Evaluación Funcional De La Permeabilidad Intestinal Y La Migración Transepitelial Neutrófilo En Ratones Usando Un Modelo De Bucle Intestinal Estandarizado

El modelo intestinal es una forma ampliamente adaptable y fisiológica de medir qué tan permeable es el intestino y cómo los leucocitos migran en el intestino en ratones, in vivo. Este método ayuda a comprender mejor los mecanismos subyacentes al aumento de la permeabilidad intestinal y la inflamación intestinal patológica. La técnica se puede emplear para ayudar en nuestros mecanismos de comprensión que son la base de la función de la barrera de la tripa, y la inflamación patológica, según lo considerado en colitis ulcerosa y Crohn' enfermedad de s.

Este modelo emplea un segmento bien vascularizado, exteriorizado del intestino, del íleon o de los dos puntos próximos, para la examinación de la función intestinal de la barrera o del reclutamiento inmune de la célula en ratón. Con esta amplia aplicación, el modelo de asa intestinal puede proporcionar información sobre las enfermedades resultantes de una barrera intestinal permeable, así como la respuesta inflamatoria. Las luchas se pueden superar practicando los pasos quirúrgicos.

Es críticamente importante exteriorizar un segmento intestinal completamente vascularizado y seleccionar las localizaciones apropiadas para que las ligaduras eviten la sangría. El modelo intestinal del asa es una técnica microsurgical, así, como con otros procedimientos quirúrgicos, se beneficia grandemente de la demostración visual y de una presentación paso a paso del método. Después de lograr un plano quirúrgico de anestesia, comience por fregar el pelaje de la línea media abdominal con hisopos de alcohol o una esponja de gasa empapada con etanol al 70%.

No moje una amplia área de piel con alcohol para prevenir la hipotermia. Usando tijeras, realice una laparotomía de la línea media. Haga una incisión horizontal en el centro del abdomen y exponga el peritoneo, teniendo cuidado de no lesionar los órganos intraabdominales.

Coloque una gasa de algodón húmeda precortado sobre la cavidad intraabdominal expuesta. Use hisopos de algodón húmedos para movilizar y exteriorizar el ciego y colóquelo cuidadosamente en una gasa de algodón húmeda. Luego, movilice y exteriorice suavemente el íleon.

Despliegue al menos seis centímetros de íleon terminal en la gasa de algodón húmeda sin interrumpir los vasos mesentéricos y el suministro de sangre. Mantenga los tejidos expuestos húmedos en todo momento con HBSS caliente. Identifique la arteria principal que suministra el íleon en el mesenterio, cerca del ciego.

Luego, localice dos sitios de ligadura en el mesenterio que estén libres de vasos sanguíneos críticos. Agarre firmemente el íleon terminal con fórceps de tejido romo y use fórceps de punta fina para fenestrar el mesenterio, evitando los vasos sanguíneos. Coloque la sutura de seda a través de la perforación y ate un nudo quirúrgico para crear la primera ligadura.

Utilice la regla para medir cuatro centímetros de distancia de la primera ligadura y crear la segunda ligadura. Corte cuidadosamente junto a cada ligadura con tijeras finas para aislar el asa iléica de cuatro centímetros, manteniendo intacto el suministro de sangre y la membrana mesentérica. Enjuague suavemente el contenido del segmento del asa ilérea con HBSS caliente usando un tubo de alimentación amarillo flexible unido a una jeringuilla del 10 mililitros.

Asegúrese de eliminar el contenido luminal de la cavidad abdominal para mantener limpio el sitio quirúrgico. Ligar los dos extremos cortados del lazo iléleo enrojecido con sutura de seda. Use una jeringa de un mililitro con una aguja calibre 30 para inyectar lentamente 250 microlitros de reactivo, como FITC-dextrans o quimioquina, en la luz intestinal.

El asa ilél se inflará, causando una distensión moderada de la mucosa. Cierre la pared abdominal con un porta agujas, espérceps anatómicos y 3.0 suturas de seda no absorbibles con una aguja de corte inverso. Después de secar el animal para prevenir la hipotermia, colóquelo en una cámara de anestesia regulada por temperatura durante el período de incubación.

Prepare el ratón para la cirugía y exteriorice el ciego como se ha demostrado anteriormente. Usando hisopos de algodón húmedos, exteriorice todo el íleon y colócelo encima de una gasa de algodón húmeda. Identificar el colon proximal y el suministro de sangre localizado en el mesocolon.

Movilizar el colon proximal y crear la primera ligadura en un área libre de vasos en el mesocolon a unos 0,5 centímetros distales del ciego. Mida dos centímetros de la primera ligadura y cree una segunda ligadura en un área libre de suministro de sangre en el mesocolon. Usando tijeras finas, corte cuidadosamente al lado de cada ligadura para aislar un pcLoop de dos centímetros de largo.

Enjuague suavemente el pcLoop con HBSS caliente para eliminar las heces usando una sonda de alimentación amarilla flexible conectada a una jeringa de 10 mililitros. Asegúrese de eliminar el contenido luminal de la cavidad abdominal para mantener limpio el sitio quirúrgico. Luego, ligar los dos extremos de corte del pcLoop enrojecido usando sutura de seda.

Use una jeringa de un mililitro con una aguja calibre 30 para inyectar lentamente 200 microlitros de reactivo, como FITC-dextrano o quimioquina, en la luz intestinal. El pcLoop se inflará, causando una distensión moderada de la mucosa. Use hisopos de algodón húmedos para volver a colocar suavemente el pcLoop, el íleon y el ciego ligados.

Cierre la pared abdominal con un porta agujas, espérceps anatómicos y 3.0 suturas de seda no absorbibles con una aguja de corte inverso. Después del período de incubación, eutanasiar el ratón anestesiado y recoger los tejidos para el análisis. Con el fin de verificar la precisión del modelo de bucle I para la evaluación de la permeabilidad intestinal, se realizó un ensayo FITC-dextran pcLoop para evaluar el papel de la proteína asociada a unión estrecha Jam-a en la regulación de la función de barrera intestinal in vivo.

Con el modelo del pcLoop, un aumento del doblez 2,5 en niveles del suero del FITC-dextrano fue cuantificado en los ratones nulos del Atasco-a comparados a los controles. Los resultados similares fueron obtenidos con los ratones que abrigaban la pérdida selectiva de Atasco-a en las células epiteliales intestinales. El modelo del pcLoop fue utilizado para estudiar el neutrófilo polimorfonuclear, o PMN, el reclutamiento en la mucosa intestinal y la migración transepithelial subsecuente in vivo.

El número de PMN en el contenido luminal del pcLoop fue cuantificado por análisis cytometry de flujo. El número de PMN presente en el segmento de los dos puntos próximos era bajo condiciones fisiológicas. El tratamiento previo con cytokines favorable-inflamatorios, la alfa de TNF y la gamma de IFN, antes de cirugía, dio lugar a números aumentados de PMN reclutados en el lumen del pcLoop.

La administración del atrayente LTB4 del chemo de PMN llevó a un aumento dramático en cuentas de PMN. La coloración de Immunohistochemical de PMN en la mucosa colónica corrobora el reclutamiento elevado de PMN después del estímulo con cytokines y LTB4. La contribución de Jam-a la migración transepitelial pmn se estudió utilizando el modelo pcLoop en ratones que albergan la pérdida selectiva de Jam-a en las células epiteliales intestinales.

La pérdida de atasco-a epitelial llevó a un número reducido de PMN transmigrated en el lumen colónico comparado a los controles del littermate. Un aspecto crítico para esta técnica es recordar preservar el suministro de sangre al segmento intestinal exteriorizado al realizar la cirugía. Siguiendo este protocolo, otros métodos tales como un análisis intestinal de la permeabilidad y un análisis transepithelial de la migración del neutrófilo se pueden realizar para investigar la pérdida de integridad de barrera y de inflamación intestinal in vivo.