La preparación de embriones de pollo ex ovo y vasos de membrana corioalantoicos como modelo in vivo para imágenes de ultrasonido con contraste y estudios de administración de fármacos mediados por microburbujas

Este protocolo describe la preparación y el uso de embriones de pollo entre el día cinco y ocho de incubación para imágenes de ultrasonido con contraste y estudios de administración de fármacos mediados por microburbujas. Los tres métodos para extraer el contenido de la cáscara del huevo en el día cinco al octavo permiten su desarrollo dentro de la cáscara y solo requieren herramientas básicas de laboratorio. Este modelo es adecuado para investigar diferentes aspectos de la investigación de ultrasonido y vascular, como imágenes de flujo sanguíneo, administración de medicamentos y nuevos agentes de contraste y transductores de ultrasonido. Para preparar un embrión de cinco días de edad, coloque un huevo fertilizado incubado de cinco días en un soporte de huevos precalentado con el huevo en la misma orientación que dentro de la incubadora y use el extremo posterior puntiagudo de una punta de pinza para hacer una pequeña hendidura en la parte superior del huevo.

Use las pinzas para hacer una segunda hendidura en el lado del huevo aproximadamente 2/3 de la longitud del huevo y use un par de pinzas más grandes para quitar un pequeño trozo de cáscara de huevo del área dentada en la parte superior del huevo, teniendo cuidado de que el saco de aire haga contacto con el aire ambiente sin penetrar demasiado profundamente en la cáscara. Usando una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 19, penetre la carcasa a través de la segunda hendidura con la aguja apuntando hacia abajo y extraiga aproximadamente dos mililitros de albúmina. Cuando se haya recolectado la albúmina, use cinta adhesiva para sellar la punción y dispensar la albúmina en un bote de pesaje.

Use las pinzas grandes para agrandar la pequeña abertura en la parte superior del huevo hasta que el embrión y la membrana corioalantoidea sean completamente visibles sin quitar la cáscara debajo de la membrana corioalantoidea o penetrar la membrana interna. Cuando se haya creado una abertura suficiente, gire el huevo 180 grados dentro del soporte para que la abertura en la parte superior del huevo ahora esté orientada hacia la parte inferior. Después de uno o dos minutos, el embrión flotará hacia arriba, volviéndose invisible desde el fondo.

Cuando todo el embrión y la membrana corioalantoidea hayan desaparecido de la vista y solo la yema sea visible, retire la cinta de la abertura lateral. El interior del huevo debe sobresalir de la abertura. Mientras sostiene el fondo del huevo cerca del bote de pesaje en el soporte metálico del bote de pesaje, use las puntas afiladas de las pinzas pequeñas para hacer un rasguño horizontal suave pero rápidamente en la membrana en todo el ancho de la abertura y deje caer suavemente el contenido del huevo en el bote de pesaje.

Compruebe si el latido del corazón todavía está presente para confirmar que el embrión todavía está vivo, los vasos de la membrana corioalantoidea están intactos y no hay fuga de sangre o yema. Coloque el embrión viable a 37 grados centígrados con la administración regular de gotas de 30 microlitros de PBS de 37 grados centígrados al embrión y la membrana corioalantoidea. Para cosechar un embrión de seis a siete días de edad y una membrana corioalantoidea, prepare el huevo como se demostró para un embrión de cinco días y use una nueva jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 19 para penetrar la cáscara a través de la segunda hendidura con la aguja apuntando hacia abajo para extraer de cinco a seis mililitros de albúmina en una sola penetración.

Cuando se haya recolectado la albúmina, inserte la aguja de una jeringa de 10 mililitros que contenga aproximadamente un mililitro de PBS de 37 grados Celsius, más que el volumen retirado, en el costado de la cubierta con la aguja apuntando hacia abajo para reemplazar la albúmina cosechada. Luego, vuelva a sellar rápidamente el espacio con un trozo de cinta adhesiva y termine de procesar el huevo como se demuestra. Para cosechar el embrión y la membrana corioalantoidea de un óvulo fertilizado de ocho días de edad, sostenga el huevo horizontalmente, use el extremo posterior de un par de pinzas grandes y haga una pequeña hendidura aproximadamente a la mitad de la longitud del huevo.

Haga pequeñas hendiduras en un patrón de anillo de 360 grados alrededor del espacio de la cáscara del huevo aproximadamente a 10 milímetros de distancia. Cuando se hayan creado todas las hendiduras, use el extremo puntiagudo de las pinzas para romper la cáscara entre dos de las hendiduras y sumerja completamente el huevo en PBS de 37 grados centígrados durante cinco minutos. Al final de la incubación, mueva el huevo sobre un bote de pesaje en el PBS y coloque ambos pulgares en el orificio grande para abrir suavemente el huevo, que debe agrietarse a lo largo de las pequeñas hendiduras.

Cuando la grieta se haya formado alrededor de la cáscara del huevo, separe suavemente los dos lados, mientras mueve suavemente las piezas hacia adelante y hacia atrás hasta que el contenido del huevo se separe de la cáscara y deje caer el contenido en el bote de pesaje. Levante lentamente el bote de pesaje que contiene el contenido de huevo del PBS, inclinando ligeramente el camino del bote para eliminar cualquier exceso de PBS. Luego, coloque el bote de pesaje en un soporte de bote de pesaje de metal.

En esta etapa, se puede ver un corazón latiendo en el embrión. Para preparar una muestra de embrión y membrana corioalantoidea para imágenes de microscopía, coloque un soporte con una membrana acústica con agarosa en el fondo de una placa de Petri de una camada que contenga aproximadamente 500 mililitros de PBS de 37 grados centígrados con la capa de agarosa hacia arriba. Use tijeras pequeñas para cortar rápidamente la membrana vitela en seis a siete cortes alrededor de toda la membrana corioalantoidea mientras gira el bote de pesaje para una mejor precisión y velocidad.

Use una cucharada para recoger la membrana recortada que contiene el embrión y la membrana corioalantoidea y levante lentamente la cuchara para permitir la inspección visual de si la membrana recortada que contiene el embrión y la membrana corioalantoidea todavía está unida al resto de la membrana del saco vitelino. Incline ligeramente la cuchara para eliminar la mayor cantidad de yema posible sin secar el tejido y sumerja la membrana recortada en el PBS en la placa de Petri de un litro. Con pinzas pequeñas, agarre y gire suavemente un borde de la membrana para eliminar cualquier yema que aún esté unida antes de mover la membrana sobre el soporte con la membrana acústica.

Use un alfiler de muestra de insecto para asegurar la membrana a las esquinas opuestas del soporte y evite perforar los vasos de la membrana corioalantoidea. Cuando ambas esquinas hayan sido aseguradas, levante e incline ligeramente el soporte para desechar la mayor parte del PBS y use las pinzas pequeñas para estirar y distribuir uniformemente la membrana sobre el soporte para permitir que el resto de la membrana se fije plana al soporte. Cuando el embrión haya sido asegurado, coloque el soporte en una configuración de microscopía a 37 grados centígrados y coloque una membrana acústica y ópticamente transparente sobre la región de interés en la muestra para permitir la visualización óptica de los vasos.

En este análisis representativo, se extirparon embriones de cinco, seis, siete y ocho días de edad y membranas corioalantoideas como se demostró. No se puede observar sangrado o daño a los embriones o membranas corioalantoideas, lo que indica que estos métodos se pueden utilizar para cosechar de forma segura el contenido del huevo sin dañar el embrión o los vasos de la membrana corioalantoidea. Múltiples complicaciones pueden ocurrir durante la extracción, por lo que es importante seguir el protocolo cuidadosamente y descartar cualquier muestra de tejido dañado.

Como se ha demostrado, el embrión puede ser inyectado, por ejemplo, con agentes de contraste de ultrasonido como microburbujas. En el momento del parto, se pueden observar las micro burbujas circulando dentro de la luz del vaso sanguíneo inyectado y circulando dentro de la sangre periférica durante varias horas. Antes de la inyección de microburbujas, el contraste ya se puede observar dentro del corazón embrionario por el modo B, pero no por imágenes subarmónicas de ultrasonido de alta frecuencia.

La adición de microburbujas aumenta el contraste y la visibilidad del embrión en ambos tipos de imágenes. También se pueden obtener imágenes subarmónicas 3D de alta frecuencia después de la inyección de agente de contraste para visualizar las redes de vasos dentro del embrión y la membrana corioalantoidea. El embrión de pollo y los vasos de membrana corioalantoidea también se pueden usar para investigar la administración de fármacos mediada por ultrasonido.

Al intentar este procedimiento, es muy importante mantener siempre el embrión y la CAM a 37 grados centígrados y no dejar que se seque. Después de este procedimiento, el embrión de pollo se puede colocar en diferentes configuraciones, como un tanque de agua o un microscopio para realizar imágenes de ultrasonido con contraste o estudios de administración de medicamentos mediados por microburbujas. Este método y preparación es adecuado para estudios de agentes de contraste de ultrasonido y también se puede utilizar para la investigación del cáncer y el virus.