Name: ARN polimerasa atado al ADN para transcripción in vitro programable y computación molecular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprende a regular la actividad de la ARN polimerasa T7 mediante factores de transcripción de ácidos nucleicos artificiales. Este método combina la escalabilidad de los circuitos de ADN con la regulación transcripcional para dispositivos genéticos in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

L.Y.T.C reconoce el generoso apoyo de New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), la Beca discovery del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) y la Iniciativa de Medicina por Diseño de la Universidad de Toronto, que recibe fondos del Fondo de Excelencia en Investigación de Canadá First (CFREF).

<ol><li>Cherry, K. M., Qian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+molecular+pattern+recognition+with+DNA-based+winner-take-all+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks.</a> Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).</li>
<li>Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+network+computation+with+DNA+strand+displacement+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural network computation with DNA strand displacement cascades.</a> Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).</li>
<li>Chen, Y. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+chemical+controllers+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Programmable chemical controllers made from DNA.</a> Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).</li>
<li>di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+synthetic+gene+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Gene+Networks%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Predicting synthetic gene networks.</a> Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).</li>
<li>Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+up+genetic+circuit+design+for+cellular+computing%3A+advances+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Computing%22%5BJournal%5D)">Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects.</a> Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).</li>
<li>Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+tools+and+algorithms+for+designing+customized+synthetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).</li>
<li>MacDonald, J. T., Siciliano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+sequence+design+with+R2oDNA+Designer%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Synthetic+Promoters%22%5BJournal%5D)">Computational sequence design with R2oDNA Designer.</a> Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).</li>
<li>Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Martínez-Pérez, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+design+of+sequences+for+DNA+computing%3A+A+multiobjective+evolutionary+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Soft+Computing%22%5BJournal%5D)">Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach.</a> Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).</li>
<li>Zadeh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUPACK%3A+Analysis+and+design+of+nucleic+acid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).</li>
<li>Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+dynamic+programming+framework+for+the+analysis+of+interacting+nucleic+acid+strands%3A+enhanced+models%2C+scalability%2C+and+speed%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).</li>
<li>Wetterstrand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+costs%3A+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.gov%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing costs: Data.</a> Genome.gov. , (2020).</li>
<li>Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+multi-gene+classifier+for+disease+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics.</a> Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-fuelled+molecular+machine+made+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-fuelled molecular machine made of DNA.</a> Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).</li>
<li>Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+scalable+DNA-based+information+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic and scalable DNA-based information storage.</a> Nature Communications. 11 (1), 2981(2020).</li>
<li>Yurke, B., Mills, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+DNA+to+power+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Genetic+Programming+and+Evolvable+Machines%22%5BJournal%5D)">Using DNA to power nanostructures.</a> Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).</li>
<li>Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+entropy-driven+reactions+and+networks+catalyzed+by+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA.</a> Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).</li>
<li>Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+design+principles+for+leakless+strand+displacement+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effective design principles for leakless strand displacement systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).</li>
<li>Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+energy+landscapes+for+kinetic+control+of+DNA+strand+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement.</a> Nature Communications. 5 (1), 5324(2014).</li>
<li>Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -B. V., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handhold-mediated+strand+displacement%3A+a+nucleic+acid-based+mechanism+for+generating+far-from-equilibrium+assemblies+through+templated+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+genetic+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles of genetic circuit design.</a> Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).</li>
<li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150 (3), 647-658 (2012).</li>
<li>Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene-regulatory+network+engineering+with+synthetic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).</li>
<li>Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+efficient+cross-priming+using+antigen-coated+yeast+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles.</a> Journal of immunotherapy. 31 (7), 607(2008).</li>
<li>Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+partnered+replication+for+the+directed+evolution+of+genetic+parts+and+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).</li>
<li>Baugh, C., Grate, D., Wilson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2.8+%C3%85+crystal+structure+of+the+malachite+green+aptamer11%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">2.8 Å crystal structure of the malachite green aptamer11.</a> Journal of Molecular Biology. Doudna, J. A. 301 (1), 117-128 (2000).</li>
<li>Chou, L. Y. T., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transcriptional+regulation+via+nucleic+acid-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).</li>
<li>Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminal+carboxy+group+of+T7+RNA+polymerase+ensures+efficient+magnesium+ion-dependent+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis.</a> Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).</li>
<li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+Polymerase+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li>
<li>Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation%2C+elongation%2C+and+processivity+of+carboxyl-terminal+mutants+of+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).</li>
<li>Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).</li>
<li>Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortase-tag+expressed+protein+ligation%3A+combining+protein+purification+and+site-specific+bioconjugation+into+a+single+step%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step.</a> Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).</li>
<li>Zhang, W. -B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+macromolecular+topology+with+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).</li>
</ol>

No hay intereses financieros en competencia que declarar por ninguno de los autores.

Este estudio demuestra un enfoque inspirado en la nanotecnología del ADN para controlar la actividad de la ARN polimerasa T7 mediante el acoplamiento covalente de un RNAP T7 recombinante marcado con SNAP N-terminal con un oligonucleótido funcionalizado de BG, que posteriormente se utilizó para programar reacciones TMDSD. Por diseño, la etiqueta SNAP se colocó en el extremo N de la polimerasa, ya que el extremo C del ARNP T7 de tipo salvaje está enterrado dentro del núcleo de la estructura de la proteína y hace contactos ...

La computación del ADN utiliza un conjunto de oligonucleótidos diseñados como medio para el cálculo. Estos oligonucleótidos están programados con secuencias para ensamblarse dinámicamente de acuerdo con la lógica especificada por el usuario y responder a entradas específicas de ácido nucleico. En los estudios de prueba de concepto, la salida del cálculo generalmente consiste en un conjunto de oligonucleótidos marcados fluorescentemente que se pueden detectar a través de electroforesis en gel o lectores de placas de fluorescencia. En los últimos 30 años, se han demostrado circuitos computacionales de ADN cada vez más complejos, como varias cascadas de lógica digital, redes de reacción química y redes neuronales1,2,3. Para ayudar con la preparación de estos circuitos de ADN, se han utilizado modelos matemáticos para predecir la funcionalidad de los circuitos genéticos sintéticos4,5,y se han desarrollado herramientas computacionales para el diseño de secuencias de ADN ortogonales6,7,8,9,10 . En comparación con las computadoras basadas en silicio, las ventajas de las computadoras de ADN incluyen su capacidad para interactuar directamente con biomoléculas, operar en solución en ausencia de una fuente de alimentación, así como su compacidad y estabilidad generales. Con el advenimiento de la secuenciación de próxima generación, el costo de sintetizar computadoras de ADN ha estado disminuyendo durante las últimas dos décadas a un ritmo más rápido que la Ley11de Moore. Las aplicaciones de tales computadoras basadas en ADN ahora están comenzando a surgir, como para el diagnóstico de enfermedades12,13, para alimentar la biofísica molecular14y como plataformas de almacenamiento de datos15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> Figura 1: Mecanismo de desplazamiento de la cadena de ADN mediada por el dedo del pie. El punto de apoyo, δ, es una secuencia libre y sin encuadernar en un dúplex parcial. Cuando se introduce un dominio complementario (δ*) en una segunda hebra, el dominio de δ libre sirve como punto de apoyo para la hibridación, permitiendo que el resto de la hebra (ɑ*) desplace lentamente a su competidor a través de una reacción reversible de compresión / descompresión conocida como migración de hebras. A medida que aumenta la duración de δ, el ΔG para la reacción hacia adelante disminuye y el desplazamiento ocurre más fácilmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Hasta la fecha, la mayoría de las computadoras de ADN utilizan un motivo bien establecido en el campo de la nanotecnología dinámica del ADN conocido como desplazamiento de cadenas de ADN mediadas por dedo del pie (TMDSD, Figura 1)16. Este motivo consiste en un dúplex de ADN parcialmente de doble cadena (dsDNA) que muestra voladizos cortos de "puntera" (es decir, de 7 a 10 nucleótidos (nt)). Las hebras de "entrada" de ácido nucleico pueden interactuar con los dúplex parciales a través del punto de apoyo. Esto conduce al desplazamiento de una de las hebras del dúplex parcial, y esta hebra liberada puede servir como entrada para los dúplex parciales aguas abajo. Por lo tanto, TMDSD permite la señal en cascada y el procesamiento de información. En principio, los motivos ortogonales TMDSD pueden operar de forma independiente en solución, lo que permite el procesamiento paralelo de la información. Ha habido una serie de variaciones en la reacción de TMDSD, como el intercambio de hebras de ADN mediado por el punto de apoyo (TMDSE)17,los puntos de apoyo "sin fugas" con dominios de doble longitud18,los puntos de apoyo no coincidentes con la secuencia19y el desplazamiento de la hebra mediado por el "asidero"20. Estos principios de diseño innovadores permiten una energía y dinámica TMDSD más ajustadas para mejorar el rendimiento de la computación de ADN.
Los circuitos genéticos sintéticos, como los circuitos de genes transcripcionales, también son capaces de calcular21,22,23. Estos circuitos están regulados por factores de transcripción de proteínas, que activan o reprimen la transcripción de un gen uniéndose a elementos reguladores específicos del ADN. En comparación con los circuitos basados en ADN, los circuitos transcripcionales tienen varias ventajas. En primer lugar, la transcripción enzimática tiene una tasa de rotación mucho mayor que los circuitos de ADN catalítico existentes, generando así más copias de salida por copia única de entrada y proporcionando un medio más eficiente de amplificación de la señal. Además, los circuitos transcripcionales pueden producir diferentes moléculas funcionales, como aptámeros o ARN mensajero (ARNm) que codifican para proteínas terapéuticas, como resultados de cálculo, que pueden explotarse para diferentes aplicaciones. Sin embargo, una limitación importante de los circuitos transcripcionales actuales es su falta de escalabilidad. Esto se debe a que hay un conjunto muy limitado de factores de transcripción ortogonales basados en proteínas, y el diseño de novo de nuevos factores de transcripción de proteínas sigue siendo técnicamente desafiante y requiere mucho tiempo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> Figura 2: Abstracción y mecanismo del complejo polimerasa "tether" y "cage". (A y B) Una correa de oligonucleótidos se marca enzimáticamente a una polimerasa T7 a través de la reacción SNAP-tag. Una jaula que consiste en un promotor T7 "falso" con un voladizo de complemento de amarre le permite hibridarse con la correa y bloquear la actividad transcripcional. (C) Cuando el operador (a*b*) está presente, se une al punto de apoyo de la correa del oligonucleótido (ab) y desplaza la región b* de la jaula, permitiendo que se produzca la transcripción. Esta figura ha sido modificada de Chou y Shih27. Abreviaturas: RNAP = ARN polimerasa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Este artículo presenta un nuevo bloque de construcción para la computación molecular que combina las funcionalidades de los circuitos transcripcionales con la escalabilidad de los circuitos basados en ADN. Este bloque de construcción es un RNAP T7 unido covalentemente con una correa de ADN de cadena simple(Figura 2A). Para sintetizar este ARNP T7 atado al ADN, la polimerasa se fusionó con un SNAP-tag24 N-terminal y se expresó recombinantemente en Escherichia coli. La etiqueta SNAP se reaccionó con un oligonucleótido funcionalizado con el sustrato BG. La correa de oligonucleótidos permite el posicionamiento de los huéspedes moleculares en estrecha proximidad a la polimerasa a través de la hibridación del ADN. Uno de esos invitados fue un bloqueador transcripcional competitivo conocido como "jaula", que consiste en un dúplex de ADN promotor T7 "falso" sin gen aguasabajo (Figura 2B). Cuando se une al RNAP a través de su correa de oligonucleótidos, la jaula detiene la actividad de la polimerasa al superar a otras plantillas de ADN para la unión al RNAP, lo que hace que el RNAP esté en un estado "OFF"(Figura 2C).
Para activar la polimerasa a un estado "ON", se diseñaron plantillas de ADN T7 con dominios "operador" monocatenarios aguas arriba del promotor T7 del gen. El dominio operador (es decir, dominio a*b* Figura 2C)puede diseñarse para desplazar la jaula del RNAP a través de TMDSD y posicionar el RNAP proximal al promotor T7 del gen, iniciando así la transcripción. Alternativamente, también se diseñaron plantillas de ADN donde la secuencia del operador era complementaria a las hebras auxiliares de ácido nucleico que se conocen como "factores de transcripción artificiales" (es decir, hebras TFA y TFB en la Figura 3A). Cuando ambas hebras se introducen en la reacción, se ensamblarán en el sitio del operador, creando un nuevo dominio pseudo-contiguo a*b*. Este dominio puede desplazar la jaula a través de TMDSD para iniciar la transcripción(Figura 3B). Estas hebras pueden ser suministradas exógenamente o producidas.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> Figura 3: Programación selectiva de la actividad de la polimerasa a través de un activador de interruptor de tres componentes. (A) Cuando los factores de transcripción (TFA y TFB)están presentes, se unen al dominio del operador aguas arriba del promotor, formando una secuencia pseudo de cadena simple (a*b*) capaz de desplazar la jaula a través del desplazamiento del ADN mediado por el punto de apoyo. (B) Este dominio a*b* puede desplazar la jaula a través de TMDSD para iniciar la transcripción. Esta figura ha sido modificada de Chou y Shih27. Abreviaturas: TF = factor de transcripción; RNAP = ARN polimerasa; TMDSD = desplazamiento de la cadena de ADN mediada por el dedo del pie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El uso de factores de transcripción basados en ácidos nucleicos para la regulación transcripcional in vitro permite la implementación escalable de comportamientos de circuitos sofisticados como la lógica digital, la retroalimentación y la señal en cascada. Por ejemplo, se pueden construir cascadas de puertas lógicas diseñando secuencias de ácidos nucleicos de tal manera que las transcripciones de un gen aguas arriba activen un gen aguas abajo. Una aplicación que explota la cascada y la multiplexación que esta tecnología propuesta hace capaces es el desarrollo de circuitos de computación molecular más sofisticados para diagnósticos portátiles y procesamiento de datos moleculares. Además, la integración de la computación molecular y las capacidades de síntesis de ARN de novo puede permitir nuevas aplicaciones. Por ejemplo, se puede diseñar un circuito molecular para detectar uno o una combinación de ARN definidos por el usuario como ARN terapéuticos de entrada y salida o ARNm que codifican péptidos o proteínas funcionales para aplicaciones médicas en el punto de atención.

<table><tbody><tr><td>0,5% polisorbato 20 (TWEEN 20)</td><td>BioShop</td><td>TWN510.5</td><td></td></tr><tr><td>0.5M ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Bio Basic</td><td>SD8135</td><td></td></tr><tr><td>10 mM tampón de fosfato de sodio (pH 7)</td><td>Bio Basic</td><td>PD0435</td><td>Tabletas utilizadas para hacer tampón de 10 mM</td></tr><tr><td>persulfato de amonio al 10% (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa Amicon Ultra-15 Centrífuga Unidad de filtro</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>100% acetona</td><td>Fisher Chemical</td><td>A18P4</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol (EtOH)</td><td>Marca de la casa</td><td>39752-P016-EAAN</td><td></td></tr><tr><td>10x tampón de transcripción in vitro (IVT)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampón Tris-Borato-EDTA (TBE)</td><td>Bio Basic</td><td>A0026</td><td></td></tr><tr><td>1M Isopropil &beta;- d-1-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5502-1G</td><td></td></tr><tr><td>1M tampón de bicarbonato sódico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>648311-1KG</td><td></td></tr><tr><td>1X Tampón Tris-EDTA (TE)</td><td>ThermoFisher</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>2M imidazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56750-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol (BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>3M acetato de sodio</td><td>Bio Basic</td><td>SRB1611</td><td></td></tr><tr><td>40% acrilamida (19:1)</td><td>Bio Basic</td><td>A00062</td><td></td></tr><tr><td>4x tampón de carga de muestras de proteínas LDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>5M cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Bio Basic</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>5mM ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>6x colorante de carga de gel</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>agarosa B polvo</td><td>Bio Basic</td><td>AB0014</td><td></td></tr><tr><td>BG-GLA-NHS</td><td>New England Biolabs</td><td>S9151S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 competente E. coli</td><td>Addgene</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>BLUeye escalera de proteínas preteñida</td><td>FroggaBio</td><td>PM007-0500</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol</td><td>Bio Basic</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>azul de coomassie (SimplyBlue SafeStain)</td><td>ThermoFisher</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>colorante de cianina (tinción de gel de ácido nucleico SYBR Gold)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>colorante de cianina (SYBR Safe tinción de gel de ácido nucleico SYBR)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido seco (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>formamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Bio Basic</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de kanamicina</td><td>BioShop</td><td>KAN201.5</td><td></td></tr><tr><td>caldo de lisogénia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2542-500ML</td><td></td></tr><tr><td>malaquita oxalato verde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2437-29-8</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N'N'-Tetrametiletano-1,2-diamina (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS tampón de funcionamiento (20x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>LSNP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12 pocillos</td><td>Life Technologies</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>oligonucleótido (antisentido de jaula)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td></tr><tr><td>oligonucleótido ( sentido de la jaula)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTCTCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA</td></tr><tr><td>oligonucleótido (antisentido del aptámero verde de malaquita)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GGATCCATTCGTTACCTGGCTCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT</td></tr><tr><td>oligonucleótido (sentido del aptámero verde de malaquita)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC</td></tr><tr><td>oligonucleótido (Factor de Transcripción A)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td></tr><tr><td>oligonucleótido (Factor de Transcripción B)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTCTCTGGCGATAA </td></tr><tr><td>Oligonucleótido TGGAACTG con 3' Modificación de aminas (tether)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/</td></tr><tr><td>Pierce columnas de espín de intercambio iónico fuerte</td><td>Fisher Scientific</td><td>90008</td><td></td></tr><tr><td>plásmido que codifica genes de resistencia a SNAP T7 RNAP y kanamicina</td><td>Genscript</td><td>N/A</td> columna de purificación de proteínas de <td>inserción de genes personalizados</td></tr><tr><td>(columna de espín HisPur Ni-NTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>88226</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla rNTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roche mini columna de centrifugado rápido de ADN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de ADN de rango ultra bajo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td> 10597012 <td></td></tr><tr><td>urea</td><td>BioShop</td><td>URE001.1</td><td></td></tr></tbody></table>

arn polimerasa atado al adn para transcripción in vitro programable y computación molecular

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

La nanotecnología del ADN permite el autoensamblaje programable de ácidos nucleicos en formas y dinámicas prescritas por el usuario para diversas aplicaciones. Este trabajo demuestra que los conceptos de la nanotecnología del ADN se pueden utilizar para programar la actividad enzimática de la ARN polimerasa T7 derivada de fagos (RNAP) y construir redes reguladoras de genes sintéticos escalables. En primer lugar, un RNAP T7 atado a oligonucleótidos se diseña a través de la expresión de un RNAP marcado con SNAP N-terminal y el posterior acoplamiento químico de la etiqueta SNAP con un oligonucleótido modificado con bencilguanina (BG). A continuación, el desplazamiento de la hebra de ácido nucleico se utiliza para programar la transcripción de la polimerasa bajo demanda. Además, los conjuntos auxiliares de ácidos nucleicos se pueden utilizar como "factores de transcripción artificiales" para regular las interacciones entre el RNAP T7 programado por ADN con sus plantillas de ADN. Este mecanismo regulador de la transcripción in vitro puede implementar una variedad de comportamientos de circuitos como la lógica digital, la retroalimentación, la cascada y la multiplexación. La componibilidad de esta arquitectura reguladora de genes facilita la abstracción, estandarización y escalado del diseño. Estas características permitirán la creación rápida de prototipos de dispositivos genéticos in vitro para aplicaciones como la biodetección, la detección de enfermedades y el almacenamiento de datos.

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> Figura 5:Análisis SDS-PAGE de la expresión de SNAP T7 RNAP y ensayo de transcripción in vitro. (A) Análisis de purificación de proteínas SNAP T7 RNAP, snap T7 RNAP peso molecular: 119.4kDa. FT = flujo a través de la columna, W1 = fracciones de elución del tampón de lavado que contiene impurezas, E1-3 = fracciones de elución que contienen prod...

Describimos la ingeniería de una nueva ARN polimerasa T7 atada al ADN para regular las reacciones de transcripción in vitro. Discutimos los pasos para la síntesis y caracterización de proteínas, validamos la regulación transcripcional de prueba de concepto y discutimos sus aplicaciones en computación molecular, diagnóstico y procesamiento de información molecular.

ARN polimerasa atado al ADN para transcripción in vitro programable y computación molecular

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Proponemos un método para regular la actividad de la polimerasa utilizando factores artificiales de transcripción de ácidos nucleicos. Esta arquitectura reguladora de genes puede servir como un bloque de construcción para futuros dispositivos genéticos in vitro. Al unir un dominio de unión al ADN a una ARN polimerasa T7, esta técnica combina la escalabilidad de los circuitos basados en el ADN, con la funcionalidad de los circuitos transcripcionales.Comience por hacer nueve diluciones de oligonucleótido BG monocatenario a un volumen final de 50 microlitros de agua destilada doble, de cinco a una a una a cinco proporciones, como se indica en la tabla. Prepare una mezcla de reacción para cada dilución mezclando dos microlitros de tampón SNAP con cuatro microlitros de oligonucleótido BG y cuatro microlitros de SNAP T7 RNAP. Prepare el control de RNAP reemplazando el oligonucleótido con agua destilada doble, y el control de ADN reemplazando el SNAP T7 RNAP con agua destilada doble.Configure 11 reacciones agregando dos microlitros de cada muestra a cuatro microlitros de tampón SNAP y dos microlitros de colorante de carga de proteínas por muestra. Calentar las reacciones durante 10 minuto

dna-tethered-rna-polymerase-for-programmable-vitro-transcription

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este trabajo muestra cómo se forma un híbrido ADN / ARN a nivel cromosómico y revelar la transferencia de información genética de ARN a ADN genómico en células de levadura.

Generación de ADN / ARN híbridos en el ADN genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de ARN que contiene

CRISPR / Cas sistemas median la inmunidad adaptativa en bacterias y arqueas. Muchas proteínas CAS se propone actuar como endoribonucleases que actúan sobre los precursores crRNA de longitud variable. Aquí se ilustran tres enfoques diferentes para generar pre-crRNA sustratos para el análisis bioquímico de la actividad endonucleasa de Cas.

Sustrato Generación para endonucleasas de CRISPR / Cas Sistemas

Nucleasas de diseñadores como nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y transcripción nucleasas efectoras del tipo activador (Talens) se pueden utilizar para modificar el genoma de preimplantación de embriones de ratones mediante la activación de ambos al final no homóloga (NHEJ) y recombinación homóloga (HR) itinerarios. Estos avances permiten la rápida generación de ratones con modificaciones genéticas precisas.

Del genoma del ratón Ingeniería Utilizando Nucleasas Designer

Las pinzas ópticas se han utilizado para estudiar el plegamiento del ARN estirando moléculas individuales desde sus extremos 5' y 3'. Aquí se describen los procedimientos comunes para sintetizar moléculas de ARN para pinzas, la calibración del instrumento y los métodos para manipular moléculas individuales.

Nanomanipulación de Soltero moléculas de ARN por Pinzas Ópticas

Este protocolo describe un método para derivar puertas de desplazamiento de cadenas de ADN a partir de plásmidos y probarlas utilizando mediciones de cinética de fluorescencia. Las puertas se pueden componer modularmente en sistemas de múltiples componentes para aproximar el comportamiento de las redes formales de reacción química (CRN), lo que demuestra un nuevo uso para las CRN como lenguaje de programación molecular.

Plásmido derivado de ADN Strand Displacement Puertas de Redes de reacción de Ejecución Química

En este manuscrito, describimos un protocolo para examinar funcionalmente la transcripción y la actividad inhibitoria de agentes antibacterianos dirigidos a la transcripción bacteriana.

Los ensayos in vitro de transcripción y su aplicación en el descubrimiento de medicamentos

Aquí, describimos el conjunto de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II (Pol II) que requieren sólo ADN sintético corto y oligonucleótidos de ARN y Pol II purificado. Estos complejos son útiles para estudiar los mecanismos subyacentes al procesamiento co-transcripcional de transcripciones asociadas con el complejo de elongación Pol II.

Complejos de alargamiento de ARN polimerasa artificial II para disecar eventos de procesamiento de ARN co-transcripcional

La interferencia de ARN es una técnica ampliamente aplicable y poderosa para manipular la expresión génica en etapas específicas del desarrollo. Aquí, describimos los pasos necesarios para implementar esta técnica en el escarabajo de buceo acuático Thermonectus marmoratus,desde la adquisición de secuencias genéticas hasta el derribo de genes que afectan la estructura o el comportamiento.

Interferencia de ARN en los escarabajos acuáticos como una poderosa herramienta para manipular la expresión génica en puntos de tiempo de desarrollo específicos

Presentamos un protocolo para medir la dinámica de micro a milisegundos en 13C/15N-etiquetado y no etiquetado ARN con 1H R1ρ  dispersión de dispersión de relajación espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). El enfoque de este protocolo radica en la preparación de muestras de alta pureza y la configuración de experimentos de RMN.

Aspectos prácticos de la preparación de muestras y la configuración de 1H R1ρ Experimentos de dispersión de relajación de ARN

Las partes genéticas bien caracterizadas son necesarias para el diseño de nuevos circuitos genéticos. Aquí describimos un método rentable y de alto rendimiento para caracterizar rápidamente las partes genéticas. Nuestro método reduce el costo y el tiempo al combinar lisados libres de células, ADN lineal para evitar la clonación y manejo acústico de líquidos para aumentar el rendimiento y reducir los volúmenes de reacción.

Caracterización rápida de partes genéticas con sistemas libres de células

Presentamos un protocolo para la preparación de condensados biomoleculares sintéticos consistentes en nanoestrellas de ADN anfifílico a partir de sus oligonucleótidos de ADN constituyentes. Los condensados se producen a partir de un solo componente de nanoestrella o de dos componentes y se modifican para mantener la transcripción in vitro de ARN a partir de una plantilla de ADN incrustada.

Condensados sintéticos y arquitecturas similares a células a partir de nanoestructuras de ADN anfifílico

Aprende a regular la actividad de la ARN polimerasa T7 mediante factores de transcripción de ácidos nucleicos artificiales. Este método combina la escalabilidad de los circuitos de ADN con la regulación transcripcional para dispositivos genéticos in vitro.

ARN polimerasa atado al ADN para transcripción in vitro programable y computación molecular

Explorar más videos