Name: Wide-Field, Imágenes en tiempo real de señales de heridas locales y sistémicas en Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Aprende a visualizar señales de calcio y glutamato en tiempo real en Arabidopsis thaliana tras heridas mecánicas. Este protocolo de imagen de campo amplio permite estudiar la propagación sistémica de señales de defensa en plantas.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (17H05007 y 18H05491) a MT, la Fundación Nacional de Ciencias (IOS1557899 y MCB2016177) y la Administración Nacional de Aeronáutica y del Espacio (NNX14AT25G y 80NSSC19K0126) a SG.

1. Preparación de material vegetal
<ol><li>En un microtubo de 1,5 mL, esterilizar en superficie las semillas de arabidopsis thaliana (col-0 accesión) planta que expresa ya sea GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR agitando con 20% (v / v) NaClO durante 3 min y luego lavar 5 veces con agua destilada estéril. NOTA: Las líneas transgénicas de Arabidopsis que expresan GCaMP3 o CHIB-iGluSnFR han sido descritaspreviamente 6.</li>
	<li>En una capucha estéril, siembre 13 semillas esterilizadas en superficie en una placa de Petri de plástico cuadrada de 10 cm llena de 30 mL de murashige estéril (autoclave) y medio Skoog (MS) [1x sales ms, 1% (p/v) sacarosa, 0,01% (p/v) myoinositol, 0,05% (p/v) MES y 0,5% (p/v) goma gellan; pH 5,7 ajustado con 1N KOH]. Substituya la tapa y envuelva con cinta quirúrgica.</li>
	<li>Después de la incubación en la oscuridad a 4 °C durante 2 días, colocar las placas horizontalmente a 22 °C en una cámara de crecimiento bajo luz continua (90-100 μmol m-2 s-1) durante aproximadamente 2 semanas antes de su uso. Después de 2 semanas, cuente el número de hojas de Arabidopsis de mayor amenor 44 (Figura 1). Las respuestas de la herida se desplazan preferentemente de la hoja dañada (n) a las hojas numeradas n ± 3 y n ± 56. NOTA: En este protocolo, la placa de Petri se abrirá para obtener imágenes de los efectos de la herida y el glutamato bajo un microscopio de fluorescencia. Por lo tanto, los pasos posteriores de este experimento deben llevarse a cabo en condiciones ambiente controladas por temperatura y humedad. Esto se debe a que las señales de Ca2+ también son provocadas por cambios en estas condiciones ambientales. También se sabe que la luz azul, emitida por el microscopio durante el registro para la excitación de la fluorescencia de la proteína biosensor, puede provocar un aumento de la concentración citosólica de Ca2 + 45 y por lo tanto la planta debe aclimatarse a la irradiación de luz azul durante varios minutos antes de comenzar el experimento.</li>
</ol>2. Preparación química
<ol><li>Disuelva el L-glutamato en un medio de crecimiento líquido [1/2x sales ms, 1% (p/v) sacarosa y 0,05% (p/v) MES; pH 5,1 ajustado con 1N KOH] para hacer una solución de trabajo de 100 mM. NOTA: Evite el uso de sales de glutamato como el glutamato de sodio para prevenir posibles efectos relacionados con cationes sobre la dinámica de Ca2 +.</li>
</ol>3. Ajuste del microscopio y realización de imágenes en tiempo real
<ol><li>Encienda el estereomicroscopio de fluorescencia motorizado equipado con una lente objetivo 1x (NA = 0,156) y una cámara sCMOS (Figura 2) y configure los ajustes del dispositivo para irradiar con una luz de excitación de 470/40 nm y adquirir una luz de emisión que pase a través de un filtro de 535/50 nm. NOTA: Cualquier microscopio de fluorescencia sensible a GFP se puede utilizar para detectar señales GCaMP3 e iGluSnFR en tiempo real, pero se recomienda una lente objetivo de baja potencia y una cámara altamente sensible con un chip sCMOS ancho para adquirir señales de toda la planta. El objetivo de baja potencia permite la obtención de imágenes de la respuesta de toda una planta de Arabidopsis y el uso de una cámara altamente sensible permite la rápida adquisición de datos necesaria para capturar el rápido curso de tiempo de la onda de Ca2 + activada por heridas. Para el microscopio de fluorescencia utilizado en este estudio, los valores máximos del campo de visión y la resolución temporal son de 3 cm x 3 cm y 30 cuadros por segundo (fps), respectivamente.</li>
	<li>Retire la tapa y coloque el plato debajo de la lente objetivo.</li>
	<li>Compruebe la señal de fluorescencia de la planta y luego espere aproximadamente 30 minutos en la oscuridad hasta que las plantas se adapten a las nuevas condiciones ambientales. Este paso de adaptación es necesario porque los cambios en la humedad provocan [Ca2 +]elevación cyt en las plantas que pueden interferir con cualquier evento relacionado con la herida.</li>
	<li>Ajuste el enfoque y la ampliación para ver toda la planta en el campo de visión. En el protocolo actual, se utilizó un aumento de 0,63x.</li>
	<li>Antes de comenzar las imágenes en tiempo real, configure los parámetros de adquisición para detectar las señales de fluorescencia utilizando el software de imágenes de microscopio. Los ajustes para la proyección de imagen en el protocolo actual son: tiempos de la exposición y del intervalo fijados a 1.8 s y 2 s (es decir, 0.5 fps), respectivamente. Establezca el tiempo de grabación en 11 min.</li>
	<li>Imagen durante 5 minutos antes de comenzar el experimento para aclimatar la planta a la irradiación de luz azul del microscopio, luego comience a grabar haciendo clic en Ejecutar ahora,o el comando equivalente en el software de microscopio que se está utilizando. Para determinar la fluorescencia basal promedio, registre al menos 10 fotogramas (es decir, al menos 20 s en el protocolo actual) antes de la herida o la aplicación de glutamato (consulte la Sección 4).<ol>
<li>Para obtener imágenes en tiempo real de los cambiosde cyt y [Glu]apo inducidos por heridas [Ca2+],corte el pecíolo o la región media de la hoja L1 con tijeras (Figura 3 y Figura 4).</li>
		<li>Para obtener imágenes en tiempo real de los cambiosde cyt desencadenados por glutamato [Ca2+],corte el borde (aproximadamente 1 mm de la punta) de la hoja 1 a través de la vena principal con tijeras. Después de al menos un período de recuperación de 20 min, aplique 10 μL de glutamato de 100 mM a la superficie de corte de la hoja (Figura 5). NOTA: Este pre-corte fue necesario para permitir el acceso del glutamato al apoplasto de la hoja con el fin de desencadenar respuestas. Además, se encontró que la aplicación de una gota de agua destilada a la superficie de corte de la hoja L1 era crítica para evitar que las muestras se desecaran durante la recuperación antes de aplicar glutamato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de terminar la grabación de 11 minutos, guarde los datos.</li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Para el análisis de la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo, defina una región de interés (ROI) en el lugar donde se va a analizar la intensidad de fluorescencia (Figura 6 y Figura 7). Para el cálculo de la velocidad de la onda Ca2+, defina 2 ROI (ROI1 y ROI2) para el análisis. En el software de imágenes, haga clic en Medición de tiempo | Definir | Círculo. Mida la distancia entre ROI1 y ROI2 haciendo clic en Anotaciones y | Longitud | Línea simple (Figura 6).</li>
	<li>Mida los valores de fluorescencia sin procesar (F) en cada ROI a lo largo del tiempo haciendo clic en Medir. Exportar datos sin procesar a un software de hoja de cálculo para convertir la señal de fluorescencia en números en cada punto de tiempo haciendo clic en Todo a Excel | Exportar.</li>
	<li>Determine el valor de fluorescencia basal, que se define como F0,calculando el promedio de F durante los primeros 10 fotogramas (es decir, antes del tratamiento) en los datos registrados.</li>
	<li>Normalice los datos de F (calculando ΔF/F) usando la ecuación ΔF/F = (F−F0)/F0, donde ΔF es el cambio dependiente del tiempo en fluorescencia.</li>
	<li>Para el análisis de onda de velocidad de onda de Ca2+, defina un punto de ascenso de señal significativo por encima de los valores preestimulados como representación de la detección de un aumento de Ca2+ en cada ROI(t1 y t2)utilizando el criterio de un aumento a 2× la desviación estándar (2x SD) que se calcula a partir de los datos de F0 utilizando software estadístico. El 95% de los datos de F0 se encuentra dentro de 2x SD de la media, lo que indica que un aumento de la señal por encima de este nivel por casualidad es ≤5%. Calcule la diferencia de tiempo del aumento de Ca2+ entre ROI1 y ROI2 [t2- t1 time-lag (Δt)] y mida la distancia entre ROI1 y ROI2, luego determine las velocidades de cualquier onda de Ca2+.</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

La señalización sistémica es importante para que las plantas respondan a estímulos ambientales externos localizados y luego mantengan su homeostasis a nivel de toda la planta. Aunque no están equipados con un sistema nervioso avanzado como los animales, emplean una comunicación rápida tanto dentro como entre órganos basados en factores como las señales eléctricas móviles (y posiblemente hidráulicas) y las ondas de propagación de ROS y Ca2+46,47. El pro...

Las plantas no pueden escapar de las tensiones bióticas, por ejemplo, los insectos que se alimentan de ellas, por lo que han desarrollado sofisticados sistemas de detección de estrés y transducción de señales para detectar y luego protegerse de desafíos como la herbivoría1. Al herir o atacar a los herbívoros, las plantas inician respuestas de defensa rápidas, incluida la acumulación del ácido fitohormona jasmónico (JA) no sólo en el sitio herido, sino también en los órganos distales no dañados2. Este JA entonces ambos acciona respuestas de la defensa en los tejidos directamente dañados e induce preventivamente defensas en las partes no dañadas de la planta. En Arabidopsis,la acumulación de JA inducida por heridas se detectó en hojas distales e intactas a los pocos minutos del daño en otra parte de la planta, lo que sugiere que se está transmitiendo una señal rápida y a larga distancia desde la hoja herida3. Varios candidatos, tales como Ca2+,especies reactivas de oxígeno (ROS), y señales eléctricas, se han propuesto para servir como estas señales de heridas de larga distancia en las plantas4,5.
Ca2+ es uno de los elementos de segundo mensajero más versátiles y ubicuos en los organismos eucariotas. En las plantas, la masticación de orugas y las heridas mecánicas causan aumentos drásticos en la concentración citosólica de Ca2+ ([Ca2+]cyt)tanto en la hoja herida como en las hojas distantes desenrolladas6,7. Esta señal sistémica de Ca2+ es recibida por proteínas intracelulares de detección de Ca2+,que conducen a la activación de las vías de señalización de defensa aguas abajo, incluida la biosíntesis de JA8,9. A pesar de los informes numerosos tales que apoyan la importancia de las señales de Ca2+ en respuestas de la herida de la planta, la información sobre las características espaciales y temporales de las señales de Ca2+ inducidas por herir es limitada.
Las imágenes en tiempo real utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente son una herramienta poderosa para monitorear y cuantificar la dinámica espacial y temporal de las señales de Ca2+. Hasta la fecha, se han desarrollado versiones de dichos sensores que permiten la visualización de señales de Ca2+ a nivel de una sola célula, a tejidos, órganos e incluso plantas enteras10. El primer biosensor codificado genéticamente para Ca2+ utilizado en plantas fue la proteína bioluminiscente aequorina derivada de la medusa Aequorea victoria11. Aunque esta proteína quimioluminiscente se ha utilizado para detectar cambios de Ca2+ en respuesta a diversas tensiones en plantas12,13, 14,15, 16,17, 18,no es adecuada para imágenes en tiempo real debido a la señal luminiscente extremadamente baja que produce. Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basado en indicadores de Ca2 +, tales como los cameleons amarillos, también se han utilizado con éxito para investigar la dinámica de una gama de eventos de señalización de Ca2 + en las plantas19,20,21,22,23,24. Estos sensores son compatibles con los enfoques de imagen y más comúnmente están compuestos por la proteína de unión a Ca2+ calmodulina (CaM) y un péptido de unión a CaM (M13) de una quinasa de cadena ligera de miosina, todos fusionados entre dos proteínas fluoróforas, generalmente una proteína fluorescente cian (CFP) y una variante de proteína fluorescente amarilla (YFP)10. La unión de Ca2+ a CaM promueve la interacción entre CaM y M13, lo que lleva a un cambio conformacional del sensor. Este cambio promueve la transferencia de energía entre el CFP y el YFP, lo que aumenta la intensidad de fluorescencia del YFP al tiempo que disminuye la emisión de fluorescencia del CFP. El monitoreo de este cambio de CFP a fluorescencia YFP entonces proporciona una medida del aumento en el nivel de Ca2 +. Además de estos sensores FRET, los biosensores ca2+ basados en proteínas fluorescentes individuales (FP), como GCaMP y R-GECO, también son compatibles con los enfoques de imágenes de plantas y se utilizan ampliamente para estudiar los cambiosde ci cyt [Ca2+] debido a su alta sensibilidad y facilidad de uso25,26,27,28,29,30. GCaMPs contiene un solo circular permutated (cp) GFP, otra vez fusionado a CaM y el péptido M13. La interacción dependiente de Ca2+entre CaM y M13 provoca un cambio conformacional en el sensor que promueve un cambio en el estado de protonación del cpGFP, potenciando su señal fluorescente. Por lo tanto, a medida que aumentan los niveles de Ca2 +, la señal cpGFP aumenta.
Para investigar la dinámica de las señales de Ca2 + generadas en respuesta a heridas mecánicas o alimentación de herbívoros, hemos utilizado plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana que expresan una variante de GCaMP, GCaMP3, y un microscopio de fluorescencia de campo ancho6. Este enfoque ha tenido éxito en la visualización de la transmisión rápida de una señal de Ca2 + de larga distancia desde el sitio de la herida en una hoja a toda la planta. Así, un aumento en [Ca2+]cyt fue detectado inmediatamente en el sitio de la herida pero esta señal de Ca2+ entonces fue propagada a las hojas vecinas a través de la vasculatura dentro de algunos minutos de herir. Además, encontramos que la transmisión de esta señal de herida sistémica rápida se suprime en plantas de Arabidopsis con mutaciones en dos genes similares a receptores de glutamato, Glutamato Receptor Like (GLR), GLR3.3, y GLR3.66. Los GLRs parecen funcionar como canales de Ca2+ bloqueados por aminoácidos involucrados en diversos procesos fisiológicos, incluyendo la respuesta de la herida3,el crecimiento del tubo de polen31,el desarrollo de la raíz32,la respuesta fría33y la inmunidad innata34. A pesar de esta función fisiológica amplia y bien entendida de los GLRs, la información sobre sus propiedades funcionales, como su especificidad de ligando, selectividad iónica y localización subcelular, es limitada35. Sin embargo, estudios recientes informaron que GLR3.3 y GLR3.6 están localizados en el floema y el xilema, respectivamente. Los GLRs de plantas tienen similitudes con los receptores ionotrópicos de glutamato (iGluRs)36 en mamíferos, que son activados por aminoácidos, como el glutamato, la glicina y la D-serina en el sistema nervioso de los mamíferos37. De hecho, demostramos que la aplicación de glutamato de 100 mM, pero no de otros aminoácidos, en el sitio de la herida induce una señal rápida y a larga distancia de Ca2+ en Arabidopsis,lo que indica que el glutamato extracelular probablemente actúa como una señal de herida en las plantas6. Esta respuesta se suprime en el mutante glr3.3/glr3.6sugiriendo que el glutamato puede estar actuando a través de uno o ambos de estos canales similares a receptores y, de hecho, AtGLR3.6 recientemente se demostró que está bloqueado por estos niveles de glutamato38.
En las plantas, además de su papel como aminoácido estructural, el glutamato también se ha propuesto como un regulador clave del desarrollo39; sin embargo, su dinámica espacial y temporal es poco conocida. Al igual que para el Ca2+,se han desarrollado varios indicadores genéticamente codificados para el glutamato para monitorizar la dinámica de este aminoácido en células vivas40,41. iGluSnFR es un biosensor de glutamato de fp único basado en GFP compuesto por cpGFP y una proteína de unión a glutamato (GltI) de Escherichia coli42,43. El cambio conformacional de iGluSnFR, que es inducido por la unión de glutamato a GltI, resulta en una emisión de fluorescencia GFP mejorada. Para investigar si el glutamato extracelular actúa como molécula de señalización en la respuesta de la herida de la planta, conectamos la secuencia de iGluSnFR con la secuencia básica de secreción de péptidos de señal quitinasa (CHIB-iGluSnFR) para localizar este biosensor en el espacio apóplásico6. Este acercamiento permitió la proyección de imagen de cualquier cambio en la concentración apoplástica del glutamato ([Glu]apo)usando las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresaban este sensor. Detectamos aumentos rápidos en la señal del iGluSnFR en el sitio que hería. Estos datos apoyan la idea de que el glutamato se escapa de las células/tejidos dañados al apoplasto al herir y actúa como una señal de daño que activa los GLRs y conduce a la señal de Ca2+ de larga distancia en las plantas6.
Aquí, describimos un método de imágenes en tiempo real en toda la planta utilizando biosensores codificados genéticamente para monitorear y analizar la dinámica de ca2 + de larga distancia y señales de glutamato extracelular en respuesta a la herida6. La disponibilidad de microscopía de fluorescencia de campo amplio y plantas transgénicas que expresan biosensores codificados genéticamente proporciona un enfoque potente, pero fácil de implementar para detectar señales de larga distancia transmitidas rápidamente, como las ondas ca2 +.

<table><tbody><tr><td>Arabidopsis expresando GCaMP3 Universidad de</td><td>Saitama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis expresando CHIB-iGluSnFR</td> Universidad <td></td><td></td>de <td>Saitama</td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 7</td><td>Software GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamato</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>072-00501</td><td>Disuelto en un medio de crecimiento líquido [1/2x sales de MS, 1% (p/v) de sacarosa y 0,05% (p/v) de MES; pH 5,1 ajustado con 1N KOH].</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) medio</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>392-00591</td><td>composición: 1x sales MS, 1% (p/v) de sacarosa, 0,01% (p/v) de mioinositol, 0,05% (p/v) MES y 0,5% (p/v) goma gellan; pH 5,7 ajustado con 1N KOH.</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Nikon SMZ25</td><td>Análisis Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR Lente</td> objetivo <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x (P2-SHR PLAN APO)Cámara</td> <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sCMOS (ORCA-Flash4.0 V2)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de plástico cuadrada</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td></td></tr></tbody></table>

wide-field, imágenes en tiempo real de señales de heridas locales y sistémicas en arabidopsis

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Las plantas responden a tensiones mecánicas como heridas y herbívoros induciendo respuestas de defensa tanto en las partes dañadas como en las distales no dañadas. Sobre herir de una hoja, un aumento en la concentración cytosolic del ion del calcio (señal de Ca2+) ocurre en el sitio de la herida. Esta señal se transmite rápidamente a las hojas no dañadas, donde se activan las respuestas de defensa. Nuestra investigación reciente reveló que el glutamato que se escapa de las células heridas de la hoja en el apoplasto alrededor de ellos sirve como señal de la herida. Este glutamato activa los canales permeables de Ca2+ similares a los receptores de glutamato, lo que luego conduce a la propagación de señales de Ca2+ a larga distancia en toda la planta. Las características espaciales y temporales de estos eventos se pueden capturar con imágenes en tiempo real de plantas vivas que expresan biosensores fluorescentes codificados genéticamente. Aquí introducimos un método planta-ancho, en tiempo real de la proyección de imagen para supervisar la dinámica de las señales de Ca2+ y de los cambios en el glutamato apoplásico que ocurren en respuesta a herir. Este enfoque utiliza un microscopio de fluorescencia de campo amplio y plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan proteína verde fluorescente (GFP)-basado en Ca2 + y biosensores de glutamato. Además, presentamos la metodología para provocar fácilmente herida-inducida, glutamato-accionado rápido y a larga distancia Ca2+ propagación de la señal. Este protocolo también se puede aplicar a estudios sobre otras tensiones de plantas para ayudar a investigar cómo la señalización sistémica de la planta podría estar involucrada en sus redes de señalización y respuesta.

La propagación de la señal de [Ca2+]cyt y [Glu]apo en respuesta a la herida se presenta en la Figura 3, figura 4, película S1y película S2. El corte del pecíolo de la hoja 1 en plantas que expresan GCaMP3 (a 0 s) llevó a un aumento significativo de [Ca2+]cyt que fue rápidamente inducido localmente a través de la vasculatura (a los 40 s) (<str...

Extracelular glutamato desencadenado por la señalización sistémica de calcio es fundamental para la inducción de las respuestas de defensa de las plantas a las heridas mecánicas y ataques de herbívoros en las plantas. Este artículo describe un método para visualizar la dinámica espacial y temporal de ambos estos factores usando las plantas del thaliana de Arabidopsis que expresan los biosensores fluorescentes calcio y glutamato-sensibles.

Wide-Field, Imágenes en tiempo real de señales de heridas locales y sistémicas en Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Este protocolo permite la proyección de imagen en tiempo real planta-ancha de la actividad del sistema de señalización sistémico de la planta con la supervisión de la dinámica del calcio y del glutamato apoplásico en respuesta a la herida. Este método de imágenes en tiempo real en toda la planta proporciona una herramienta robusta para comprender la dinámica de las señales rápidas y de larga distancia en las plantas, combinando una alta resolución temporal espacial y facilidad de uso. Este protocolo ofrece el potencial de proporcionar una nueva visión de las características espaciales y temporales del sistema de señalización de calcio en las respuestas de estrés biótico y abiótico en otras especies de plantas.Demostrando el procedimiento estará Takuya Uemura, un becario postdoctoral de mi laboratorio. Comience por encender el microscopio estéreo fluorescente motorizado, equipado con una lente objetivo 1X y una cámara sCMOS. Configure los ajustes del dispositivo para irradiar con luz de excitación centrada en 470 nanómetros, seleccionados mediante un filtro que transmite luz entre 450 y 490 nanómetros.Adquirir luz de emisión mediante un filtro que transmita entre 510 y 560 nanómetros. Retire la tapa del plato que contiene la planta y colócalo debajo de la lente objetivo. Compruebe la señal fluorescente de la planta.Luego espere aproximadamente 30 minutos en la oscuridad hasta que las plantas se adapten a las nuevas condiciones ambientales. Ajuste el enfoque y la ampliación para ver toda la planta en el campo de visión. A continuación, establezca los parámetros de adquisición para detectar las señales fluorescentes utilizando el software de imágenes de microscopios.Establezca el tiempo de grabación en 11 minutos. Imagen durante cinco minutos antes de comenzar el experimento para aclimatar la planta a la irradiación de luz azul del microscopio, luego comenzar a grabar. Determinar el promedio de fluorescencia basal registrar al menos 10 fotogramas antes de la herida o la aplicación de glutamato.Para la proyección de imagen en tiempo real del ion cytosolic inducido herida del calcio y de los cambios apoplásticos de la concentración del glutamato, corte el pecíolo o la región media de la hoja L1 con las tijeras. Para la proyección de imagen en tiempo real del glutamato accionados cambios cytosolic del calcio, corte aproximadamente un milímetro de la extremidad de la hoja L1 a través de la vena principal con las tijeras. Después de al menos 20 minutos aplique 10 microlitros de glutamato milimolar de 100 a la superficie de corte de la hoja.Para el análisis de la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo, defina una región de interés en el lugar donde se va a analizar la intensidad de fluorescencia. Defina dos ROIs para el cálculo de la velocidad de la onda de calcio. En el software de imágenes, haga clic en medición de tiempo, defina y circule.Mida la distancia entre las dos regiones haciendo clic en anotaciones y medición, longitud y línea simple. Mida los valores de florescencia sin procesar en cada ROI a lo largo del tiempo haciendo clic en medir, luego exporte los datos sin procesar al software de hoja de cálculo, para convertir la señal fluorescente en números en cada punto de tiempo. Determine el valor de fluorescencia basal, que se adivía como F cero, calculando el promedio de F sobre los primeros 10 fotogramas en los datos registrados, luego normalice los datos de F como se describe en el manuscrito del texto.Para el análisis de ondas de velocidad de calcio, defina un punto de rotación de señal significativo por encima de los valores preestimulados como representación de la detección de un aumento de calcio en cada ROI. Calcule la diferencia de tiempo en el aumento de calcio entre los dos ROIs y la distancia entre ellos para determinar las velocidades de cualquier onda de calcio. La propagación de un cambio herida-accionado en las concentraciones del ion cytosolic del calcio y del glutamato apoplásico se demuestra aquí.Cortar el pecíolo de una hoja en plantas que expresan GCaMP-3 llevó a un aumento significativo en el calcio. Fue inducido localmente y después separado a través de la vasculatura. La señal se propagó rápidamente a las hojas vecinas en pocos minutos.Al cortar una hoja y plantas que expresaban el sniffer básico del pegamento de la quitinasa I, un aumento apoplásico rápido del glutamato fue observado alrededor de la región del corte. En pocos minutos, la señal también se propagó a través de la vasculatura. Para la proyección de imagen en tiempo real de la propagación de la señal del calcio accionada por el uso del glutamato, el borde de una hoja en las plantas que expresaban CCaMP-3 fue cortado.Esto causó un aumento cytosolic local de la concentración del ion del calcio, pero la señal desapareció dentro de algunos minutos. Después de aproximadamente 10 minutos, el glutamato fue aplicado a la superficie del corte, causando un aumento local rápido en la concentración de calcio cytosolic y después la propagación de esta señal a las hojas distales. Para medir los cambios dentro de una concentración sólida del calcio inducida hiriendo en la hoja sistémica, el cambio del curso del tiempo de la intensidad de la señal GCaMP-3 fue medido en dos regiones del interés.Los cambios apoplásticos de la concentración del glutamato en respuesta a daño mecánico fueron medidos también. La firma del glutamato exhibió un solo pico en aproximadamente 100 segundos después de herir. Este experimento debe llevarse a cabo bajo condiciones controladas de temperatura y humedad debido a que están elevadas por los cambios en estas condiciones ambientales.Este protocolo ofrece un potencial para proporcionar información sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la señalización a larga distancia a través del uso de mutantes que los elementos defectuosos y supuestos del sistema de señalización de laboratorio.

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