Name: Visualización De Las Adaptaciones Celulares Pulmonares Durante La Lesión Pulmonar Aguda Murina Inducida Por Ozono Combinado Y LPS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Aprende a visualizar adaptaciones celulares pulmonares durante lesión aguda inducida por ozono y LPS en ratones. Este método permite estudiar muerte celular, respuesta inmune y mecanismos de reparación tisular.

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La investigación realizada está financiada por la subvención del Presidente NSERC, así como con fondos 19 del Centro Canadiense para la Innovación Nuclear Sylvia Fedoruk. El Centro Canadiense de Innovación Nuclear Sylvia Fedoruk está financiado por Innovation Saskatchewan. Las imágenes de fluorescencia se realizaron en el Centro de Imágenes WCVM, que es financiado por NSERC. Jessica Brocos (estudiante de maestría) y Manpreet Kaur (estudiante de maestría) fueron financiadas por los fondos de puesta en marcha del Centro Canadiense de Innovación Nuclear Sylvia Fedoruk.

<ol><li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).</li>
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<li>Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+inhibits+acute+lung+injury+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).</li>
<li>Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+9+partially+regulates+lung+inflammation+induced+following+exposure+to+chicken+barn+air%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+Medicine+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+mediates+the+late+phase+of+neutrophil+recruitment+to+the+lung+in+murine+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).</li>
<li>Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+inhibits+activation+and+migration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils.</a> Cell Tissue Research. , (2013).</li>
<li>Cakmak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+long-term+PM2.5+and+ozone+exposure+and+mortality+in+the+Canadian+Census+Health+and+Environment+Cohort+%28CANCHEC%29%2C+by+spatial+synoptic+classification+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+International%22%5BJournal%5D)">Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone.</a> Environment International. 111, 200-211 (2018).</li>
<li>Dauchet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+exposure+to+air+pollution%3A+Associations+with+lung+function+and+inflammatory+markers+in+non-smoking%2C+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+International%22%5BJournal%5D)">Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults.</a> Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).</li>
<li>Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+air+pollution+on+emergency+room+visits+for+respiratory+illnesses+in+Montreal%2C+Quebec%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).</li>
<li>Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ozone+on+leukocyte+function+in+exposed+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects.</a> Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).</li>
<li>Rush, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+chronic+exposure+to+air+pollution+and+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).</li>
<li>Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Chronic+Ozone+and+Particulate+Air+Pollution+on+Mortality+in+Patients+With+Sepsis+Across+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States.</a> Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).</li>
<li>Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+ozone+and+asthma+emergency+department+visits+in+Saint+John%2C+New+Brunswick%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada.</a> Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).</li>
<li>Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone+modifies+the+metabolic+and+endocrine+response+to+glucose%3A+Reproduction+of+effects+with+the+stress+hormone+corticosterone%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).</li>
<li>Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+low-dose+ozone-induced+murine+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 8 (11), 14463(2020).</li>
<li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regional+murine+ozone-induced+lung+inflammation+using+%5B18F%5DF-FDG+microPET%2FCT+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15699(2020).</li>
<li>Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+responses+to+secondary+endotoxin+challenge+in+rats+exposed+to+pig+barn+air%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+Medicine+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24(2008).</li>
<li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li>
<li>Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+intranasal+instillations+in+mice%3A+effects+of+volume%2C+time%2C+body+position%2C+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).</li>
<li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+CD34+produces+defects+in+platelets%2C+microparticles%2C+and+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation.</a> Cell Tissue Research. , (2020).</li>
<li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li>
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<li>Lee, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+regulates+the+expression+of+antiangiogenic+and+proapoptotic+pathways+via+targeted+inhibition+of+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins.</a> Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).</li>
<li>Hawkins, C. L., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+identification%2C+and+quantification+of+oxidative+protein+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).</li>
<li>Hemming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Pollutant+Ozone+Causes+Damage+to+Lung+Surfactant+Protein+B+%28SP-B%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B).</a> Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).</li>
<li>Oosting, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+surfactant+protein+A+to+ozone+in+vitro+and+in+vivo+impairs+its+interactions+with+alveolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells.</a> American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+necrotic+neutrophils+release+interleukin-16C+and+macrophage+migration+inhibitory+factor+from+stores+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Discovery%22%5BJournal%5D)">Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol.</a> Cell Death & Discovery. 1, 15056(2015).</li>
<li>Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+CXCR4+in+Normal+and+Abnormal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrapulmonary+manifestations+of+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extrapulmonary manifestations of COVID-19.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).</li>
<li>Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAulakh%2C+GK+%222017+IEEE+Nuclear+Science+Symposium+and+Medical+Imaging+Conference+%28NSS%2FMIC%29%22">2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC)</a>. , 1-2 (2017).</li>
<li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+image+x-radiography+for+functional+lung+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple image x-radiography for functional lung imaging.</a> Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009(2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses ni revelaciones que hacer.

Los métodos presentados en el estudio actual destacan la utilidad del análisis del compartimiento múltiple para estudiar eventos celulares múltiples durante la inflamación del pulmón. Hemos resumido los resultados en el Cuadro 2. Nosotros y muchos laboratorios hemos estudiado extensivamente la respuesta murine a la instilación intranasal de los LPS, que es marcada por el reclutamiento rápido de neutrófilos del pulmón, que alcanza un máximo entre 6-24 h después de los cuales, la resolución patea adentro. ...

La lesión pulmonar aguda (LPA) es una respuesta patológica crucial de los pulmones a estímulos infecciosos u otros estímulos dañinos que se caracteriza por la activación simultánea de los sistemas inmunitario coagulativo, fibrinolítico e innato1. Los neutrófilos detectan rápidamente patrones de daño microbiano e intracelular a través de la familia de receptores toll-like (TLR)2,3,4. Los neutrófilos liberan citoquinas preformadas y contenido de gránulos citotóxicos, que luego pueden causar daño tisular colateral. El daño alveolar subsiguiente se empaña con la muerte celular secundaria que lleva al lanzamiento de moléculas tales como trifosfato de adenosina (ATP)5,así fijando en un círculo vicioso del inmune-dysregulation.
Un problema sin resolver en la comprensión de ALI se relaciona con la cuestión de cómo se inicia la lesión dentro de la membrana alveolar. El complejo de transporte de electrones V, F1F0 ATP sintasa, es una proteína mitocondrial conocida por expresarse ubicuamente, en la membrana plasmática celular (incluyendo endotelial, leucocito, epitelial) durante la inflamación. El citoesqueleto celular que se compone de actina y tubulina, alberga muchas formas celulares y modulación de la función, así como proteínas mitocondriales, respectivamente. Recientemente hemos demostrado que el bloqueo de la ATP sintasa por una molécula endógena, angiostatina, silencia el reclutamiento de neutrófilos, la activación y el lipopolisacárido (LPS) indujo la inflamación pulmonar6. Así, los mecanismos bioquímicos (synthase del ATP) e inmunes (TLR4) pudieron regular la barrera alveolar durante la inflamación del pulmón.
La exposición al ozono (O3),un contaminante ambiental, deteriora la función pulmonar, aumenta la susceptibilidad a las infecciones pulmonares, y los niveles bajos cortos de exposiciones a O3 aumentan el riesgo de mortalidad en aquellos con afecciones cardiorrespiratorias subyacentes7,8,9,10,11,12,13,14. Así, la exposición a concentraciones fisiológicamente relevantes deO3 proporciona un modelo significativo de ALÍ para estudiar los mecanismos fundamentales de la inflamación7,8. Nuestro laboratorio ha establecido recientemente un modelo murino de dosis bajas de O3 inducida por ALI15. Después de realizar una dosis y tiempo-respuesta a bajas concentraciones deO3, observamos que la exposición a 0,05 ppmO3 durante 2 h, induce una lesión pulmonar aguda que está marcada por la subunidad de la subunidad β del complejo V de ATP sintasa pulmonar (ATPβ) y la expresión de angiostatina, similar al modelo LPS. Las imágenes pulmonares intravitales revelaron desorganización de los microfilamentos de actina alveolar que indican daño pulmonar, y la ablación de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) septal alveolares (que indican la abrogación de la señalización celular basal) y el potencial de membrana mitocondrial (que indica muerte celular aguda) después de la exposición de 2 h a 0,05 ppm O315 que se correlacionaron con un pulmón heterogéneo 18Retención de FDG16,reclutamiento de neutrófilos y liberación de citoquinas, sobre todo IL-16 y SDF-1α. El mensaje para llevar a casa de nuestros estudios recientes es que O3 produce una toxicidad exponencialmente alta cuando se expone a concentraciones por debajo de los límites permitidos de 0,063 ppm durante 8 h (por día) para la exposición humana. Es importante destacar que no existe una comprensión clara sobre si estas exposiciones subclínicas a O3 pueden modular mecanismos mediados por TLR4, como por la endotoxina bacteriana17. Por lo tanto, se estudió un doble golpe O3 y lps modelo de exposición y observó las adaptaciones celulares inmunes y no inmunes.
Describimos un análisis microscópico fluorescente comprensivo de varios compartimientos del pulmón y del cuerpo sistémico, a saber el líquido de lavado bronco-alveolar (es decir, BAL) que muestrea los espacios alveolares, el perfusate vascular del pulmón (es decir, LVP) que muestrea la vasculatura pulmonar y el intersticio septal alveolar en caso de una barrera endotelial comprometida, criosecciones izquierdas del pulmón, para mirar en los leucocitos parenquimales y adherentes residentes dejados en el tejido pulmonar lavado , sangre periférica que representa los leucocitos circulantes y los perfundsatos de médula ósea esternal y fémur que muestrean los sitios proximales y distales de movilización de células hematopoyéticas durante la inflamación, respectivamente.

<table><tbody><tr><td>Panel de quimiocinas Bioplex de 33 plex Biorad</td><td></td><td>12002231</td><td></td></tr><tr><td>63X aceite (NA 1.4-0.6) Objetivos de microscopio</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO CS (11506188)</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 350 cabra conjugada anti-ratón IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 cabra conjugada anti-ratón IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 faloidina conjugada</td><td>Invitrogen</td><td>A12370</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 ratón conjugado anti-& alfa; clon de tubulina DM1A</td><td>Millipore</td><td>05-829X-555</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568 cabra conjugada anti-hámster IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21112</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568 cabra conjugada anti-rata IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633 cabra conjugada anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>Hámster armenio anti-CD61 (clon 2C9. G2) IgG1 kappa</td><td>BD Pharmingen</td><td>553343</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 J Mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>64</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-fenilindol)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>alícuota en 2 &micro; l existencias y tienda a -20 grados; C</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente invertido de campo amplio</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX83</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Narketan)</td><td>Vetoquinol</td><td>100 mg/ml</td><td>Diluir 10 veces para hacer un caldo de 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Vivo (calceína)/Muerto (Etidio homodímero-1) kit de citotoxicidad</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-ATP5A1 IgG2b (clon 7H10BD4F9)</td><td>Invitrogen</td><td>459240</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-ATP5 y beta; IgG2b (clon 3D5AB1)</td><td>Invitrogen</td><td>A-21351</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti-NK1.1 IgG2a kappa (clon PK136)</td><td>Invitrogen</td><td>16-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm ensayo de proteínas</td><td>Thermoscientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>Conejo antiangiostatina (ratón aa 98-116) IgG</td><td>Abcam</td><td>ab2904</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)</td><td>Invitrogen</td><td>14-6093-81</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-Ki-67 (clon SolA15) IgG2a kappa</td><td>Invitrogen</td><td>14-5698-82</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-Ly6G IgG2a kappa (clon 1A8)</td><td>Invitrogen</td><td>16-9668-82</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clon RB6-8C5)</td><td>Invitrogen</td><td>53-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Rata anti-ratón CD16/CD32 Fc block (clon 2.4G2)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker reducido naranja</td><td>Invitrogen</td><td>M7511</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina (Rompun)</td><td>Bayer</td><td>20 mg/ml</td><td>Diluir 2 veces para hacer un caldo de 10 mg/ml</td></tr></tbody></table>

visualización de las adaptaciones celulares pulmonares durante la lesión pulmonar aguda murina inducida por ozono combinado y lps

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Los pulmones se enfrentan continuamente a insultos directos e indirectos en forma de condiciones inflamatorias estériles (partículas o toxinas reactivas) e infecciosas (bacterianas, virales o fúngicas). Una respuesta abrumadora del anfitrión puede dar lugar a la respiración comprometida y a lesión de pulmón aguda, que es caracterizada por el reclutamiento del neutrófilo del pulmón como resultado de la respuesta de remodelación inmune, coagulativa y del tejido pato-lógica del anfitrión. Los métodos microscópicos sensibles para visualizar y cuantificar las adaptaciones celulares pulmonares murinas, en respuesta al ozono de dosis bajas (0,05 ppm), un potente contaminante ambiental en combinación con lipopolisacárido bacteriano, un agonista TLR4, son cruciales para comprender los mecanismos inflamatorios y de reparación del huésped. Describimos un análisis microscópico fluorescente comprensivo del vario pulmón y de los compartimientos sistémicos del cuerpo, a saber el líquido de lavado bronco-alveolar, el perfusate vascular del pulmón, los cryosections izquierdos del pulmón, y el perfusate esternal de la médula. Mostramos daño de macrófagos alveolares, neutrófilos, tejido parenquimatoso pulmonar, así como células de médula ósea en correlación con una respuesta inmune retrasada (hasta 36-72 h) que se caracteriza por gradientes discretos de quimioquinas en los compartimentos analizados. Además, presentamos la matriz extracelular pulmonar y las interacciones citoesqueléticos celulares (actina, tubulina), especies de oxígeno mitocondrial y reactivo, plasminógeno anticoagulante, su fragmento peptídico antiangiogénico angiostatina, las subunidades mitocondriales del complejo V atp sintasa, α y β. Estos marcadores sustitutos, cuando están complementados con análisis célula-basados ines vitro adecuados y técnicas de proyección de imagen animales in vivo tales como microscopia intravital, pueden proporcionar la información vital hacia la comprensión de la respuesta del pulmón a los agentes inmunomoduladores nuevos.

La exposición combinada de O3 y de los LPS lleva a la movilización sistémica de la inflamación y de la médula en 72 h: Las cuentas de célula en diversos compartimientos revelaron cambios significativos en sangre periférica y las cuentas totales de la célula de la médula del fémur sobre exposiciones combinadas de O3 y de los LPS. Aunque las exposiciones combinadas deO3 y LPS no indujeron ningún cambio en los recuentos celulares t...

Los ratones expuestos al ozono combinado y a las endotoxinas bacterianas muestran una muerte celular muy extendida, incluida la de los neutrófilos. Observamos adaptaciones celulares tales como interrupción del lamellipodia citoesquelético, expresión celular creciente de la subunidad compleja del synthase del ATP de V β y angiostatin en lavado bronco-alveolar, supresión de la inmunorespuesta del pulmón y reclutamiento retrasado del neutrófilo.

Visualización De Las Adaptaciones Celulares Pulmonares Durante La Lesión Pulmonar Aguda Murina Inducida Por Ozono Combinado Y LPS

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

Hola, mi nombre es Gurpreet. Nuestro laboratorio investiga los mecanismos de inflamación y reparación pulmonar. Hola, mi nombre es Jessica e investigo los alvéolos de rata de laboratorio inducidos por ozono mediante el uso de métodos microscópicos fluorescentes.Hola a todos, mi nombre es Manpreet. Y estudio la inflamación pulmonar con métodos de imágenes animales. Los pulmones se enfrentan continuamente a insultos directos e indirectos, derivados de estériles, como el ozono, y componentes microbianos, como el lipopolisacárido bacteriano o LPS.Una respuesta abrumadora del anfitrión puede dar lugar a la respiración comprometida y a lesión de pulmón aguda según lo caracterizado por el reclutamiento del neutrófilo del pulmón, debido al remodelado inmune, coagulativo, y del tejido no regulado del anfitrión. Describimos un análisis comprensivo de varios compartimientos, a saber el líquido de lavado bronco-alveolar, de que es BAL, el perfusate vascular del pulmón, que es LVP, secciones izquierdas del cryo del pulmón, sangre periférica y la médula esternal y del fémur. Para exposiciones al ozono, coloque suavemente los ratones en la caja de inducción personalizada y exponga continuamente a los ratones a 0,05 PPM de ozono durante dos horas.Para exposiciones a LPS, anestesiar los ratones bajo ligera mezcla intraperitoneal de ketamina y xilazina. Ahora infunda 50 microlitros de la solución LPS en las narinas externas de los ratones. Infundir ratones control con 50 microlitros de solución salina estéril.En los puntos de tiempo especificados, anestesiar a los ratones con la dosis completa de ketamina y mezcla de xilazina. A continuación, desinfecte los ratones y compruebe si hay reflejos del pedal, es decir, pellizcar cualquiera de los dígitos de las extremidades traseras, y observar la retracción de la extremidad. Ningún reflejo significa anestesia profunda.Ahora haga un corte debajo del esternón y exponga el corazón. Coloque una aguja calibre 25 unida a la jeringa heparinizada en el ventrículo derecho y extraiga sangre mediante punción cardíaca. Recoja la sangre en jeringas heparinizadas y drene en tubos de microfugos para su posterior procesamiento.Use cuidadosamente pinzas o fórceps contundentes para eliminar la región traqueal del tejido sobre la evisca. Ahora corte a través de la caja torácica para exponer los pulmones. Pase una ligadura de algodón debajo de la tráquea, y déjela tal por el momento.Cortar la tráquea, espaciada en alrededor de un tercio de su longitud de los pulmones para la traqueotomía. Inserte una cánula de polietileno calibre 28 en la tráquea. Ate firmemente la ligadura de algodón para mantener la cánula en su lugar.Asegúrese de no contraer la cánula. Ahora inyecte gradualmente 0.5 ml de PBS en la cánula con la ayuda de una jeringa de un ml. Después de inyectar PBS aspirar la jeringa siempre y cuando no resista la succión.Recoja el líquido aspirado en un tubo de microfago marcado y repita este procedimiento dos veces más. Corte la aorta torácica descendente en la ubicación entre las mitades torácica y abdominal para evitar cualquier respaldo durante la perfusión pulmonar. Limpie la cavidad cerca del extremo de la aorta cortada libre de sangre.A continuación, perfunda los pulmones con 0.5 ML de solución salina heparinizada a temperatura ambiente, inyecte a través del ventrículo derecho. Recoja el perfusate vascular de la cavidad en el extremo del corte de la aorta torácica descendente. Después de ligar el bronquio derecho, deje que el pulmón izquierdo se infla con 0,5 ML de paraformadehído durante cinco minutos.Ahora desinfecte la porción abdominal. Cortar la parte abdominal y descalza del hueso pélvico. Recoja el hueso pélvico y aísle los huesos izquierdos y derechos del fémur en una placa de Petri llena de solución salina mantenida en el hielo.Recoja la caja torácica ventral y el esternón en una placa de Petri llena de solución salina, que también se mantiene en el hielo. Perfundir los extremos cortados de los huesos cuatro veces con 0,5 ML de solución salina utilizando agujas bien ajustadas en jeringas de 1 ML. Recoja las fracciones de cada hueso en tubos Falcon etiquetados, equipados con filtros y colocados en el hielo.Centrifugar todas las muestras durante 10 minutos a 3000 RPM. Recoger los sobrenadantes y flash congelarlos. Reconstituir las células en un mínimo de 200 microlitros de PBS.Realizar recuentos totales de leucocitos. Manche otro líquido de BAL con una mezcla de caleína verde y el etidio rojo homodímero una mancha. Analice el sobrenadante para las quimiocinas y la concentración total de proteínas.Centrifugar las células para preparar dos citospins en cada diapositiva y manchar para las proteínas bioquímicas e inmunes. Realizar tinción modificada de H y E en criosecciones pulmonares para todos los grupos. Delinear manualmente de 150 a 200 celdas en el panel de imágenes combinadas.Copie las regiones de interés descritas en todos los canales. Mida los parámetros preestablecidos para todos los canales. Divida la intensidad fluorescente de la molécula teñida por la de DAPI o CD61.Estos se denominan dapi o CD 61 normalizado relaciones de intensidad fluorescente. A continuación, trace los parámetros para evaluar cualquier cambio después de la exposición. Aunque, las exposiciones combinadas no indujeron ningunos cambios en el BAL total, LVP o las cuentas de célula esternal de la médula, los ratones exhibieron leucocitosis sistémica en 24 horas, que fue seguida por leucopenia en 72 horas después de la exposición.Éstos se muestran en las cuentas periféricas de la célula de sangre. Los recuentos de células de la médula ósea del fémur muestran el pico tardío a las 72 horas en comparación con todos los puntos de tiempo. Tenga en cuenta la ausencia de siglec-F y CX3CRI tinción en las células polimorfonucleares a las 24 horas en la imagen de citospino BAL.Los cytospins del BAL y de LVP demostraron la presencia de células mononucleares positivas grandes CD11b y GR1 en cero horas. Las células polimorfonucleares se presentaron como un tipo de célula predominante en todos los compartimentos después de la exposición. El contenido total de la proteína del BAL era el más alto en 36 horas después de la exposición combinada.Sin embargo, la proteína de LVP era sin cambios después de la exposición. Los niveles de eotaxin-2 e interleukin-2 eran los más altos en las cuatro horas en LVP. Estos chemokines fueron reducidos en la fracción del BAL.Interesante, el neutrófilo IL-16 alarmante y muchos chemokines naturales fueron alterados en el LVP, pero no la fracción del BAL. En la línea de fondo más el de 95% de las células del BAL eran mono nuclear que demostraban la actinia cortical, el lamellipodia, la tensión y las fibras de la tubulina, y eran fuertemente positivas para la coloración reducida del mitotracker. En cuatro horas, observamos las células circulares del BAL, que habían perdido la actinia, pero demostramos una red de los microtúbulos extendida como se muestra en rojo y una coloración reducida más baja del mitotracker.Temprano después de la exposición combinada, las células del BAL aparecían positivo doble para la calcina y el etidio homodimer-1, que indica las células parcialmente comprometidas. A las 36 horas, las células BAL eran en gran parte viables, es decir, verdes. Observamos la alfa discreta del ATP y la coloración de Ly6G en macrófagos alveolares del BAL, y neutrófilos.Observamos una reducción en la alfa normalizada DAPI del ATP y un aumento en contenido intracelular de la proteína de Ly6G. Las exposiciones combinadas indujeron expresiones transitorias de Bal, célula asesina natural y K1.1, ATP neutrófilo, subunidad PETA, factor de proliferación, Ki-67 y expresiones sostenidas de neutrófilo GR1, plaqueta CX3CRI y la proteína antiangiogénica angiostatina en células BAL después de la exposición. Aunque el daño septal bronquiolar y alveolar fuera esperado, era sorprendente observar agregados celulares en recipientes más grandes en 36 horas después de la exposición.Por último, tenemos los resultados del resumidor en esta tabla. Esperamos que nuestro modelo murino sirva como un prototipo fácilmente accesible que pueda ser reproducido en laboratorios de contención de nivel dos para estudiar los mecanismos de muerte celular invasiva e infecciones. Gracias.

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