Name: Análisis sistemático de puntuación para la inflamación intestinal en un modelo de colitis inducida por sulfato de sodio de dextrano de murina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende a realizar un análisis sistemático de puntuación histológica para evaluar la gravedad de la colitis inducida por DSS en murinos. Este protocolo cuantitativo permite medir lesiones y ulceraciones mucosas de forma objetiva y reproducible en todo el colon.

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Los autores desean reconocer el apoyo de la financiación de los NIH DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 y los Servicios de Escaneo de Diapositivas patológicas de la Universidad de Michigan.

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Michigan.
1. Cosecha de tejidos
<ol><li>Eutanasia ratones humanamente usando anestesia isoflurano seguida de dislocación cervical, de acuerdo con los protocolos aprobados. Para todos los experimentos con animales, la aprobación fue obtenida por una junta de revisión certificada de acuerdo con las directrices nacionales e institucionales para el manejo de animales.</li>
	<li>Coloque el ratón en una almohadilla de disección en una posición supina. Inmovilizar las extremidades del ratón utilizando agujas G de 20 G x 1 1/2 pulgada G.</li>
	<li>Usando fórceps y tijeras, haz una pequeña incisión en la piel abdominal y tira de ella hacia un lado para exponer el peritoneo.</li>
	<li>Abra la cavidad abdominal con una incisión de línea media en el peritoneo desde el hueso púbico hasta los lados del abdomen.</li>
	<li>Retire cuidadosamente los tejidos y órganos hasta que se visualice el intestino grueso. Corte el hueso pélvico a ambos lados del colon para visualizar completamente el órgano, extendiéndose desde el ano hacia el cecum.</li>
	<li>Retire suavemente la grasa, las venas pequeñas y las arterias unidas al colon, mientras disecciona cuidadosamente el órgano, cortando sólo proximal al ano y simplemente distal al cecum. NOTA: El colon diseccionado debe permanecer a temperatura ambiente mientras se completa el procedimiento de balanceo suizo.</li>
	<li>Enjuague cuidadosamente el colon con 1x PBS, utilizando una aguja de gavage de plástico flexible insertada a través del ano para eliminar el contenido fecal.</li>
	<li>Coloque el colon en línea recta y abra longitudinalmente a lo largo de la arteria mesenterica. Bisect el colon longitudinalmente desde el distal hasta el extremo proximal (Figura 1A). La mitad del tejido se puede utilizar para el análisis histológico, mientras que el otro se puede procesar para la mancha occidental, PCR o enrollado en un segundo rollo suizo para la microscopía de inmunofluorescencia congelada fresca12.</li>
</ol>2. Preparación de rollos suizos
<ol><li>Recorte el tejido adicional del colon proximal usando una cuchilla de afeitar hasta que se obtenga aproximadamente la misma anchura a lo largo de la longitud de todo el colon.</li>
	<li>Alinee el colon para exponer el lúmenes de frente hacia arriba, y aplane el tejido completamente usando una aguja de gavage flexible. Agregue más PBS, si es necesario, para mantener el tejido húmedo durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Retire el exceso de PBS con una toallita de papel. Con una aguja de jeringa y gavage, agregue una solución de formalina tamponada neutra al 10% sobre el tejido durante 2-3 minutos para arreglar y aplanar el tejido.</li>
	<li>Utilice fórceps rectos para agarrar el extremo del dos punto distal y girar el dos punto en círculos concéntricos desde el extremo distal hasta el proximal (Figura 1B). NOTA: Es posible empujar hacia atrás el interior del rollo suizo mientras se enrolla usando el dedo índice para asegurarse de que el tejido está dentro del rollo.</li>
	<li>Inserte una aguja de 27 G para fijar el colon en el medio para mantener su forma de rollo suizo (Figura 1C).</li>
	<li>Coloque el rollo suizo con la aguja en un casete de incrustación dentro de un recipiente histológico de la muestra. NOTA: El tejido debe orientarse en paralelo con respecto al cassette antes de la fijación (Figura 1D).</li>
	<li>Fijar el tejido en 10% solución de formalina amortiguada neutra durante la noche a 4 °C13.</li>
	<li>Después de la fijación durante la noche, lave el tejido 3 veces con PBS.</li>
	<li>Agregue un 70% de etanol al tejido antes del proceso de incrustación de parafina. Retire la aguja del rollo suizo antes de continuar. El tejido se puede almacenar en etanol a temperatura ambiente hasta la incrustación de parafina13.</li>
	<li>Coloque las muestras en el procesador de tejido, incrustadas en parafina, y prepare secciones de 4 μm, montadas en diapositivas de microscopía cargadas positivamente(Figura 1E). Esto puede ser un punto de parada opcional. NOTA: La orientación adecuada del tejido es fundamental para lograr secciones adecuadas para el análisis de imágenes. La incrustación paralela del rollo suizo en el casete de parafina dará como resultado secciones completas apropiadas para el análisis de imágenes (Figura 1F-1H). Se deben evitar secciones oblicuas para evitar secciones incompletas (Figura 1I-1K). Para obtener más información, consulte la sección Discusión.</li>
	<li>Mancha secciones con hematoxilina y eosina (H&amp;E)13.</li>
</ol>3. Escaneo y análisis digital
NOTA: Para una evaluación precisa de los cambios de la mucosa, seleccione solo las secciones que incluyan al menos el 90% de la longitud total del colon.
<ol><li>Escanee secciones manchadas utilizando un escáner de diapositivas o un imager (consulte Tabla de materiales). Las imágenes producidas necesitan una resolución de 0,25 micras por píxel con un objetivo de 40x y una ampliación de 40x.</li>
	<li>Instale y descargue un software adecuado para el análisis digital de diapositivas escaneadas (consulte Tabla de materiales).</li>
	<li>Abra imágenes escaneadas en el software de procesamiento de imágenes (Figura 2A). Compruebe que todo el punto es visible y que no faltan áreas de la muestra.</li>
	<li>Active las herramientas de imager de etiquetas y barra de escala para identificar correctamente las diapositivas escaneadas haciendo clic en Label imager (Figura 2A).</li>
	<li>Abra la herramienta de anotaciones haciendo clic en Anotaciones(Figura 2A) y cree 3 capas diferentes haciendo clic en Nueva capa (Figura 2B) para cuantificar la longitud total del rollo suizo, inflamación / lesión, y erosión / ulceración. Elija un color diferente para cada capa haciendo clic en Color de capa ( Figura2B).</li>
	<li>Mida la longitud de cada capa/categoría haciendo clic en la herramienta Pluma(Figura 2A),utilizando la mucosa muscularis como referencia:<ol>
<li>Ver la imagen a 400 μm zoom (o más) para facilitar la visualización adecuada de la mucosa muscularis. NOTA: La ampliación se controla fácilmente utilizando la rueda de desplazamiento del ratón y tendrá que ajustarse según sea necesario mientras se mueve a través de la sección para dibujar todas las líneas.</li>
		<li>Haga clic en la herramienta Pluma para dibujar una línea siguiendo la mucosa muscularis(Figura 2A). Mueva el puntero según sea necesario para visualizar el área adyacente para su análisis. NOTA: Cada vez que se detenga el lápiz, se generará una nueva región de capa pequeña. Se puede visualizar y editar con la pestaña Regiones de capa (seleccione el segmento deseado y haga clic en Eliminar capa en caso de errores o correcciones, Figura 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Una vez definidas todas las capas(Figura 2C),exporte los datos mediante el botón Exportar cuadrícula a archivo de texto dentro de las opciones de regiones de capa ( Figura2B). NOTA: Guarde archivos a menudo mientras crea las capas para asegurarse de que los datos se almacenan correctamente.</li>
	<li>Abra los archivos de texto y copie los datos con un software de hoja de cálculo. Totalizar todos los segmentos de cada región y calcular el porcentaje de lesiones y ulceración con respecto a la longitud total.</li>
	<li>Para calcular la Puntuación de Colitis Histológica (HCS) y evaluar la gravedad de la enfermedad, considere tres características principales como se detalla a continuación.<ol>
<li>Compruebe si hay mucosa intestinal saludable que se caracteriza por células epiteliales organizadas en el eje cripta-luminal, propria lamina con pocas células inmunes, y mucosa musculares subyacentes que interconecta la mucosa y la submucosa(Figura 3A).</li>
		<li>Compruebe si hay inflamación/lesión que se caracteriza por criptas epiteliales atenuadas o parcialmente faltantes de células epiteliales e inflamación mucosa con infiltración de neutrófilos en criptas (Figura 3B).</li>
		<li>Compruebe la presencia de erosión/ulceración que se caracteriza por áreas desprovistas de epitelio superficial o zonas completamente carentes de criptas epiteliales con o sin leucocitos asociados(Figura 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Calcule el HCS de las regiones lesionadas y ulceradas expresadas como porcentaje de la longitud total en la siguiente fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62135/62135eq01v2.jpg"> NOTA: El HCS combina el porcentaje de inflamación/lesión y erosión/ulceración añadiendo un factor de dos a este último, basado en una suposición razonable de que la pérdida completa del epitelio resulta en la pérdida máxima de la integridad de la barrera y, por lo tanto, en una enfermedad peor. El HCS representa constantemente los cambios morfológicos causados por la colitis experimental inducida por DSS. Curiosamente, no hemos visto una correlación clara entre el número de agregados linfoides colonicos o folículos y la gravedad de la enfermedad clínica en la colitis del SDS y, por lo tanto, no incluimos la cuantificación en este análisis.</li>
	<li>Tome una instantánea de las imágenes representativas (haga clic en Instantánea, Figura 2A)y guárdela. Incluya barras de escala si es necesario haciendo clic en Mostrar u ocultar barra de escala ( Figura2A).</li>
</ol>

<ol><li>Kagnoff, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelium+is+an+integral+component+of+a+communications+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelium is an integral component of a communications network.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).</li>
<li>Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+intestinal+barrier+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).</li>
<li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Crohn's disease.</a> Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li>
<li>Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Ulcerative colitis.</a> Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).</li>
<li>Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+dextran+sulfate+sodium+load+on+the+severity+of+inflammation+in+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).</li>
<li>Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+murine+colitis+induced+by+dextran+sulfate+sodium+of+different+molecular+weights%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights.</a> Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).</li>
<li>Mahler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+inbred+mouse+strains+to+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).</li>
<li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).</li>
<li>Kozlowski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entirely+automated+method+to+score+DSS-induced+colitis+in+mice+by+digital+image+analysis+of+pathology+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).</li>
<li>Perse, M., Cerar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sodium+sulphate+colitis+mouse+model%3A+traps+and+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617(2012).</li>
<li>Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Animal models of inflammatory bowel disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).</li>
<li>Flemming, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmocollin-2+promotes+intestinal+mucosal+repair+by+controlling+integrin-dependent+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).</li>
<li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLuna%2C+LG+%22Armed+Forces+Institute+of+Pathology+%28U.S%29+%26+Armed+Forces+Institute+of+Pathology+%28U.S.%29.+Manual+of+Histologic+Staining+Methods+of+the+Armed+Forces+Institute+of+Pathology.+3d+edn%22">Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn</a>. , Blakiston Division. (1968).</li>
<li>Kelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+epithelium-expressed+sialyl+Lewis+glycans+improves+colonic+mucosal+wound+healing+and+protects+against+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis.</a> The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).</li>
<li>Reed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+CD47+is+critical+for+mucosal+repair+in+the+murine+intestine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo.</a> Nature Communications. 10 (1), 5004(2019).</li>
<li>Laukoetter, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM-A+regulates+permeability+and+inflammation+in+the+intestine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).</li>
<li>Khounlotham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+intestinal+epithelial+barrier+induces+adaptive+immune+compensation+that+protects+from+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis.</a> Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestro sistema de puntuación de colitis histológica constituye una herramienta confiable para cuantificar la inflamación del tejido y el daño en el intestino. Este enfoque proporciona una mejor comprensión del estado histopatológico de todo el órgano sin el sesgo de seleccionar áreas pequeñas o secciones incompletas. Entre los pasos críticos para ejecutar con éxito este protocolo se encuentran la preparación adecuada de rollos suizos que permiten el análisis de al menos el 90% de la longitud del colon; orientación paral...

La barrera epitelial gastrointestinal desempeña un papel fundamental en la separación de antígenos luminales y patógenos de los compartimentos de tejido subyacentes1. Las lesiones epiteliales y las heridas mucosas observadas en condiciones patológicas como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la isquemia o lesiones quirúrgicas están asociadas con síntomas clínicos que incluyen diarrea, pérdida de peso, sangre en las heces y dolor abdominal. En respuesta a lesiones, las células epiteliales migran y proliferan para volver a epitelializar y reparar defectos de barrera mucosa. La resolución de la inflamación y restitución de la integridad mucosa son cruciales para restablecer la homeostasis mucosa intestinal y la función2,3,4.
Se han empleado varios modelos animales para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes que están asociados con el daño a la barrera epitelial intestinal. Modelos bien establecidos y fácilmente aplicables de colitis inducida químicamente son ampliamente utilizados, particularmente en estudios relacionados con lesiones inflamatorias como la EII. Un modelo de colitis de murina común, reproducible y confiable emplea sulfato de sodio dextrano (DSS) mediación de lesiones en colones e inflamación. La gravedad de la enfermedad varía dependiendo de la cepa del ratón, dosis de DSS, duración de la administración del SSD y peso molecular del DSS5,6,7.
El daño de la mucosa intestinal durante la colitis del SDS generalmente se evalúa utilizando el Índice de Actividad de la Enfermedad (DAI, por suspens), una puntuación compuesta determinada por la pérdida de peso, el contenido de sangre fecal y la consistencia de las heces. El contenido sanguíneo fecal puede ser microscópico (detectado usando una prueba de ácido guaiac de heces) o macroscópico; consistencia fecal se clasifica como dura, suave o líquida (es decir, diarrea)5,8. La puntuación de estos parámetros clínicos puede ser subjetiva y puede variar dependiendo de la experiencia y el sesgo del usuario, aunque en general, los datos proporcionan información fiable y por lo tanto es ampliamente utilizado por los investigadores del EII. Por el contrario, no existe un método generalmente aceptado para la evaluación histológica del daño mucoso. Más comúnmente, las áreas seleccionadas del colon son inspeccionadas por un patólogo entrenado y puntuadas en base a varios parámetros que generalmente incluyen lesión de cripta e infiltración de leucocitos9,10,11. Sin embargo, debido a que el número de parámetros investigados y la cantidad de tejido analizado varía considerablemente entre los informes individuales, la comparabilidad de muchos estudios publicados es limitada. Para reducir el sesgo de los observadores y mejorar la concordancia entre estudios, un protocolo de puntuación histológica ideal debe: 1) incluir toda la longitud del colon, ya que la inflamación de la mucosa intestinal es más a menudo variable y las lesiones de salto son comunes, 2) limitar el análisis a parámetros clave específicos y fácilmente interpretables para reducir la subjetividad, 3) facilitar el procesamiento rápido y consistente de un gran número de muestras, y 4) utilizar herramientas ampliamente disponibles y asequibles para la adquisición, análisis y presentación de datos.
Aquí describimos una técnica para procesar segmentos enteros de colon o largos del intestino delgado en una configuración de "rollo suizo" junto con el uso de un sistema gratuito de puntuación asistida por computadora para analizar la inflamación y el daño de la mucosa intestinal debido a la colitis inducida por el DSS.

<table><tbody><tr><td>Aperio AT2 &ndash; Escaneo digital de portaobjetos completos de alto volumen</td> Almohadillas absorbentes <td>Leica Biosystems</td><td>Aperio AT2</td><td></td></tr><tr><td>con barrera contra la humedad</td><td>impermeable VWR International</td><td>56616-032</td><td></td></tr><tr><td>American Line 66-0089 Cuchilla de un solo filo, 100 por paquete</td><td>GT Midwest</td><td>TL5837</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer-Lok Jeringas desechables sin agujas</td><td>Fisher scientific</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Bonn Strabismus - ToughCut</td><td>Fine Science herramientas</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Strabismus Tijeras - ToughCut</td><td>Fine Science tools</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Fine Science tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formalina, tamponada neutra, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501640-19L</td><td></td></tr><tr><td>HistoPrep 70% Ea</td><td>Fisherbran</td><td>70% alcohol etílico desnaturalizado</td><td></td></tr><tr><td>ImageScope</td><td>Aperio</td><td>versión 12.3.3.5039</td><td>http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/</td></tr> <tr><td>Recipientes de muestras LeakBuster: Solución salina estéril</td><td>Starplex Scientific</td><td>B120210</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffere, sin calcio ni magnesio</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de alimentación de plástico, 20 GA x 30 mm</td><td>Instech</td><td>FTP2030</td><td></td></tr><tr><td>Aguja PrecisionGlide, Tamaño: 20 G x 1 1/2 in</td><td>BD (Becton, Dickinson and Company)</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Aguja PrecisionGlide, Tamaño: 27 G x 1/2 in</td><td>BD (Becton, Dickinson and Company)</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa, 10 ml</td><td>BD (Becton, Dickinson and Company)</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>Casetes de Tissue Unisette</td><td>Simport</td><td>M505-2</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis sistemático de puntuación para la inflamación intestinal en un modelo de colitis inducida por sulfato de sodio de dextrano de murina

Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model

Los modelos de colitis murina son herramientas que se emplean ampliamente en estudios centrados en la comprensión de la patobiología de los trastornos inflamatorios intestinales. Sin embargo, quedan por definir normas sólidas para la cuantificación objetiva y reproducible de la gravedad de la enfermedad. La mayoría de los métodos de análisis de colitis se basan en una puntuación histológica limitada de pequeños segmentos del intestino, lo que conduce a análisis parciales o sesgados. Aquí, combinamos la adquisición de imágenes de alta resolución y el análisis longitudinal de todo el colon para cuantificar la lesión intestinal y la ulceración en el modelo inducido de sulfato sódico dextrano (DSS) de colitis murina. Este protocolo permite la generación de resultados objetivos y reproducibles sin una amplia formación del usuario. Aquí, proporcionamos detalles completos sobre la preparación de muestras y el análisis de imágenes utilizando ejemplos de datos de colitis inducida por DSS. Este método se puede adaptar fácilmente a otros modelos de colitis murina que tienen inflamación significativa asociada con lesiones mucosa. Demostramos que la fracción de mucosa inflamada/lesionada y erosionada/ulcerada en relación con la longitud completa del colon es paralela a los hallazgos clínicos como la pérdida de peso en medio de la progresión de la enfermedad inducida por el SSD. Este protocolo histológico proporciona un tiempo fiable y una ayuda rentable para estandarizar los análisis de la actividad de la enfermedad de una manera imparcial en los experimentos de colitis del SDS.

Para ilustrar la fiabilidad de este análisis histológico de puntuación de colitis en el contexto de daño mucosa después del desafío DSS y posterior recuperación de la colitis, administramos 2.5% DSS en el agua potable de ocho ratones macho de 10 semanas C57BL6 tipo salvaje durante 5 días seguido de un período de recuperación con agua regular durante 5 días. No hubo ningún cambio en el peso corporal durante la administración aguda del DSS, desde el día 0 hasta el 5(Fig...

La puntuación sistemática de la inflamación intestinal utilizando un sistema asistido por computadora libre es una poderosa herramienta para comparar cuantitativamente los cambios histopatológicos en los modelos de colitis caracterizados por la presencia de úlceras y cambios inflamatorios. La evaluación de la puntuación de colitis histológica fortalece las observaciones clínicas y facilita la interpretación de los datos.

Análisis sistemático de puntuación para la inflamación intestinal en un modelo de colitis inducida por sulfato de sodio de dextrano de murina

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. ...

El análisis sistemático de puntuación es una técnica para evaluar lesiones mucosas, facilitando la interpretación histológica que pueden realizar investigadores capacitados. Las principales ventajas de este método es que es gratuito y fácil de usar. Permite el análisis cuantitativo de los datos histológicos obtenidos de los intestinos de ratones con colitis.Este protocolo proporciona una forma rápida y reproducible de interpretar la gravedad de la enfermedad de todo el colon, que es necesaria para comparar enfermedades de animales de diferentes orígenes genéticos. Para la preparación de tejidos, es importante organizar todos los reactivos y materiales. Comience colocando un ratón eutanasiado en una almohadilla de disección en una posición supina e inmovilice las extremidades del ratón usando agujas de 20 calibres y 1,5 pulgadas.Usando fórceps y tijeras, hacer una pequeña incisión en la piel abdominal y tirar de ella hacia un lado para exponer el peritoneo, luego abrir la cavidad abdominal con una incisión de línea media en el peritoneo desde el hueso púbico a los lados del abdomen. Retire cuidadosamente los tejidos y órganos hasta que se visualice el intestino grueso. Corte el hueso pélvico a ambos lados del colon para visualizar completamente el órgano, extendiéndose desde el ano hacia el cecum.Retire suavemente la grasa, las venas pequeñas y las arterias unidas al colon mientras disecciona cuidadosamente el órgano, cortando simplemente proximal al ano y distal al cecum. Enjuague cuidadosamente el colon con PBS para eliminar el contenido fecal utilizando una aguja de gavage de plástico flexible insertada a través del ano. Coloque el colon en línea recta y abra longitudinalmente a lo largo de la arteria mesenterica.Bisect el colon longitudinalmente desde el distal hasta el extremo proximal. Utilice la mitad del tejido para el análisis histológico y la otra mitad para la mancha occidental, PCR, o enrollado en un segundo rollo suizo para la microscopía de inmunofluorescencia congelada fresca. Recorte el tejido adicional del colon proximal con una cuchilla de afeitar hasta que se obtenga aproximadamente la misma anchura a lo largo de la longitud de todo el colon.Alinee el colon para exponer el lúmenes y aplanar el tejido completamente usando una aguja de gavage flexible. Agregue más PBS si es necesario para mantener el tejido húmedo durante todo el procedimiento. Retire el exceso de PBS con una toallita de papel.Con una aguja de jeringa y gavage, agregue una solución de formalina tamponada 10% neutra durante dos o tres minutos para fijar y aplanar el tejido, luego use fórceps rectos para agarrar el extremo del colon distal y girar el colon en círculos concéntricos desde el extremo distal hasta el extremo proximal. Inserte una aguja del calibre 27 para fijar el colon en el medio y mantener su forma de rollo suizo, luego coloque el rollo suizo en un casete de incrustación dentro de un recipiente de muestra histológica orientando el tejido en paralelo con respecto al cassette. Fije el tejido en solución de formalina tamponada 10% neutral durante la noche a cuatro grados Celsius.Después de la fijación durante la noche, lave el tejido tres veces con PBS. Agregue un 70% de etanol antes del proceso de incrustación de parafina y retire la aguja del rollo suizo antes de proceder. El tejido se puede almacenar en etanol a temperatura ambiente hasta la incrustación de parafina.Después de abrir las imágenes escaneadas en el software de procesamiento de imágenes, compruebe que todo el punto es visible y que no faltan áreas de la muestra. Active las herramientas del imager de etiquetas y de la barra de escala para identificar correctamente las diapositivas escaneadas haciendo clic en imager de etiquetas. Abra la herramienta de anotaciones haciendo clic en anotaciones y cree tres capas diferentes haciendo clic en nueva capa para cuantificar la longitud total del rollo suizo, la inflamación o lesión, y la erosión o ulceración.Elija un color diferente para cada capa haciendo clic en color de capa. Mida la longitud de cada capa o categoría haciendo clic en la herramienta pluma para dibujar una línea siguiendo la mucosa muscularis, moviendo el puntero según sea necesario para visualizar el área adyacente para su análisis. Ver la imagen a zoom de 400 micrómetros para facilitar una visualización adecuada de la mucosa muscularis.Cada vez que se detenga el lápiz, se generará una nueva región de capa pequeña. Se puede visualizar y editar con la pestaña regiones de capa. Revise la longitud total, inflamación o lesión, y la erosión o ulceración medida usando la mucosa muscularis como referencia.Una vez definidas todas las capas, exporte los datos mediante el botón exportar cuadrícula a archivo de texto dentro de las opciones de regiones de capa. Abra los archivos de texto y copie los datos en un software de hoja de cálculo. Totalizar todos los segmentos de cada región y calcular el porcentaje de lesiones y ulceración con respecto a la longitud total.Considere tres características principales para calcular la puntuación de colitis histológica y evaluar la gravedad de la enfermedad. Compruebe si hay mucosa intestinal saludable, que se caracteriza por células epiteliales organizadas en el eje luminal cripta, propria lamina con pocas células inmunes y mucosa muscular subjacente. A continuación, compruebe si hay inflamación o lesión, que se caracteriza por criptas epiteliales que son atenuadas o parcialmente faltantes células epiteliales e inflamación mucosa con infiltración de neutrófilos en criptas.Por último, compruebe la presencia de erosión o ulceración, que se caracteriza por zonas desprovistas de epitelio superficial o zonas completamente carentes de criptas de epitelio con o sin leucocitos asociados. Para ilustrar la fiabilidad de este análisis histológico de puntuación de colitis en el contexto de daños mucosos, se administró un 2,5% de DSS en el agua potable de ocho ratones de tipo salvaje C57BL6 durante cinco días, seguido de un período de recuperación con agua regular durante cinco días. El peso corporal se mantuvo constante durante la administración aguda de DSS, pero disminuyó drásticamente cuando los ratones comenzaron a beber agua corriente del grifo.La sangre y las heces blandas aparecieron después de tres días de administración del SSD y continuaron hasta el octavo día del experimento. Estas observaciones sugirieron que los efectos más perjudiciales de la exposición al SSD se observaron durante el período de recuperación entre los días cinco y ocho. La medición de la longitud del colon el día 10 confirmó un acortamiento significativo al final del experimento.Los colones fueron cosechados en el día cero, dos, cinco, siete, ocho y 10 para hacer rollos suizos de parafina. El tejido fue manchado con H&E y se analizaron exploraciones de alta definición para calcular la puntuación de colitis histológica y el porcentaje de lesiones y ulceración. Se observó arquitectura de cripta normal en ratones no tratados.Después de dos días de administración del SSD, se observó el reclutamiento de células inmunes. El quinto día, las células epiteliales parecen dañadas y hubo una infiltración de neutrófilos a través del epitelio asociado con lesiones epiteliales. Desde el quinto al ocho día, se observaron áreas de pérdida epitelial con inflamación y ulceración.El día 10, las células epiteliales comenzaron a regenerarse y repoblar áreas ulceradas, restaurando lentamente la mucosa colonica. Al intentar este protocolo, es importante crear un rollo suizo debidamente orientado y bien conservado, así como identificar correctamente la inflamación mucosa o lesiones y ulceración o erosión. Este método se puede utilizar para evaluar cuantitativamente lesiones a lo largo de toda la longitud de la mucosa colonica en otros modelos de colitis, como TMS o modelo de transferencia de células T.

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De sodio de sulfato de dextrano (DSS), administrada en el agua potable es un modelo murino estableció una lesión inflamatoria de la colitis aguda. Este protocolo describe el método para el tratamiento de DSS y la preparación de los tejidos.

Modelado de la colitis murino utilizando sulfato de dextrano sódico (DSS)

Los modelos experimentales de enfermedad inflamatoria intestinal, nos han permitido examinar las respuestas del complejo inmune innata y adaptativa asociada con la patogénesis. El uso de puntuación histológico, la cuantificación de citoquinas pro-inflamatorias y la actividad mieloperoxidasa, se puede comenzar a evaluar las respuestas observadas en la enfermedad inflamatoria intestinal.

La investigación de la inflamación intestinal inducida por DSS en el modelo de la EII

Este video muestra una técnica para generar un modelo murino de colitis inducido químicamente, una enfermedad inflamatoria intestinal. Se permite que el ratón consuma una solución de sulfato de sodio de dextrano (DSS) durante un tiempo adecuado. Al consumirlo, el DSS daña la mucosa y la barrera de la capa epitelial en el colon, lo que permite que los microbios intestinales ingresen al tejido subyacente, donde son detectados por las células inmunitarias residentes para mediar una respuesta...

Una técnica para generar un modelo murino de colitis inducida por sodio con sulfato de dextrano

Este video muestra el método de tinción de hematoxilina y eosina (H&amp;E) para evaluar el daño en el colon en un modelo murino de colitis inducida por DSS, una enfermedad inflamatoria intestinal. Al aislar el colon de un ratón tratado con DSS y obtener secciones del tejido, la tinción con H&amp;E de las secciones ayuda a identificar el daño tisular mediado por la inflamación.

Tinción de hematoxilina y eosina para evaluar el daño del colon en la colitis inducida por DSS

Este video muestra la evaluación de la colitis inducida por químicos a través de la tinción inmunohistoquímica del tejido del colon de ratón. En una sección de tejido teñido, la presencia de un gran número de células que responden al sistema inmunitario en el tejido dañado representa la infiltración de células inmunitarias durante la colitis.

Evaluación de la colitis inducida por químicos mediante análisis inmunohistoquímico de secciones de tejido del colon

En los últimos años, los endoscopios de nueva generación se han convertido en importantes ayudas de investigación de diagnóstico para la evaluación de la colitis murina y tumores colorrectales. Se presenta en el presente documento un protocolo detallado para la evaluación endoscópica de la inflamación y tumores colorrectales en ratones, así como un sistema de puntuación novedoso que utiliza identificadores decimales para documentar la gravedad de la colitis endoscópica y tumores colorrectales.

La colonoscopia flexible en ratones para evaluar la gravedad de la colitis y colorrectal tumores utilizando un sistema validado de puntuación endoscópica

Los tratamientos actuales de las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) tienen como objetivo aliviar los síntomas de la enfermedad, pero pueden causar efectos secundarios graves. Por lo tanto, las estrategias alternativas están siendo investigados en modelos animales con colitis. A continuación, explicamos cómo se analizan los efectos beneficiosos de los suplementos de la dieta en los signos clínicos de la EII en un modelo de este tipo colitis.

Analizar los efectos beneficiosos de los suplementos nutricionales sobre las funciones epitelial intestinal de barrera durante Experimental Colitis

Sondas específicas de objetivo representan una herramienta innovadora para el análisis de los mecanismos moleculares, como la expresión de proteínas en diversos tipos de enfermedad (p. ej., inflamación, infección y tumorigenesis). En este estudio, describimos una evaluación tomográfica tridimensional cuantitativa de la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis con F4/80-específica mediada por fluorescencia tomografía.

Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos

Falta de estandarización para el procesamiento de tejido murino reduce la calidad del análisis histopatológico murino en comparación con los especímenes humanos. Aquí, presentamos un protocolo para realizar el examen histopatológico de tejidos colon inflamados y uninflamed murinos para demostrar la viabilidad de sistemas robóticos que se utilizan habitualmente para el tratamiento y la inclusión de muestras humanas.

Uso de sistemas robóticos para procesar e integrar colónicas murinas muestras para análisis histológicos

Este trabajo presenta una citometría de flujo basado en el método para investigar la composición inmunológica de aortas. El documento también muestra una técnica adicional que permite examinar los alrededores y adventicia pared de los vasos por separado. Este método abre la posibilidad de realizar análisis fenotípico de los leucocitos aórtica y aplicar varios ensayos inmunológicos para los estudios de la aterosclerosis.

Análisis por citometría de flujo de células inmunes dentro de aortas murino

Aprende a realizar un análisis sistemático de puntuación histológica para evaluar la gravedad de la colitis inducida por DSS en murinos. Este protocolo cuantitativo permite medir lesiones y ulceraciones mucosas de forma objetiva y reproducible en todo el colon.

Análisis sistemático de puntuación para la inflamación intestinal en un modelo de colitis inducida por sulfato de sodio de dextrano de murina (Video) | JoVE Journal

Análisis sistemático de puntuación para la inflamación intestinal en un modelo de colitis inducida por sulfato de sodio de dextrano de murina

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