Visualización De Las Adaptaciones Celulares Pulmonares Durante La Lesión Pulmonar Aguda Murina Inducida Por Ozono Combinado Y LPS

Hola, mi nombre es Gurpreet. Nuestro laboratorio investiga los mecanismos de inflamación y reparación pulmonar. Hola, mi nombre es Jessica e investigo los alvéolos de rata de laboratorio inducidos por ozono mediante el uso de métodos microscópicos fluorescentes.

Hola a todos, mi nombre es Manpreet. Y estudio la inflamación pulmonar con métodos de imágenes animales. Los pulmones se enfrentan continuamente a insultos directos e indirectos, derivados de estériles, como el ozono, y componentes microbianos, como el lipopolisacárido bacteriano o LPS.

Una respuesta abrumadora del anfitrión puede dar lugar a la respiración comprometida y a lesión de pulmón aguda según lo caracterizado por el reclutamiento del neutrófilo del pulmón, debido al remodelado inmune, coagulativo, y del tejido no regulado del anfitrión. Describimos un análisis comprensivo de varios compartimientos, a saber el líquido de lavado bronco-alveolar, de que es BAL, el perfusate vascular del pulmón, que es LVP, secciones izquierdas del cryo del pulmón, sangre periférica y la médula esternal y del fémur. Para exposiciones al ozono, coloque suavemente los ratones en la caja de inducción personalizada y exponga continuamente a los ratones a 0,05 PPM de ozono durante dos horas.

Para exposiciones a LPS, anestesiar los ratones bajo ligera mezcla intraperitoneal de ketamina y xilazina. Ahora infunda 50 microlitros de la solución LPS en las narinas externas de los ratones. Infundir ratones control con 50 microlitros de solución salina estéril.

En los puntos de tiempo especificados, anestesiar a los ratones con la dosis completa de ketamina y mezcla de xilazina. A continuación, desinfecte los ratones y compruebe si hay reflejos del pedal, es decir, pellizcar cualquiera de los dígitos de las extremidades traseras, y observar la retracción de la extremidad. Ningún reflejo significa anestesia profunda.

Ahora haga un corte debajo del esternón y exponga el corazón. Coloque una aguja calibre 25 unida a la jeringa heparinizada en el ventrículo derecho y extraiga sangre mediante punción cardíaca. Recoja la sangre en jeringas heparinizadas y drene en tubos de microfugos para su posterior procesamiento.

Use cuidadosamente pinzas o fórceps contundentes para eliminar la región traqueal del tejido sobre la evisca. Ahora corte a través de la caja torácica para exponer los pulmones. Pase una ligadura de algodón debajo de la tráquea, y déjela tal por el momento.

Cortar la tráquea, espaciada en alrededor de un tercio de su longitud de los pulmones para la traqueotomía. Inserte una cánula de polietileno calibre 28 en la tráquea. Ate firmemente la ligadura de algodón para mantener la cánula en su lugar.

Asegúrese de no contraer la cánula. Ahora inyecte gradualmente 0.5 ml de PBS en la cánula con la ayuda de una jeringa de un ml. Después de inyectar PBS aspirar la jeringa siempre y cuando no resista la succión.

Recoja el líquido aspirado en un tubo de microfago marcado y repita este procedimiento dos veces más. Corte la aorta torácica descendente en la ubicación entre las mitades torácica y abdominal para evitar cualquier respaldo durante la perfusión pulmonar. Limpie la cavidad cerca del extremo de la aorta cortada libre de sangre.

A continuación, perfunda los pulmones con 0.5 ML de solución salina heparinizada a temperatura ambiente, inyecte a través del ventrículo derecho. Recoja el perfusate vascular de la cavidad en el extremo del corte de la aorta torácica descendente. Después de ligar el bronquio derecho, deje que el pulmón izquierdo se infla con 0,5 ML de paraformadehído durante cinco minutos.

Ahora desinfecte la porción abdominal. Cortar la parte abdominal y descalza del hueso pélvico. Recoja el hueso pélvico y aísle los huesos izquierdos y derechos del fémur en una placa de Petri llena de solución salina mantenida en el hielo.

Recoja la caja torácica ventral y el esternón en una placa de Petri llena de solución salina, que también se mantiene en el hielo. Perfundir los extremos cortados de los huesos cuatro veces con 0,5 ML de solución salina utilizando agujas bien ajustadas en jeringas de 1 ML. Recoja las fracciones de cada hueso en tubos Falcon etiquetados, equipados con filtros y colocados en el hielo.

Centrifugar todas las muestras durante 10 minutos a 3000 RPM. Recoger los sobrenadantes y flash congelarlos. Reconstituir las células en un mínimo de 200 microlitros de PBS.

Realizar recuentos totales de leucocitos. Manche otro líquido de BAL con una mezcla de caleína verde y el etidio rojo homodímero una mancha. Analice el sobrenadante para las quimiocinas y la concentración total de proteínas.

Centrifugar las células para preparar dos citospins en cada diapositiva y manchar para las proteínas bioquímicas e inmunes. Realizar tinción modificada de H y E en criosecciones pulmonares para todos los grupos. Delinear manualmente de 150 a 200 celdas en el panel de imágenes combinadas.

Copie las regiones de interés descritas en todos los canales. Mida los parámetros preestablecidos para todos los canales. Divida la intensidad fluorescente de la molécula teñida por la de DAPI o CD61.

Estos se denominan dapi o CD 61 normalizado relaciones de intensidad fluorescente. A continuación, trace los parámetros para evaluar cualquier cambio después de la exposición. Aunque, las exposiciones combinadas no indujeron ningunos cambios en el BAL total, LVP o las cuentas de célula esternal de la médula, los ratones exhibieron leucocitosis sistémica en 24 horas, que fue seguida por leucopenia en 72 horas después de la exposición.

Éstos se muestran en las cuentas periféricas de la célula de sangre. Los recuentos de células de la médula ósea del fémur muestran el pico tardío a las 72 horas en comparación con todos los puntos de tiempo. Tenga en cuenta la ausencia de siglec-F y CX3CRI tinción en las células polimorfonucleares a las 24 horas en la imagen de citospino BAL.

Los cytospins del BAL y de LVP demostraron la presencia de células mononucleares positivas grandes CD11b y GR1 en cero horas. Las células polimorfonucleares se presentaron como un tipo de célula predominante en todos los compartimentos después de la exposición. El contenido total de la proteína del BAL era el más alto en 36 horas después de la exposición combinada.

Sin embargo, la proteína de LVP era sin cambios después de la exposición. Los niveles de eotaxin-2 e interleukin-2 eran los más altos en las cuatro horas en LVP. Estos chemokines fueron reducidos en la fracción del BAL.

Interesante, el neutrófilo IL-16 alarmante y muchos chemokines naturales fueron alterados en el LVP, pero no la fracción del BAL. En la línea de fondo más el de 95% de las células del BAL eran mono nuclear que demostraban la actinia cortical, el lamellipodia, la tensión y las fibras de la tubulina, y eran fuertemente positivas para la coloración reducida del mitotracker. En cuatro horas, observamos las células circulares del BAL, que habían perdido la actinia, pero demostramos una red de los microtúbulos extendida como se muestra en rojo y una coloración reducida más baja del mitotracker.

Temprano después de la exposición combinada, las células del BAL aparecían positivo doble para la calcina y el etidio homodimer-1, que indica las células parcialmente comprometidas. A las 36 horas, las células BAL eran en gran parte viables, es decir, verdes. Observamos la alfa discreta del ATP y la coloración de Ly6G en macrófagos alveolares del BAL, y neutrófilos.

Observamos una reducción en la alfa normalizada DAPI del ATP y un aumento en contenido intracelular de la proteína de Ly6G. Las exposiciones combinadas indujeron expresiones transitorias de Bal, célula asesina natural y K1.1, ATP neutrófilo, subunidad PETA, factor de proliferación, Ki-67 y expresiones sostenidas de neutrófilo GR1, plaqueta CX3CRI y la proteína antiangiogénica angiostatina en células BAL después de la exposición. Aunque el daño septal bronquiolar y alveolar fuera esperado, era sorprendente observar agregados celulares en recipientes más grandes en 36 horas después de la exposición.

Por último, tenemos los resultados del resumidor en esta tabla. Esperamos que nuestro modelo murino sirva como un prototipo fácilmente accesible que pueda ser reproducido en laboratorios de contención de nivel dos para estudiar los mecanismos de muerte celular invasiva e infecciones. Gracias.