Name: Generación de equivalentes de piel humana vascularizada autoensamblada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a generar equivalentes de piel humana vascularizada con técnicas de cultivo a largo plazo. Este método permite estudiar enfermedades, envejecimiento y medicina personalizada con modelos fisiológicamente relevantes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen al Dr. Jim Rheinwald59 y a la Dra. Ellen H. van den Bogaard20 por su generoso regalo de líneas celulares N/TERT. Este trabajo fue apoyado por la Asociación Americana del Corazón (19IPLOI34760636).

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo ha demostrado un método sencillo y repetible para la generación de VHSE y su análisis tridimensional. Es importante destacar que este método se basa en pocas técnicas especializadas o piezas de equipo, por lo que es accesible para una amplia gama de laboratorios. Además, los tipos de células pueden ser reemplazados con cambios limitados en el protocolo, lo que permite a los investigadores adaptar este protocolo a sus necesidades específicas.
La gelificación adecuada del colágeno es un paso desafiador en el establecimiento de la cultura de la piel. Especialmente cuando se usan preparaciones crudas sin purificación, los contaminantes traza podrían influir en el proceso de gelificación. Para ayudar a garantizar la consistencia, se deben realizar grupos de experimentos con el mismo stock de colágeno que se utilizará para la generación de VHSE. Además, la gelificación idealmente debe ocurrir a un pH de 7-7.4, y los contaminantes traza pueden cambiar el pH. Antes de usar cualquier caldo de colágeno, se debe hacer un gel acelular de práctica en la concentración deseada y se debe medir el pH antes de la gelificación. Completar este control de calidad del colágeno antes de comenzar la siembra de componentes dérmicos identificará los problemas con la gelificación adecuada y la homogeneidad del colágeno antes de establecer un experimento completo. En lugar de sembrar colágeno acelular directamente sobre un inserto de cultivo, sembra un poco de colágeno en una tira de pH que evalúa toda la escala de pH y verifica un pH de 7-7.4. La gelificación se puede evaluar aplicando una gotita de la solución de gel de colágeno sobre una placa de pozo de plástico de cultivo de cubrebocas o tejido (se recomienda una placa de pozo para simular los lados confinados de un inserto de cultivo). Después del tiempo de gelificación, el colágeno debe ser sólido, es decir, no debe fluir cuando la placa está inclinada. Bajo microscopía de contraste de fase, el colágeno debe verse homogéneo y claro. Las burbujas ocasionales de la siembra de colágeno son normales, pero las grandes manchas amorfas de colágeno opaco dentro del gel transparente indican un problema probablemente debido a una mezcla insuficiente, un pH incorrecto y / o la falta de mantener el colágeno enfriado durante la mezcla.
Las cantidades y los medios de siembra celulares se pueden ajustar. En el protocolo anterior, las cantidades de células encapsuladas se han optimizado para un inserto de 12 pocillos a 7,5 x10 4 fibroblastos y 7,5 x10 5 células endoteliales por mL de colágeno con 1,7 x 105 queratinocitos sembrados en la parte superior de la construcción dérmica. Las densidades celulares se han optimizado para este protocolo VHSE en base a los estudios preliminares y a las investigaciones previas que investigan la generación de redes vasculares 3D en diversas concentraciones de colágeno48 y HSE de generación22,80,81. En sistemas similares, las densidades endoteliales publicadas de la célula son 1,0 x 106 células/mL colágeno48; las concentraciones del fibroblasto se extienden a menudo a partir de la 0,4 x10 5 células/mL del colágeno22,28,82 a 1 x 105 células/mL del colágeno8,58,83,84,85; y las concentraciones de queratinocitos oscilan entre 0,5 x10 5 [células/cm2]80 a 1 x 105 [células/cm2]8. Las densidades celulares se pueden optimizar para células específicas y preguntas de investigación. Los cultivos tridimensionales con células contráctiles, como los fibroblastos, pueden contraerse, lo que conduce a la reducción de la viabilidad y a la pérdida del cultivo86,87. Los experimentos preliminares se deben terminar para probar la contracción del compartimiento cutáneo (que puede ocurrir con más células cutáneas, más células cutáneas contráctiles, culturas de sumersión más largas, o matrices más suaves) y para probar la cobertura superficial epidérmica. Además, el número de días en la sumersión y el índice de ahusamiento el contenido del suero se pueden también personalizar si la contracción cutánea excesiva está ocurriendo o una diversa tarifa de cobertura del keratinocyte se requiere. Por ejemplo, si la contracción se nota durante el período de sumersión dérmica o mientras queratinocitos están estableciendo una monocapa superficial, moviéndose más rápidamente a través del proceso de ahusado sérico y elevando los VHSE a ALI puede ayudar a prevenir la contracción adicional. Del mismo modo, si la cobertura de queratinocitos no es ideal, cambiar el número de días que el VHSE está sumergido sin suero puede ayudar a aumentar la cobertura de monocapa epidérmica y mitigar la contracción ya que el suero se deja fuera. Los cambios en las densidades celulares u otras sugerencias anteriores deben optimizarse para los cultivos específicos y los objetivos de investigación.
Para establecer una estratificación adecuada de la epidermis durante el período de interfaz de líquido de aire (ALI), es fundamental verificar y mantener regularmente los niveles de líquido en cada pozo para que ali y la hidratación adecuada de cada construcción se mantiene a lo largo de la longitud del cultivo. Los niveles de medios deben ser revisados y rastreados diariamente hasta que se establezcan niveles de ALI consistentes. La capa epidérmica debe verse hidratada, no seca, pero no debe haber piscinas de medios en la construcción. Durante ALI, la construcción desarrollará un color blanco / amarillo opaco que es normal. La capa epidérmica probablemente se desarrollará de manera desigual. Comúnmente, los VHSE están inclinados debido a la siembra de colágeno o contracción dérmica. También es normal observar una porción epidérmica más alta en el medio de la construcción en construcciones más pequeñas (tamaño de 24 pozos) y una formación de cresta alrededor del perímetro del VHSE en tamaño de 12 pozos. La contracción de lasconstrucciones 13 puede cambiar estas formaciones topográficas, y/o puede no ser observada en absoluto.
La coloración y la proyección de imagen de VHSEs introducen la manipulación mecánica a los VHSEs. Es muy importante planificar y limitar la manipulación de cada cultura. Cuando la manipulación sea necesaria, mantenga movimientos suaves al retirar los VHSE de las membranas de inserción, al agregar soluciones de tinción o lavado a la superficie de construcción y al retirar y reemplazar los VHSE en sus pozos de almacenamiento/imágenes durante la preparación de la imagen. Específicamente, las capas apicales del componente epidérmico pueden ser frágiles y están en riesgo de desprenderse de las capas epidérmicas basales. Las capas apicales de la epidermis son frágiles y pasan por descamación incluso en el tejido nativo4,pero para un análisis preciso de la estructura epidérmica es importante minimizar el daño o la pérdida. Si las capas epidérmicas se levantan de la construcción, se pueden obtener imágenes por separado. Las capas basales de la epidermis probablemente todavía están unidas a la dermis, mientras que partes de las capas apicales pueden desprenderse. Para la visualización de la epidermis, una mancha nuclear es provechosa en la observación de esto puesto que los núcleos densos son una característica de capas más bajas y medias de la epidermis.
La proyección de imagen confocal de la post-fijación de VHSE se ha discutido en el protocolo, pero es también posible tomar imágenes de los VHSE a través de la cultura vía la tomografía óptica vertical de la coherencia (OCT)88,89,90,91,92,93. Los VHSE son lo suficientemente estables como para soportar imágenes sin incubación ni humidificación durante al menos dos horas sin efectos notables. Como la OCT está libre de etiquetas y no es invasiva, es posible rastrear el grosor epidérmico durante la maduración. Otras modalidades no invasores de la proyección de imagen se pueden emplear probablemente también.
La proyección de imagen volumétrica de las estructuras cutáneas y epidérmicas combinadas puede ser desafiadora debido a la atenuación del laser más profundamente en el VHSE. Esto puede ser mitigado por la proyección de imagen del constructo en dos orientaciones, del lado epidérmico (Figura 1) y del lado cutáneo (Figura 2), permitiendo una buena resolución de las estructuras vasculares dérmicas y de la epidermis. Además, la muestra se puede borrar, lo que permite imágenes volumétricas de toda la estructura con una atenuación mínima. Varios métodos del claro fueron intentados, sin embargo, el método del salicilato del metanol/del metílico descrito rindió los mejores resultados. Los investigadores interesados en optimizar otros métodos de compensación se dirigen hacia estas revisiones49,61,62. Si se limpia, se sugiere obtener una imagen completa de la muestra antes de la limpieza, ya que el método puede dañar los fluoróforos y / o la estructura. Además, la proyección de imagen se debe terminar tan pronto como sea posible después del claro, pues la fluorescencia puede desvanecerse en cuestión de días.
Por motivos de simplicidad y accesibilidad, este protocolo utilizó las mezclas de medios más simples encontradas en la literatura anterior11,80. Aunque hay muchas ventajas en el uso de mezclas de medios simples, también se reconocen las limitaciones de esta opción. Otros grupos han estudiado los efectos de componentes específicos de los medios sobre la salud epidérmica y dérmica y han encontrado que otros aditivos de medios94,como los ácidos grasos/lípidos libres externos, mejoran el estrato córneo de la epidermis y mejoran la función de barrera cutánea. Aunque nuestros marcadores inmunofluorescentes muestren la diferenciación y la estratificación apropiadas en la epidermis, dependiendo de los estudios que son conducidos, la optimización adicional de los medios puede ser necesaria. Además, un análisis extenso del BM epidérmico no fue conducido al evaluar los VHSE presentados aquí. La integridad del BM es una indicación importante de los equivalentes de la piel; diversos grupos han realizado investigaciones sobre la duración del cultivo y su efecto sobre las marcas de BM95, así como análisis de la presencia de fibroblastos y efectos añadidos del factor de crecimiento sobre la expresión de BM14. Es importante tener en cuenta que el análisis del componente BM debe evaluarse y optimizarse cuando se utiliza este protocolo.
En este protocolo se describe un procedimiento para la generación de VHSE, demostrando resultados después de 8 semanas en ALI. Los cultivos de VHSE se han cultivado hasta 12 semanas en ALI sin cambios notables o pérdida de viabilidad, y es posible que puedan ser viables por más tiempo. Importantemente, este protocolo es fácilmente adaptable a los tipos comúnmente disponibles de la célula, según lo demostrado por el reemplazo de fibroblastos cutáneos por los fibroblastos del pulmón IMR90. Dependiendo de la necesidad del investigador y los recursos disponibles, los tipos de células y las mezclas de medios en el cultivo se pueden ajustar, aunque los tipos de células más disímiles pueden requerir la optimización de medios. En resumen, estos procedimientos están destinados a proporcionar claridad sobre el cultivo de VHSE para el estudio de la biología de la piel y la enfermedad. Para maximizar la accesibilidad, el protocolo se desarrolló de manera simple y robusta utilizando equipos comunes, líneas celulares y reactivos como un enfoque efectivo mínimo que se puede personalizar aún más a las necesidades específicas de los estudios de investigación.

La piel humana realiza muchas funciones biológicas esenciales, incluyendo actuar como una barrera inmune / mecánica, regular la temperatura corporal, participar en la retención de agua y funciones sensoriales1,2,3,4. Anatómicamente, la piel es el órgano más grande del cuerpo humano y se compone de tres capas principales (epidermis, dermis e hipodermis) y posee un complejo sistema de componentes del estroma, vascular, glandular e inmune/nervioso además de las células epidérmicas. La epidermis en sí está compuesta por cuatro capas de células que se renuevan continuamente para mantener la función de barrera y otras estructuras de la piel nativa (es decir, sudor y glándulas sebáceas, uñas)3. La fisiología de la piel es importante en la función inmune, la cicatrización de heridas, la biología del cáncer y otros campos, lo que lleva a los investigadores a utilizar una amplia gama de modelos, desde monocultivos in vitro hasta modelos animales in vivo. Los modelos animales ofrecen la capacidad de estudiar toda la complejidad de la fisiología de la piel, sin embargo, los modelos animales comúnmente utilizados, como los ratones, tienen diferencias fisiológicas significativas en comparación con los humanos5. Estas limitaciones, y el aumento del costo de los modelos animales, han llevado a muchos investigadores a centrarse en el desarrollo de modelos in vitro que reflejan más de cerca la fisiología de la piel humana1,6. De éstos, uno de los tipos más simples del modelo es el equivalente epidérmico humano (HEE; también referido como modelos epidérmicos de la piel del mitad-grueso) que se componen solamente de keratinocytes epidérmicos en una matriz cutánea acelular, pero capturan la diferenciación y la estratificación epidérmicas consideradas in vivo. Basándose en esto, los modelos que contienen componentes dérmicos y epidérmicos (queratinocitos y fibroblastos) a menudo se conocen como equivalentes de piel humana (HSE), modelos de piel de espesor completo o construcciones de piel organotípicas (OSC). Brevemente, estos modelos se generan encapsulando células dérmicas dentro de matrices de gel y sembrando células epidérmicas en la parte superior. La diferenciación y estratificación epidérmicas pueden lograrse a través de medios especializados y exposición al aire7. Los equivalentes cutáneos se han generado con mayor frecuencia mediante técnicas de autoensamblaje utilizando geles dérmicos hechos de colágeno tipo I (yasea de cola de rata o de origen piel bovina)1,8,pero modelos similares han incorporado otros componentes de la matriz como fibrina9,10,fibroblastos derivados11, 12,membranas des-epidérmicas cadavéricas13,14,15, 16,geles disponibles comercialmente y otros1,12, 13,17,18,19. Actualmente, hay equivalentes de piel disponibles comercialmente (como se revisó anteriormente1,2). Sin embargo, estos se desarrollan principalmente con fines terapéuticos y no se pueden personalizar fácilmente a preguntas de investigación específicas.
Las HSE se han aplicado en estudios de cicatrización de heridas, injertos, toxicología y enfermedades/desarrollos de la piel11,12,13,16,8,20,21,22,23. Aunque el cultivo 3D modela de forma más exhaustiva las funciones del tejido humano en comparación con los cultivos2D 24,la inclusión de diversos tipos celulares que reflejan con mayor precisión la población in vivo permite realizar estudios de coordinación célula-célula en tejidos complejos24,25,26. La mayoría de las HSE sólo incluyen fibroblastos dérmicos y queratinocitos epidérmicos27,aunque el ambiente de la piel in vivo incluye muchos otros tipos de células. Estudios recientes han comenzado a incluir más poblaciones celulares; éstos incluyen las células endoteliales en vasculatura10,28,29,30,31,32,33,34,adipocytes en tejido subcutáneo35,36,componentes del nervio19,21,células madres27,37,38,células inmunes10,39,40,41,42,y otros modelos específicos de la enfermedad/del cáncer16,40,43,44,45,46,47. Particularmente importante entre estos es la vasculatura; mientras que algunos HSE incluyen células vasculares, en general todavía carecen de elementos capilares integrales con conectividad a través de toda la dermis10,29, estabilidad in vitro extendida28,y densidad de vasos adecuada. Además, los modelos de HSE se evalúan típicamente con el seccionamiento histológico de la post-cultura que limita el análisis de la estructura tridimensional de HSE. El análisis tridimensional permite la evaluación volumétrica de la densidad vascular48,49, así como la variación regional del espesor epidérmico y la diferenciación.
Aunque las HSE son uno de los modelos organotípicos más comunes, hay muchos desafíos técnicos en la generación de estas construcciones, incluida la identificación de densidades celulares y de matriz extracelular apropiadas, recetas de medios, procedimientos adecuados de interfaz de líquidos de aire y análisis posterior al cultivo. Además, mientras que los modelos de HEE y de HSE han publicado protocolos, un protocolo detallado que incorpora vasculatura cutánea y proyección de imagen volumétrica algo que análisis histológico no existe. Este trabajo presenta un protocolo accesible para el cultivo de equivalentes de piel humana vascularizados (VHSE) de líneas celulares principalmente comerciales. Este protocolo está escrito para ser fácilmente personalizable, lo que permite una adaptación directa a diferentes tipos de células y necesidades de investigación. En aras de la accesibilidad, la disponibilidad y el costo, se dio prioridad al uso de productos simples y técnicas de generación sobre el uso de productos disponibles comercialmente. Además, se describen métodos volumétricos sencillos de la proyección de imagen y de la cuantificación que permiten el gravamen de la estructura tridimensional del VHSE. La traducción de este procedimiento en un protocolo robusto y accesible permite a los investigadores no especializados aplicar estos importantes modelos en medicina personalizada, ingeniería de tejidos vascularizados, desarrollo de injertos y evaluación de fármacos.

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-100</td> <td>(Diluido de material de laboratorio)</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehído</td><td>ACROS Organics</td><td>#41678-5000, Lote # B0143461</td><td>Compuesto con paraformaldehído sólido en PBS, pH ajustado a 6.9</td></tr><tr><td>Pinzas autoclavadas</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11295-00</td><td>Pinzas Dumont #5</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Biorreactivos Fisher</td><td>Cat # BP510-250, Lote # 190231</td><td>Rnasa, Dnasa, Línea Celular Libre de Proteasa</td></tr><tr><td>, Endotelial: Célula Endotelial Microvascular (HMEC1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td>SV40 Célula endotelial microvascular inmortalizada. Hay que tener en cuenta que se utilizaron 750.000 células/mL de colágeno.</td></tr><tr><td>Línea celular, Fibroblastos: dérmico Fibroblasto humano, adulto</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>Células dérmicas primarias. Hay que tener en cuenta que se utilizaron 75.000 células/mL de colágeno.</td></tr><tr><td>Línea celular, Fibroblastos: firbroblasto de pulmón humano (IMR90)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>Células embrionarias primarias. Hay que tener en cuenta que se utilizaron 75.000 células/mL de colágeno.</td></tr><tr><td>Línea celular, Queratinocito: N/TERT-1</td><td></td><td></td><td>Inmortalizado a través de la expresión de hTERT. El N/TERT-1 se elaboró utilizando un vector retroviral que confirió resistencia a la higromicina. Línea celular establecida por Dickson et al. 2000. Puede ser reemplazado por ATCC PCS-200-010 o PCS-200-011. Tenga en cuenta que se utilizaron 170.000 celdas por construcción; Las células N/TERT1 deben usarse a partir de placas que tengan un 30% de confluentes: dos placas de cultivo de tejidos de 90 mm con un 30% de confluente proporcionan células más que suficientes. Los autores agradecen al Dr. Jim Rheinwald y a la Dra. Ellen H. van den Bogaard por su generosa donación de líneas celulares N/TERT.</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R</td><td></td> <td>(equipo de laboratorio estándar)</td></tr><tr><td>Software computacional</td><td>MATLAB MATLAB</td><td>2020a</td><td>MathWorks, Natick, MA.</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica TCS SPEII confocal</td><td></td><td>Láser de barrido confocal. Puede ser reemplazado por otros confocales o microscopía de deconvolución.</td></tr><tr><td>Cubreobjetos (22 x 22)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545F</td><td>0,13-0,17 mm Nº 1 Espesor</td></tr><tr><td>Súper pegamento de cianoacrilato o grasa de silicona</td><td>Pegamento Masters</td><td>#THI0102</td><td>Pegamento Masters, GRUESO, Pegamento instantáneo, Cianoacrilato; se prefiere el superpegamento</td></tr><tr><td>Base de medios DMEM</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>REF # 10-013-CM; Lote # 26119007</td><td>DMEM, 1X (Modificación de Dulbecco del medio de Eagle) con 4.5 g/L de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 50/50</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>REF # 10-090-CV; Lote # 21119006</td><td>DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) con L-glutamina</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>#V1101</td><td>(reactivo de laboratorio estándar)</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat # FB12999102, Lote # AE29451050</td><td>Suero bovino fetal de grado de investigación, triple 0.1 mmm estéril</td></tr> filtrado <tr><td>Pinzas de punta fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11295-00</td><td>Pinzas Dumont #5</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico humano (FEAG)</td><td>Peprotech</td><td>Cat # AF-100-15-1MG, Lote # 0318AFC05 D0218</td><td>Compuesto en 0.1% BSA en PBS</td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Alpha Easar</td><td>Lote # 5002F2A</td><td>compuesto en DMSO</td></tr><tr><td>Insulina (humana)</td><td>Peprotech</td><td>Lote # 9352621</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de Contraste de Luz Invertida/Fase</td><td>VWR</td><td>76317-470</td> <td>(equipo de laboratorio estándar)</td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Alfa Aesar</td><td>#AAJ6178806</td><td>Clorhidrato de DL-Isoproterenol, base de medios 98%</td></tr><tr><td>Keratinocyte-SFM (1x)</td><td>Gibco; Corporación Life Technologies</td><td>REF #: 10724-011; Lote # 2085518</td><td>Queratinocito-SFM (1X); medio libre de suero</td></tr><tr><td>Ácido L-Ascórbico</td><td>Fisher Chemical</td><td>Cat # A61-100, Lote # 181977, CAS # 50-81-7</td><td>Cristalino. El ácido L-ascórbico también se puede comprar como sal</td></tr><tr><td>L-glutamina (sólida)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>CAT # BP379-100, LOTE # 172183, CAS # 56-85-9</td><td>L-Glutamina, cristales blancos o polvo cristalino</td></tr><tr><td>MCDB 131 base de medios</td><td>Gen Depot</td><td>CM034-050, Lote # 03062021</td><td>MCDB 131 Base Mediana, Sin L-Glutamina, filtrada</td></tr><tr><td>estéril Punzones metálicos</td><td>Sona Enterprises (SE)</td><td>791LP, 12PC</td><td>Juego de punzones de cuero hueco, acero con alto contenido de carbono, dureza: 48HRC; (varios tamaños incluidos): 1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4". Este juego de punzones es útil, pero el cuchillo x-acto también puede funcionar. El tamaño del punzón de metal que funciona bien para VHSE transwell de 12 pocillos es de 3/8" o 1/2".</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>CAS # 67-56-1</td> <td>(opcional). Paso para eliminar la deshidratación.</td></tr><tr><td>salicilato de metilo</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3695-500; Lote # 164535; CAS # 119-36-8</td> <td>(opcional). Para el desbroce.</td></tr><tr><td>Microtubos, 1,7 mL</td><td>Genesee Scientific Corporation; Olympus Plastics</td><td>Cat # 24-282; Lote # 19467</td><td>Microtubos de 1.7 ml, Transparentes; A prueba de ebullición, polipropileno, ARNasa certificada, ADN, inhibidor de PCR y PBS libre de endotoxinas</td></tr><tr><td>, 10x grado de cultivo o autoclave</td><td>APEX Bioresearch Products</td><td>Cat # 20-134, Lote # 202237</td><td>Tampón PBS, 10x Paquete Seco; Agregue el contenido del paquete en el recipiente y agregue agua a 1 litro para producir 10x concentrado.</td></tr><tr><td>PBS, 1x Grado de cultivo, (-) Calcio, (-) magnesio</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Ref # 25-508; Lote # 07171015</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td> productos <td>APEX Bioresearch sin</td> grado de cultivo <td>Cat # 20-134, lote # 202237</td><td>tampón PBS, 10x paquete seco; agregue el contenido del paquete en el recipiente y agregue agua a 1 litro para producir 10 veces concentrado. Diluir a 1x con agua.</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco; Life Technologies Corporation</td><td>Ref # 15140-122, Lote # 2199839</td><td>Pluma Estreptococo (10,000 Unidades/mL de Penicilina; 10,000 ug/mL de Estreptomicina)</td></tr><tr><td>Placa de Petri, vidrio, pequeño</td><td>Corning</td><td>PYREX 316060</td> <td>(opcional). Para ser utilizado como contenedor de limpieza</td></tr><tr><td>Placas de Petri, 100 mm</td><td>Fisher Scientific FB0875713</td><td></td><td>Uso para la confección de PDMS.</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>GMID 02065622, Lote # H04719H035</td><td>Sylgard 184 Base de elastómero de silicona, Dow Corning, Midland, MI)</td></tr><tr><td></td><td>Dow Corning</td><td>GMID 02065622, Lote # H047JC4003</td><td>DOWSIL 184, Agente de curado de elastómero de silicona</td></tr><td colspan="4">nota: El PDMS se vende generalmente como un kit que incluye los componentes base y del agente de curado.<tr></td></tr><tr><td>Pipetas de desplazamiento positivo (1000 y 250 uL)</td><td>Gilson</td><td>1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L</td><td>capacidad de pipeta M1000 (100-1000 uL); Capacidad de pipeta M250 a 250 uL</td></tr><tr><td>Puntas/pistones de desplazamiento positivo (1000 y 250 uL)</td><td>Gilson</td><td>1000 uL: CAT # F148180, LOTE # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, LOTE # B05549718S</td><td>Capilares y pistones esterilizados Pala</td></tr><tr><td></td><td></td> de<td>punta redonda</td> <td>(opcional; equipo de laboratorio estándar) Para la manipulación de VHSE antes de la obtención de imágenes</td></tr><tr><td>Suplementos para medios</td> <td>de queratinocitos-SFMGibco; Life Technologies Corporation</td><td>Ref # 37000-015, lote # 2154180</td><td>contiene EGF humano recombinante (Cat # 10450-013), extracto de pituitaria bovina (Cat # 13028-014)</td></tr><tr><td>Insertos de placa de cultivo de tejidos, tamaño de 12 pocillos, 3 y micro; m tamaño de poro</td><td>Corning; Costar</td><td>REF # 3462 - Claro; Lote # 14919057</td><td>Transwell; Insertos de 12 mm de diámetro, tamaño de poro de 3.0 mmm, tratamiento con cultivo de tejidos, membrana de poliéster, placas de poliestireno, etc.;</td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos,</td><td>Greiner Bio-one de 12 pocillos; CellStar</td><td>Gato # 665 180; Lote # E18103QT</td><td>placa de cultivo celular de 12 pocillos; estéril, con tapa; los productos son estériles, libres de Dnasa, Rnasa, ADN humano y pirógenos detectables. Contenido: placas de cultivo de tejidos no citotóxicas</td></tr><tr><td>, área de crecimiento de 60,8 cm ^ 2</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Cat # 25-202; Nº de lote: 191218-177B</td><td>Placas de cultivo de tejidos; tratado, área de crecimiento 60,8 cm^2; estéril, Dnasa, Rnasa, Libre de pirógenos; poliestireno virgen</td></tr><tr><td>Triton x 100</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>Cat # 8698.5-16, Lote # 4708R34</td><td>Agente humectante</td></tr><tr><td>Tripsina 0.25%</td><td>Corning; Mediatech, Inc</td><td>Ref # 25-053-CI</td><td>0.25% Tripsina, 2.21 mM EDTA, 1x [-] bicarbonato de sodio</td></tr><tr><td>Tipo 1 Colágeno aislado de cola de rata</td> Las colas de rata de <td>Pel-Freez Biologicals</td><td>56054-1</td><td>Sprauge-Dawley se pueden comprar congeladas de Pel-Freez u otros proveedores. El colágeno se puede aislar de los tendones de la cola. Referencias del protocolo de aislamiento [Cross et al.,2010; Rajan et al.,2007; Bornstein, 1958]. Alternativamente, el colágeno de cola de rata de alta concentración se puede comprar a proveedores como Corning (Número de catálogo: 354249)</td></tr><tr><td>Cámara de vacío, sobremesa</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-0000</td> <td>(equipo de laboratorio estándar)Cuchillo</td></tr> de <tr><td>precisión de mano</td><td>X-Acto</td><td>X3311</td> <td>(cuchillo X-Acto opcional si se compran punzones de acero)</td></tr></tbody></table>

generación de equivalentes de piel humana vascularizada autoensamblada

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Los equivalentes de piel humana (HSE) son construcciones de ingeniería tisular que modelan componentes epidérmicos y dérmicos de la piel humana. Estos modelos se han utilizado para estudiar el desarrollo de la piel, la cicatrización de heridas y las técnicas de injerto. Muchos HSE continúan careciendo de vasculatura y se analizan además con la seccionamiento histológico de la poste-cultura que limita el gravamen volumétrico de la estructura. Se presenta aquí un protocolo directo que utiliza materiales accesibles para generar los equivalentes humanos vascularizados de la piel (VHSE); se describen más a fondo las técnicas volumétricas de la proyección de imagen y de la cuantificación de estas construcciones. Brevemente, los VHSE se construyen en 12 inserciones de cultivo de pozos en los que las células dérmicas y epidérmicas se siembran en gel de colágeno tipo I de cola de rata. El compartimento dérmico se compone de fibroblastos y células endoteliales dispersas a lo largo del gel de colágeno. El compartimento epidérmico se compone de queratinocitos (células epiteliales de la piel) que se diferencian en la interfaz aire-líquido. Es importante destacar que estos métodos son personalizables en función de las necesidades del investigador, con resultados que demuestran la generación de VHSE con dos tipos diferentes de células fibroblásticas: fibroblastos dérmicos humanos (hDF) y fibroblastos pulmonares humanos (IMR90s). Los VHSE fueron desarrollados, fotociroscópicos con microscopia confocal, y analizados volumétricamente usando software de cómputo en 4 - y 8 puntos de tiempo de la semana. Un proceso optimizado para fijar, para manchar, para imaginar, para la imagen, y para borrar VHSEs para la examinación volumétrica se describe. Este modelo integral, imágenes y técnicas de análisis son fácilmente personalizables para las necesidades específicas de investigación de laboratorios individuales con o sin experiencia previa en HSE.

La meta de este protocolo es describir la generación y el análisis volumétrico de los equivalentes humanos vascularizados de la piel usando las técnicas accesibles y simples para la cultura a largo plazo. En la medida de lo posible, se describe la justificación de los pasos para permitir a los investigadores la capacidad de personalizar en función de sus necesidades de investigación.

Generación de equivalentes de piel humana vascularizada autoensamblada

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

El detalle proporcionado en este protocolo, aborda la generación equivalente de la piel humana, que a menudo es técnicamente desafiante. Los elementos equivalentes nuevos del protocolo de la piel humana, tales como vasculatura y proyección de imagen volumétrica se incluyen. La técnica permite la construcción directa de un modelo de piel que se ajusta más al tejido in vivo para el estudio de enfermedades, el envejecimiento y la medicina personalizada.La parte más desafiante de este protocolo es una transición entre la sumersión y la interfaz aire-líquido. Es probable que se necesitarán algunos ensayos para optimizar el tiempo y los niveles de medios para obtener resultados consistentes. Para comenzar, agregue 516 microlitros de medios a un tubo tapado en frío, e inmediatamente agregue 375 microlitros de colágeno frío usando la pipeta de desplazamiento positivo de 1000 microlitros.Retire la punta de la pipeta vacía y cambie a la pipeta de desplazamiento positivo de 250 microlitos preparada para mezclar. Mezcle rápidamente, pero suavemente para evitar la formación excesiva de burbujas. Manteniendo la punta en la solución, mezcle uniformemente desde diferentes posiciones del tubo hasta que la solución sea de color homogéneo, lo que típicamente toma unos cinco ciclos de pipeta o 10 segundos.Dispersa inmediatamente 125 microlitros de colágeno acelular sobre la membrana del inserto de cultivo de 12 pocillos. Para garantizar una cobertura uniforme, incline la placa y use la punta de la pipeta para pintar la membrana extendiendo suavemente el colágeno alrededor. Mueva inmediatamente la placa de 12 pozos a una incubadora de cultivo celular Celsius de 37 grados para dejar que se gelifique durante al menos 20 minutos.Después del período de gelificación, saque la placa de 12 pocillos de colágeno acelular de la incubadora. Retire el tubo tapado de 1,7 mililitros del hielo húmedo, luego retire el colágeno común de la refrigeración y colóquelo en hielo húmedo con la tapa abierta. Agregue 516 microlitros de suspensión de celda enfriada al tubo tapado en frío.Use la pipeta de 1000 microlitros para pipetear inmediatamente 375 microlitros de solución fría de colágeno directamente en la solución dentro del tubo tapado. Expulse todo el colágeno de la pipeta en el tubo y deseche la punta de la pipeta de desplazamiento positivo. Cambie inmediatamente a la pipeta de 250 microlitros y mezcle la solución de colágeno Una vez mezclada, transfiera 250 microlitros de solución de colágeno celular a los soportes de colágeno acelular en el inserto de cultivo de 12 pocillos, luego mueva la placa de 12 pocillos a una incubadora de cultivo celular de 37 grados Celsius.Después del tiempo de gel de 30 minutos, incline suavemente la placa para evaluar la gelificación y asegúrese de que el colágeno se haya solidificado. Agregue 500 microlitros y 1000 microlitros de medios de mezcla a la cámara superior y la cámara inferior del inserto, respectivamente. Asegúrese de que el gel de colágeno esté sumergido, agregando más medios si es necesario.Coloque la placa del pozo en la incubadora de cultivo celular para la incubación durante la noche. En el séptimo día de inmersión, utilice una pipeta manual para recoger y descartar medios de la cámara inferior y superior de cada pozo de construcción. Para recoger los medios atascados directamente debajo de la membrana permeable, coloque la punta de la pipeta debajo de la membrana, golpeando el inserto fuera de lugar temporalmente.Agregue un mililitro de equivalente de piel humana o medios HSE complementados con 5% FPS a la cámara inferior de cada pozo y 200 microlitros de suspensión celular a la cámara superior de cada pozo. Sembra los queratinocitos directamente sobre la superficie de construcción dérmica y permitir que se asienten durante dos horas en la incubadora. Dos horas después de sembrar los queratinocitos, agregue cuidadosamente 300 microlitros de medios HSE, complementados con 5% FPS a la cámara superior de cada pozo de construcción.Después de cargar el medio, vuelva a colocar la construcción en la incubadora. Usando una pipeta manual, levante cada construcción a su interfaz aire-líquido, o ALI, eliminando los desechos de medios de la cámara superior solamente. Trate de acercarse lo más posible a la capa epidérmica sin tocarla ni dañarla.Incline las placas ligeramente en diferentes ángulos para recoger el medio, luego agregue aproximadamente dos mililitros de agua estéril a los pozos circundantes en la placa para mantener una humedad constante. Revise la placa unas horas más tarde para asegurarse de que los queratinocitos todavía están en la LPA. Retire cualquier medio en la cámara superior, haciendo un seguimiento de la cantidad de medios que se eliminan de cada pozo.Las capas epidérmicas deben verse hidratadas, no secas, pero no debe haber medios agrupados en la parte superior de la construcción. Para preparar la construcción para la tinción inmunofluorescente, gire un inserto al revés y colócalo sobre su pozo en la placa del pozo. Estabilice el inserto con una mano mientras usa pórceps de punta fina o un cuchillo de precisión para cortar aproximadamente la mitad de la circunferencia de la membrana.Corte lo más cerca posible de la carcasa de plástico. Usando los pórceps de punta fina, agarre el borde de la aleta de la membrana cortada y desprenda suavemente la membrana porosa del inserto, así como la construcción VHSE. Si la construcción se atasca en el lado de la cámara, use las puntas finas o una pequeña cápula para moverla al pozo.Una vez que el VHSE esté en el pozo, deseche cualquier pieza restante de la membrana del inserto y mantenga la carcasa del inserto de cultivo en cada pozo para mantener los VHSE en una posición sumergida durante la tinción. Dos días antes de la toma de imágenes, prepare polidimetilsiloxano o PDMS. Coloque cualquier recipiente de mezcla limpio en una balanza de pesaje y tara la báscula.Agregue la base y, a continuación, agregue el reticulador. Revuelva la solución vigorosamente durante al menos cuatro minutos, creando pequeñas burbujas. Después de mezclar lo suficiente, vierta el PDMS en una placa de Petri de 90 o 100 milímetros.Desgasificar el PDMS en una cámara de vacío hasta que todas las burbujas desaparezcan y el PDMS esté claro. Suelte el vacío lentamente y retire el PDMS. Coloque el plato en un horno para curar durante la noche a 50 a 60 grados Celsius, asegurándose de que el plato esté sentado plano para que PDMS cure uniformemente.Un día antes de la toma de imágenes, use un punzón de acero o un cuchillo de precisión de mano para perforar o cortar un pozo circular de la hoja PDMS, aproximadamente del mismo tamaño que la construcción VHSE. Corte un parche cuadrado alrededor del pozo circular para crear un solo pozo PDMS. Usando un resbalón de cubierta de vidrio de un tamaño similar al del PDMS, agregue pegamento de cianocrilato a la superficie inferior del PDMS y unte uniformemente con una punta de pipeta desechable.Centre el vidrio y presione sobre el PDMS bien mientras deja una ventana de vidrio transparente dentro del círculo perforado. Deje secar el pegamento durante la noche antes de usarlo. La caracterización de la epidermis y de la dermis muestra marcadores inmunofluorescentes apropiados para la piel humana en las construcciones de VHSE.Cytokeratin 10 es un marcador temprano del keratinocyte de la diferenciación que marca generalmente todas las capas suprabasal en equivalentes de la piel. La involucrina y la filaggrina son marcadores de diferenciación tardía en queratinocitos y marcan las capas superiores más suprabasales en los equivalentes de la piel. La limpieza del VHSE permitió la proyección de imagen directa en un ajuste y eliminó la necesidad de reorientar la construcción para imaginar la dermis y la epidermis por separado.Las imágenes volumétricas permiten generar representaciones 3D para mapear la vasculatura a lo largo de cada construcción. Las pilas de imágenes se cargaron en software computacional y se utilizó un algoritmo personalizado para la representación y cuantificación 3D. El Skeletonization determinó el centro definitivo de cada recipiente IV-marcado colágeno y los datos resultantes fueron utilizados para calcular diámetro del recipiente así como la fracción vascular.Después de este procedimiento, los métodos de caracterización tales como análisis de la barrera, microscopia electrónica de la exploración, perfiles del lípido, y otros se pueden realizar para entender cómo la vasculatura afecta específicamente a la maduración y a la estabilidad epidérmicas. Este protocolo permite estudios tejido-relevantes y tipo-específicos de la célula en un modelo vascularizado de la piel. Es particularmente adecuado para la investigación en el envejecimiento y la medicina personalizada.

generation-of-self-assembled-vascularized-human-skin-equivalents

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este video describe el protocolo detallado para generar reconstrucciones organotípicas de piel en 3D in vitro para estudiar la progresión del melanoma. Este modelo de piel imita tanto la arquitectura como la complejidad multicelular de los órganos in vivo.

Generación de reconstrucciones organotípicas de piel completa: un procedimiento para establecer un modelo de piel en 3D utilizando muestras de piel humana

La vascularización es clave para enfoques en la ingeniería de tejidos éxito. Por lo tanto, se requieren tecnologías fiables para evaluar el desarrollo de las redes vasculares en los tejidos-construcciones. Aquí presentamos un método simple y rentable para visualizar y cuantificar la vascularización in vivo.

Una piel llena de defectos modelo para evaluar la vascularización de Biomateriales<em&gt; En Vivo</em

A continuación, presentamos un protocolo para generar ingeniería tisular injertos de vasos que son funcionales para el injerto en ratones por doble siembra de células madre pluripotentes inducidas parcialmente (PIPSC) - deriva células musculares lisas y PIPSC - células endoteliales derivadas de un biorreactor andamio buque descelularizado.

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

El objetivo de este protocolo es construir un equivalente de piel tridimensional de espesor completo, que se asemeje a la piel natural. Con un dispositivo de herida automatizado específicamente construido, se pueden generar heridas precisas y reproducibles bajo el mantenimiento de la esterilidad.

Generación de una tridimensional grosor de la piel completa y automatizada Equivalente Heridas

El objetivo de este artículo es proporcionar un protocolo completo y detallado sobre cómo generar piel organotípica humana modificada genéticamente a partir de queratinocitos epidérmicos y dermis humana desvitalizada.

Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

Proponemos un protocolo que muestra cómo distinguir keratinocytes derivados de células madre pluripotentes inducidas y fibroblastos y generar un organoide de piel 3D, usando estos queratinocitos y fibroblastos. Este protocolo contiene un paso adicional de generar un modelo de ratones humanizados. La técnica presentada aquí mejorará la investigación dermatológica.

Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

Este protocolo describe un método sencillo para cultivar epidermis humana reconstituida tridimensional de una manera reproducible y robusta. Además, caracteriza la relación estructura-función del modelo de barrera epidérmica. Las respuestas biológicas de la epidermis humana reconstituida sobre estímulos proinflammatory también se presentan.

El cultivo de una epidermis humana reconstruida tridimensional a gran escala

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo tridimensional de piel simplificado e indiferenciado utilizando una plataforma microfluídica micromecanizado. Un enfoque de flujo paralelo permite la deposición in situ de un compartimento dérmico para la siembra de células epiteliales en la parte superior, todo controlado por bombas de jeringa.

Generación de un modelo tridimensional simplificado de piel en un chip en una plataforma microfluídica micromecanizado

Este protocolo describe la generación de vasos sanguíneos autoorganizados a partir de células madre pluripotentes humanas y pluripotentes inducidas. Estas redes de vasos sanguíneos exhiben una red endotelial extensa y conectada rodeada de pericitos, actina del músculo liso y una membrana basal continua.

Generación de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de células madre pluripotentes

Aquí, presentamos procedimientos económicos y simples para introducir varios modelos de piel en 3D para la investigación de rutina en un laboratorio de cultivo celular. Los investigadores pueden crear modelos adaptados a sus necesidades sin depender de modelos disponibles en el mercado.

Creación de modelos de piel para numerosas aplicaciones, desde el monocultivo bidimensional (2D) hasta el multicultivo tridimensional (3D)

Este protocolo describe un método para producir organoides cutáneos que contienen folículos pilosos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos utilizando un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido plano y fisiológicamente relevante para replicar la arquitectura y función de la piel.

Generación de organoides cutáneos planos con cabello derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos mediante un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido

Aprenda a generar equivalentes de piel humana vascularizada con técnicas de cultivo a largo plazo. Este método permite estudiar enfermedades, envejecimiento y medicina personalizada con modelos fisiológicamente relevantes.

Generación de equivalentes de piel humana vascularizada autoensamblada

Explorar más videos