escoja la larva de eclosión con un pincel pequeño y transfiérala a la placa de cultivo de 24 pocillos, de modo que un pozo tenga una larva.

Cuando la larva crezca a la tercera etapa instar, transfiérala a una nueva técrae dúctil de vidrio. Transfiera los adultos machos G-zero recién encerrados y los adultos hembras de tipo salvaje a una jaula de red fresca en una proporción igual. Suministrarles una solución de azúcar al 10% en bolas de algodón.

Criar insectos utilizando métodos de rutina hasta la pupación de G-one. Use fórceps para quitar cuidadosamente una pata trasera y coloque cada pierna en un tubo de Lysing Matrix. Homogeneizar la pata trasera utilizando un homogeneizador de tejido.

Extraiga el ADN genómico de la muestra homogeneizada utilizando un kit de extracción comercial de gDNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Amplificar el segmento de genes utilizando cebadores de genotipado y las condiciones de reacción de PCR del manuscrito de texto. Confirme el genotipo con un servicio de secuenciación de genes.

Coloque a los individuos G-one del mismo genotipo en una jaula de red, cruce las progenies G-one y continúe cribando usando los mismos métodos. El sitio objetivo del gen de interés se localizó en su segundo exón. Este sitio fue altamente conservado y el fragmento de banda objetivo de sgRNA sintetizado se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa.

La detección mutante de un solo objetivo de sgRNA se realizó mediante la secuenciación de los productos de PCR de las unidades parentales G-one. La efectividad del uso de pares de sgRNA no superpuestos en diferentes exones se demostró ya que la gran deleción de los mutantes se distinguió fácilmente de las sartenes de tipo salvaje. Después de obtener un cierto número de individuos mutantes, se pueden realizar experimentos electrofisiológicos o conductuales para aclarar la función génica y la interacción entre diferentes genes.