Un ensayo basado en placas para la medición de la liberación endógena de monoamina en cortes cerebrales agudos

Esta técnica es una adaptación de los métodos comúnmente utilizados para examinar la liberación de monoamina, lo que permite la medición de la liberación endógena en lugar de monoaminas radiomarcadas precargadas bajo múltiples condiciones farmacológicas a la vez. Las principales ventajas de esta técnica son que es bastante rentable, se pueden examinar múltiples condiciones farmacológicas a la vez, y podemos estudiar la liberación endógena de monoamina con la capacidad de distinguir entre liberación mediada por vesiculares y transportadores. Para preparar rebanadas cerebrales de ratas macho adultas de 250 a 350 gramos después de la cosecha, inmediatamente colocó el cerebro y el tampón de disección oxigenada helada, y adquirió secciones cerebrales coronales de 300 micras de cada región de interés.

Para una mayor disección de las rebanadas cerebrales, mueva cuidadosamente los tejidos a portaobjetos de vidrio y use un atlas cerebral de rata para identificar el estriado dorsal en función de su estructura estriada oscura, y para identificar el hipocampo en función de su proximidad a la corteza y su estructura espiral única. Separar los hemisferios derecho e izquierdo para su uso como cortes de control y experimentales. El estriado dorsal se puede diseccionar aún más en punzones de dos milímetros.

Luego use una pipeta de transferencia de plástico con una punta modificada para transferir las muestras a pequeños recipientes sumergidos en tampón de disección helado oxigenado con burbujeo de oxígeno. Para inducir la liberación de monoamina, transfiera las muestras de tejido a cada pozo de una cámara de eflujo de 48 pocillos hecha a medida que contenga de 0.5 a un mililitro de tampón de eflujo por pozo con burbujeo suave constante y permita que las muestras se recuperen durante 30 a 50 minutos a 37 grados Centígrados. Al final del período de equilibrio, mueva el soporte de tejido con tejido cerebral a pozos que contengan 500 microlitros de tampón de eflujo oxigenado con o sin agente farmacológico, golpeando el soporte en el borde del pozo para evitar la transferencia mínima de tampón entre pozos durante una incubación de 20 minutos a 37 grados centígrados.

Al final de la incubación, mueva el soporte a un nuevo conjunto de pocillos que contengan 500 microlitros de tampón de eflujo con o sin el medicamento de interés y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 20 minutos adicionales. Durante la segunda incubación, transfiera la solución de los pocillos de la primera incubación a tubos de microcentrífuga que contengan 50 microlitros de un ácido perclórico o fosfórico normal en hielo, y etiquete los tubos número uno"Al final de la segunda incubación, mueva el soporte de tejido a pozos vacíos con la placa sobre hielo y transfiera los sobrenadantes de la segunda incubación a nuevos tubos de microcentrífugos que contengan 50 microlitros de un perclórico o fosfórico normal ácido sobre hielo. Etiquete estos tubos como número dos"Cuando todos los sobrenadantes hayan sido transferidos, agregue un mililitro de tampón de disección helada a cada pocillo de tejido y use pinzas pequeñas para transferir cada muestra de tejido a un nuevo tubo de microcentrífuga.

Retire el tampón de los tubos de muestra y almacene los tejidos a menos 80 grados centígrados, luego transfiera las soluciones de incubación recolectadas a los tubos de filtro de microcentrífugas para centrifugación y coloque el filtrado en hielo hasta el análisis de HPLC. Establezca el potencial del ECD y el caudal según la recomendación del fabricante para detectar monoaminas. Carga y alícuota apropiada de cada muestra, incluidos los estándares de neurotransmisores en el HPLC para autoinyección y detección, y permiten que el instrumento complete el análisis.

Luego use el software de análisis HPLC para adquirir y analizar los datos del cromatógrafo utilizando una curva estándar compuesta por cada monoamina para obtener el área bajo la curva según las pautas del fabricante. Después de seis horas de análisis funcional, las muestras de tejido siguen siendo viables, mientras que las muestras incubadas con 1%Triton X-100 demuestran una reducción significativa en la transformación de MTT. El tratamiento agudo de 20 minutos de las secciones cerebrales del hipocampo y la corteza prefrontal con anfetamina induce un aumento significativo en el nivel extracelular de cada monoamina.

Cuando las muestras se tratan previamente con fluoxetina, un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina, el aumento inducido por la anfetamina en la serotonina extracelular dentro del hipocampo y la corteza prefrontal no ocurre, mientras que el aumento en la producción extracelular de dopamina y norepinefrina no se ve afectado. Además, el tratamiento agudo de 20 minutos de los punzones de estriado dorsal con anfetamina induce un aumento de 35 veces en la expresión del nivel de dopamina extracelular, mientras que el tratamiento con punzón estriado dorsal con cocaína, un bloqueador transportador de monoamina, da como resultado una inhibición significativa de la dopamina extracelular inducida por anfetamina. El aumento de la concentración de cloruro de potasio extracelular para evocar la despolarización de la membrana es suficiente para inducir la liberación exocitótica de monoaminas en comparación con las condiciones de control no tratadas, y ni la fluoxetina ni el tratamiento con cocaína bloquean este aumento inducido por la polarización profunda.

Es imperativo tener secciones de corte limpias, una localización precisa de los punzones y mantener una oxigenación constante durante todo el experimento. Las secciones cerebrales se pueden utilizar después de la experimentación para un mayor procesamiento y análisis bioquímico, como western blotting e histología.