Name: Evaluación de la dispersión de biopelículas en heridas murinas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Aprenda a evaluar agentes dispersores de biopelículas en heridas murinas usando modelos in vivo e in vitro. Este protocolo permite medir la eficacia de tratamientos enzimáticos contra infecciones crónicas.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R21 AI137462-01A1), la Fundación Ted Nash Long Life, la Fundación Jasper L. y Jack Denton Wilson y el Departamento de Defensa (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Este protocolo animal fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Texas Tech (número de protocolo 07044). Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Preparación de bacterias para infecciones de ratón
NOTA: Aquí describimos la infección de ratones sólo con Pseudomonas aeruginosa. Sin embargo, otras especies bacterianas se pueden utilizar para causar la infección. Las cepas y materiales bacterianos se detallan en la Tabla de Materiales.
<ol><li>Utilizar Pseudomonas aeruginosa cepa de tipo salvaje PAO1 portadora del plásmido de luminiscencia pQF50-lux23 para estos experimentos como se describió anteriormente7.</li>
	<li>Cultivar cepas de P. aeruginosa en matraces Erlenmeyer desconcertados, con agitación a 200 rpm, en caldo Luria-Bertani (LB) a 37 °C durante 16 a 20 h. Añadir una concentración final de 100 μg/mL de ampicilina al cultivo nocturno de PAO1(pQF50-lux) para el mantenimiento del plásmido.</li>
	<li>Subcultivo P. aeruginosa añadiendo 100 μL del cultivo nocturno a un matraz Erlenmeyer que contiene 10 mL de caldo LB con una concentración final de 100 μg/mL de ampicilina. Luego crecer durante 2-2.5 h a 37 °C con agitación, a un OD600 nm de 0.4, y luego diluir en serie (1:10) tres veces para una dosis infectante de aproximadamente 104 células.</li>
</ol>2. Preparación de la enzima de dispersión de biopelículas
NOTA: Para este estudio utilizamos una solución al 10% de partes iguales de amilasa y celulasa (5% de cada una), que se denominará "GH", para el tratamiento de dispersión.
<ol><li>Utilice una solución de GH al 10% (p/v) de amilasa (de Bacillus subtilis)y celulasa fúngica (de Aspergillus niger)diluida en solución salina de tampón de fosfato 1x (PBS). Utilice PBS como tratamiento de control del vehículo.</li>
	<li>Calentar todos los tratamientos a 37 °C durante 30 min para la activación de enzimas.</li>
</ol>3. Animales de experimentación y configuración preoperatoria
<ol><li>Ratones domésticos, 5 compañeros de camada por jaula, en condiciones controladas por el ambiente, con ciclos de luz/oscuridad de 12 h y acceso adecuado a alimentos y agua.</li>
	<li>Preferiblemente, utilice ratones Webster suizos hembra, entre 8 y 10 semanas de edad.</li>
	<li>Pesar ratones para determinar la cantidad adecuada de anestesia para administrar.</li>
	<li>Administrar anestesia mediante la inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de ketamina 10 mg/kg de xilazina.</li>
	<li>Aplique crema para los ojos (por ejemplo, Refresh P.M.) cuidadosamente sobre el ojo usando un hisopo de algodón para reducir la sequedad.</li>
	<li>Controle los parámetros fisiológicos incluyendo ritmo respiratorio, coloración de la piel, y temperatura corporal a través de la cirugía.</li>
</ol>4. Cirugía de escisión de espesor completo dorsal
<ol><li>Evaluar el plano quirúrgico de la anestesia por pellizco en el dedo del dedo deldo del sistema y la supervisión de la frecuencia respiratoria y del esfuerzo. Afeitarse la superficie dorsal y aplicar una crema depilatoria durante 10 minutos (o según las instrucciones del producto), después de lo cual retirar suavemente, asegurando que la piel estaba seca.</li>
	<li>Para el manejo del dolor, administre 0,05 mL de lidocaína por vía subcutánea en el área a extirpar e inyecte 0,02 mL de buprenorfina por vía subcutánea en el cuello. Espere 10 minutos para asegurarse de que se alcanzó el manejo del dolor.</li>
	<li>Antes de la escisión, desinfecte la superficie dorsal con un hisopo de alcohol y dibuje un círculo de 1,5 cm de diámetro hacia la parte posterior de la espalda. Mantenga un campo quirúrgico estéril durante todo el procedimiento y use instrumentos en autoclave y guantes estériles. Para limitar la contaminación, realice la cirugía con un quemador Bunsen encendido y use herramientas limpias para cada animal.</li>
	<li>Administre una herida de piel de espesor completo y escisión al nivel del músculo panniculus con tijeras quirúrgicas.</li>
	<li>Después de la supresión, cubra inmediatamente las heridas con un apósito de poliuretano semipermeable.</li>
	<li>Inyecte aproximadamente 104 UFC de bacterias en 100 μL de PBS debajo del apósito, en el lecho de la herida, para establecer una infección. NOTA: Las heridas también pueden infectarse con múltiples especies de bacterias y/u hongos simultáneamente, o colocando biopelículas pre-formadas12,o incluso tejido de desbridamiento extraído de pacientes19,en el lecho de la herida.</li>
	<li>Después de la infección, coloque a los ratones en jaulas con almohadillas de calefacción y vigile hasta que recuperen su reflejo derecho. NOTA: Asegúrese de que los ratones no se enfríen, ya que esto puede llevar a la muerte.</li>
	<li>Establecer infecciones de heridas durante 48 h.</li>
	<li>Inspeccione los apósitos adhesivos diariamente para los rasgones y las áreas de la no-adherencia y substituido si es necesario.</li>
</ol>5. Tratamiento de dispersión in vivo
NOTA: Aquí describimos la administración de los agentes dispersantes mediante la aplicación de una serie de 3 soluciones tópicas de irrigación de heridas(Figura 1). Sin embargo, el protocolo se puede adaptar para otros tipos de parto como la aplicación de geles, cremas o aderezos.
<ol><li>Coloque ratones bajo anestesia con isoflurano (al 3% y 1 L por minuto de oxígeno) mientras administra los tratamientos.</li>
	<li>Preparar tres jeringas de 1 ml, con agujas de 25 G, que contengan 200 μL de tratamiento para cada ratón.</li>
	<li>Inyecte 200 μL de solución enzimática o control de PBS sobre la herida levantando y pellizcando cuidadosamente la piel con pinzas, ligeramente por encima de la herida hacia la cabeza del animal. Perfore cuidadosamente la jeringa a través de la piel levantada e inyecte lentamente la solución entre el apósito y el lecho de la herida. El apósito utilizado en este estudio a menudo se adhiere tanto al lecho de la herida como al tejido circundante.<ol>
<li>Para asegurarse de que todo el lecho de la herida esté cubierto por una solución, levante suavemente el apósito con las fuerzas, alejándolo del lecho de la herida, mientras inyecta lentamente la solución.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después del tratamiento, coloque a los ratones de nuevo en sus jaulas durante 30 minutos.</li>
	<li>Después de 30 minutos de exposición al tratamiento, vuelva a anestesiar a los ratones con isoflurano y aspire la solución con una jeringa, asegurándose de perforar en la misma área que antes. NOTA: Esta solución aspirada contiene células bacterianas dispersas, que pueden guardarse para varios análisis aguas abajo.</li>
	<li>Administrar el segundo y tercer tratamiento de riego como el primero, utilizando una jeringa nueva cada vez.</li>
</ol>6. Imágenes y análisis de dispersión in vivo
NOTA: Si se utiliza una cepa luminiscente de bacterias para iniciar la infección, se puede utilizar un sistema de imágenes in vivo (IVIS) para visualizar la dispersión desde el lecho de la herida.
<ol><li>Imagen de ratones inmediatamente antes y después del tratamiento y a las 10 y 20 h después del tratamiento (Figura 2 y Figura Suplementaria 1).</li>
	<li>Realice la proyección de imagen mientras que los ratones están bajo anestesia colocándolos individualmente en el IVIS y proyección de imagen cada uno para 5 s en una longitud de onda de 560 nanómetro. Guarde las imágenes para su posterior análisis. NOTA: La longitud de onda y el tiempo de exposición óptimos dependerán del reportero utilizado y del instrumento IVIS y del software de imágenes.</li>
	<li>Para el análisis, abra las imágenes en el software IVIS y seleccione el área a analizar en la Paleta de herramientas.</li>
	<li>Para tener en cuenta el fondo, coloque un círculo en el fondo de una foto y luego coloque el mismo círculo del tamaño en la parte superior de la cama de la herida para cada ratón.</li>
	<li>Para cargar valores de medición, seleccione Ver -> medidas de región de interés (ROI) y cargue la tabla de mediciones en una hoja de cálculo. Reste la lectura del círculo de fondo de cada una de las mediciones del lecho de la herida para calcular la luminiscencia de cada muestra. Calcular el porcentaje de luminiscencia cambiado por: ROI pre-tratamiento-ROI post-tratamiento/ ROI pre-tratamiento) x 100. NOTA: Los ratones de control y tratados deben analizarse simultáneamente para normalizar las variables que pueden afectar la adquisición de la imagen o la luminosidad.</li>
</ol>7. Evaluación de la dispersión mediante la determinación de la UFC
<ol><li>Eutanasia humanamente ratones mediante la inyección intraperitoneal de 0,2 mL de pentobarbital sódico (p. ej., Fatal Plus) bajo anestesia con 100 mg/kg de ketamina 10 mg/kg de xilazina.</li>
	<li>Coseche el tejido del lecho de la herida quitando primero suavemente el apósito con fórceps estériles, y después corte alrededor del perímetro de la cama de la herida con las tijeras quirúrgicas estériles. Levante suavemente un extremo del lecho de la herida con las lórceps mientras usa tijeras para cortar / burlarse de la muestra lejos de la capa muscular.</li>
	<li>Coloque el tejido del lecho de la herida en un tubo de homogeneización de 2 mL premarcado y prepesado que contenga 1 mL de PBS. Pesar los tubos de nuevo después de insertar las muestras, y luego invertir suavemente 3-5 veces para enjuagar cualquier bacteria dispersa o poco adherida, y retire el PBS. Añadir 1 mL de PBS fresco.</li>
	<li>Con el fin de cosechar los bazos, coloque a los ratones en una posición anatómica supina y asegurar fijando sus extremidades a una superficie de disección. Remoje el área a diseccionar con etanol al 70% para desinfectar el área y evitar que el pelaje contamine la muestra.</li>
	<li>Haga cuidadosamente una pequeña incisión perpendicular a la línea media con tijeras quirúrgicas en la dermis de la parte inferior del abdomen, asegurándose de levantar y alejar la piel de los órganos internos. Continúe la incisión interiormente, a lo largo de la línea media, hasta que se alcance el esternón. Una vez que la cavidad peritoneal fue expuesta y los órganos internos eran visibles, separe suavemente el bazo del tejido conectivo y colóquese en un tubo separado de la homogeneización.</li>
	<li>Pesar el bazo y enjuagar con PBS, como se describe para el tejido de la cama de la herida. NOTA: Otros órganos de interés pueden ser cosechados de manera similar.<ol>
<li>Al hacer la incisión inicial, tenga cuidado de evitar perforar los intestinos u otros órganos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homogeneizar muestras en tubos de molino de perlas precargados de 2 mL utilizando un homogeneizador de sobremesa a 5 m/s durante 60 s, dos veces.</li>
	<li>Para enumerar la UFC, diluya en serie las muestras y la placa puntual en agar selectivo. Para la dilución en serie, pipetee 100 μL de la muestra en 900 μL de PBS en un tubo de 1,5 mL, vórtice, y repita 5 veces. Pipeta 10 μL de cada dilución sobre una placa de agar como se muestra en la Figura 3. NOTA: Si se requiere una cuantificación de UFC más precisa, esparcir 100 μL de cada dilución de la muestra a través de placas de agar separadas.</li>
</ol>8. Evaluación ex vivo de la dispersión ( Figura4)
<ol><li>Hiere ratones e infecta con aproximadamente 104 PAO1 como se describió anteriormente, y luego eutanasia 48 h después de la infección.</li>
	<li>Retire cuidadosamente el apósito con pinzas, utilizando técnica estéril y sin perturbar el lecho de la herida.</li>
	<li>Use tijeras quirúrgicas estériles para cortar el perímetro del lecho de la herida lejos de la piel no infectada mediante el uso de fórceps para levantar un extremo del lecho de la herida y tijeras para extirpar el tejido infectado de la herida de la capa muscular debajo y el tejido no infectado circundante. Divida las muestras del lecho de la herida en partes iguales o use entero.</li>
	<li>Coloque el tejido de la herida en tubos de homogeneización de molinos de perlas vacíos y prepesados de 2 mL. Luego, vuelva a pesar los tubos después de agregar la muestra. Calcule el peso de la muestra por: peso después de agregar la muestra - peso antes de agregar la muestra.</li>
	<li>Agregue 1 mL de PBS e invierta suavemente el tubo 3-5 veces para enjuagar la muestra y eliminar cualquier célula planctónica. Quite y descarte el PBS.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tratamiento con GH (o PBS como control negativo) a la muestra e incubar durante 2 h a 37 °C con agitación a 80 rpm.</li>
	<li>Retire la solución de dispersión de biopelículas y colóquela en un tubo separado de 1,5 mL. Esto contiene las celdas dispersas.</li>
	<li>Agregue 1 mL de PBS a la muestra de tejido restante e invierta suavemente 3-5 veces para enjuagar las células dispersas restantes. Quite y descarte el PBS.</li>
	<li>Añadir 1 mL de PBS al tejido restante y homogeneizar a 5 m/s durante 60 s utilizando un homogeneizador de sobremesa.</li>
	<li>Diluir en serie la solución de células dispersas y la muestra de tejido homogeneizado colocando 100 μL de muestra en 900 μL de PBS en un tubo de 1,5 mL, y repitiendo cinco veces para un total de 6 diluciones.</li>
	<li>Placa puntual de 10 μL de cada dilución en agar selectivo de medios (por ejemplo, Agar aislamiento de Pseudomonas para P. aeruginosa)e incubar las placas a 37 °C durante la noche.</li>
	<li>Cuente la UFC y calcule el "porcentaje disperso" como (UFC en sobrenadante/ (UFC en sobrenadante + UFC en el tejido de biopelícula)) x 100.</li>
</ol>

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<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Tipton, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wound+microbiome+colonization+on+mouse+model+following+cryogenic+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chronic wound microbiome colonization on mouse model following cryogenic preservation.</a> PLoS One. 14 (8), 0221656(2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se describen los protocolos que se pueden utilizar para estudiar la eficacia de los agentes de dispersión de biopelículas. Estos protocolos se pueden adaptar fácilmente para su uso con diferentes tipos de agentes de dispersión, especies bacterianas o muestras ex vivo, incluidas las muestras de desbridamiento clínico. Este protocolo también proporciona un modelo clínicamente relevante para recolectar y estudiar células bacterianas dispersas. Se ha demostrado que los fenotipos de las células bacterianas dispe...

El aumento de la resistencia a los antibióticos en todo el mundo está llevando a la falta de opciones de antibióticos para tratar una variedad de infecciones bacterianas1. Además de la resistencia a los antibióticos, las bacterias pueden ganar tolerancia a los antibióticos mediante la adopción de un estilo de vida asociado a labiopelícula 2. Una biopelícula es una comunidad de microorganismos que están protegidos por una matriz de polisacáridos, ADN extracelular, lípidos y proteínas3,denominada colectivamente sustancia polimérica extracelular (EPS). A medida que continúa la crisis de resistencia a los antibióticos, se necesitan urgentemente nuevas estrategias que prolonguen el uso de antibióticos o potencien su eficacia. Los agentes anti-biopelículas son una solución prometedora4.
Entre las diferentes estrategias anti-biopelículas que se han propuesto, la utilización de agentes de dispersión, que se dirigen a diferentes componentes de la EPS de la biopelícula, están a la vanguardia del desarrollo terapéutico5. Las hidrolasas de glucósido (GH) son una de esas clases de agente de dispersión. Gh son una gran clase de enzimas que catalizan la escisión de diferentes enlaces dentro de los polisacáridos que proporcionan integridad estructural a la EPS. Nuestro grupo, así como otros, han demostrado que la GH puede degradar eficazmente las biopelículas, inducir la dispersión y mejorar la eficacia de los antibióticos para una serie de especies bacterianas diferentes, tanto in vitro como in vivo6,7,8,9,10,11.
Con un creciente interés en la dispersión de biopelículas, es importante desarrollar métodos efectivos que evalúen la eficacia de la dispersión. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el tratamiento de las infecciones de heridas asociadas a biopelículas con un agente de dispersión en ratones, y la evaluación de la eficacia de la dispersión, in vivo y ex vivo. El objetivo general es proporcionar métodos efectivos que se puedan utilizar con modelos preclínicos para medir la dispersión de biopelículas de manera efectiva y eficiente.
Un modelo quirúrgico murine de la infección de la supresión fue utilizado en estos estudios para establecer una infección biofilm-asociada. Hemos utilizado este modelo durante más de 15 años y publicado nuestras observaciones ampliamente7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. En general, este es un modelo de infección no letal donde las bacterias permanecen localizadas en el lecho de la herida y están asociadas al biofilm (bacterias que se ven en agregados rodeados de EPS), estableciendo una infección crónica que dura hasta 3 semanas. Sin embargo, si los ratones están inmunodeprimidos (con diabetes tipo 1, por ejemplo), pueden volverse más susceptibles a desarrollar una infección sistémica fatal en este modelo.
En este informe, proporcionamos protocolos para evaluar la dispersión de bacterias de una herida, tanto in vivo como ex vivo. Ambos protocolos se pueden utilizar para examinar la eficacia de un agente de dispersión y tienen sus propias fortalezas y debilidades. Por ejemplo, evaluar la dispersión in vivo puede proporcionar información importante en tiempo real sobre la propagación de bacterias a otras partes del cuerpo después de la dispersión, y cómo responde el huésped. Por otro lado, evaluar la dispersión ex vivo puede ser más deseable para la detección de múltiples agentes, dosis o formulaciones, ya que el tejido se puede dividir en múltiples secciones que se pueden probar por separado, reduciendo así el número de ratones requeridos. Al evaluar múltiples agentes, normalmente medimos la dispersión primero in vitro como se describió anteriormente 6,9,22. Luego probamos el más efectivo ex vivo y reservamos la prueba in vivo para un número limitado de agentes muy prometedores.

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher</td><td>14823434</td><td>Úselo para completar diluciones en serie de muestras</td></tr><tr><td>25G 58 en aguja</td><td>Fisher</td><td></td><td>14823434 Se conecta a una jeringa de 1 mL</td></tr><tr><td>Ampicilina Sal de sodio</td><td>Fisher</td><td>BP1760-5</td><td>Haga una solución madre de 50 mg / mL y agregue 100 &micro; L a 10 mL de caldo LB para tanto durante la noche como en el subcultivo</td></tr><tr><td>Amylase</td><td>MP Biomedicals 2100447</td><td></td><td>Prepare una solución al 5% p/v, vórtice- se pueden usar otros agentes de dispersión</td></tr><tr><td>Buprenorfina SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)</td><td>ZooPharm</td><td>RX216118</td><td>Uso como analgésico- puede usar otras opciones</td></tr><tr><td>Cellulase</td><td>MP Biomedicals</td><td>2150583</td><td>Agregue 5% p/v a la solución de amilasa al 5% p/v, vórtice, active a 37 & deg; C durante 30 min- se pueden usar otros agentes de dispersión</td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Walmart</td><td>287746</td><td>Use una pequeña cantidad para masajear los folículos pilosos en la espalda del animal y asigne 10 minutos para eliminar el vello</td></tr><tr><td>Pinzas de vendaje, puntas dentadas</td><td>Fisher</td><td>12-460-536</td><td>Puede usar otras formas de fórceps</td></tr><tr><td>Matraces Erlenmeyer deflectores 125</td><td>mL Fisher</td><td>101406</td><td>Úselo para cultivar durante las noches y subcultivos de bacterias</td></tr><tr><td>FastPrep-24 Homogeneizador de sobremesa</td><td>MP Biomedicals</td><td>6VFV9</td><td>Utilice 5 m/s durante 60 s dos veces para homogeneizar el tejido</td></tr><tr><td>Fatal Plus</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>0298-9373-68</td><td>Inyecte 0,2 mL intraperitaneal por cada ratón</td></tr><tr><td>Tubos homogeneizadores (Bead Tube, 2 mL, 2,4 mm Metal)</td><td>Fisher</td><td>15340151</td><td>Se utiliza para homogeneizar muestras para el recubrimiento</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Diamond Back Drugs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de clorhidrato de ketamina/clorhidrato de xilacina C-IIIN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K4138</td><td>Uso como anasetia: también se pueden utilizar otras opciones para obtener un campo quirúrgico de caldo LB de anasetia</td></tr><tr><td>, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-2</td><td>Agregar 25 g / L y autoclave</td></tr><tr><td>Lidocaína 2%</td><td>Inyectable Diamond Back Drugs</td><td>2468</td><td>Inyecte 0,05 mL a través del costado del área del lecho de la herida marcada para que se deposite en el centro de la marca. Asignar 10 min antes del corte</td></tr><tr><td>Meropenem</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1772-500MG</td><td>Preparar 5 mg/mL para añadir a la solución de GH para aplicar tópicamente y una solución de 15 mg/mL para inyectar intraperitaneal 4 h antes y 6 h después del tratamiento</td></tr><tr><td>Esponjas de gasa de algodón no estériles</td><td>Fisher</td><td>13-761-52</td><td>Usar para retirar la crema depilatoria</td></tr><tr><td>PAO1 pQF50-lux cepa bacteriana</td><td>Ref [13]</td><td>N/A</td><td>Se utilizó PAO1 pgF50-lux como la cepa de P. aeruginosa de interés en los resultados representativos de este trabajo</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher</td><td>PHR1772-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato solución salina 10x</td><td>Fisher</td><td>BP3991</td><td>Diluir de 10 a 1 veces antes de usar</td></tr><tr><td>Apósito de poliuretano</td><td>Mckesson</td><td>66024007</td><td>Corta el borde redondeado y corta el cuadrado restante en 4 secciones iguales</td></tr><tr><td>Pseudomonas agar aislante</td><td>VWR</td><td>90004-394</td><td>Añada 20 mL/L de glicerol y 45 g/mL al agua, autoclave, y vierta 20 mL en placas de Petri</td></tr><tr><td>Refresh P.M.</td><td></td><td></td> Walmart <td>Úselo en los ojos para reducir la sequedad durante el procedimiento.</td></tr><tr><td>Almohadillas estériles de preparación con alcohol</td><td>Fisher</td><td>22-363-750</td><td>Úselo para limpiar la piel inmediatamente antes de herir para desinfectar el área</td></tr><tr><td>Tijeras rectas delicadas</td><td>Fisher</td><td>89515</td><td>También puede usar tijeras curvas</td></tr><tr><td>Ratones Swiss Webster</td><td>Charles River</td><td>551NCISWWEB</td><td>Se pueden usar otras cepas de ratones</td></tr><tr><td>Punta deslizante de jeringa 1</td><td>mL Fisher</td><td>14823434</td><td>Se utiliza para administrar medicamentos y Tratamiento enzimático</td></tr></tbody></table>

evaluación de la dispersión de biopelículas en heridas murinas

Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds

Las infecciones relacionadas con el biofilm están implicadas en una amplia gama de condiciones crónicas como úlceras del pie diabético no curativas, sinusitis crónica, otitis media recurrente y muchas más. Las células microbianas dentro de estas infecciones están protegidas por una sustancia polimérica extracelular (EPS), que puede evitar que los antibióticos y las células inmunes del huésped despejen la infección. Para superar este obstáculo, los investigadores han comenzado a desarrollar agentes de dispersión como terapia potencial. Estos agentes se dirigen a varios componentes dentro de la EPS de biopelícula, debilitando la estructura e iniciando la dispersión de las bacterias, lo que teóricamente puede mejorar la potencia de los antibióticos y el aclaramiento inmunológico. Para determinar la eficacia de los agentes de dispersión para las infecciones de heridas, hemos desarrollado protocolos que miden la dispersión de biopelículas tanto ex vivo como in vivo. Utilizamos un modelo quirúrgico de la supresión del ratón que se ha descrito bien para crear infecciones crónicas biofilm-asociadas de la herida. Para monitorizar la dispersión in vivo,infectamos las heridas con cepas bacterianas que expresan luciferasa. Una vez establecidas las infecciones maduras, regamos las heridas con una solución que contiene enzimas que degradan los componentes del biofilm EPS. A continuación, supervisamos la ubicación y la intensidad de la señal luminiscente en los órganos de la herida y filtrado para proporcionar información sobre el nivel de dispersión alcanzado. Para el análisis ex vivo de la dispersión de biopelículas, el tejido de la herida infectada se sumerge en una solución enzimática que degrada la biopelícula, después de lo cual se evalúa la carga bacteriana restante en el tejido, frente a la carga bacteriana en solución. Ambos protocolos tienen fortalezas y debilidades y se pueden optimizar para ayudar a determinar con precisión la eficacia de los tratamientos de dispersión.

En este experimento, 8-10 ratones suizos suizos hembra de la semana de edad Webster fueron infectados con10 4 UFC de PAO1 que lleva el plásmido de luminiscencia pQF50-lux. Según lo descrito arriba, una infección fue permitida establecer para 48 h antes de administrar 3 x 30 tratamientos mínimos de PBS (control del vehículo) o del 10% GH (tratamiento) para digerir el biofilm EPS. Los ratones fueron fototratado pretratamiento, directamente después del tratamiento (0 h) y en 10 h y 20 h post-tratamiento. <strong ...

Aquí, se describen métodos ex vivo e in vivo para evaluar la dispersión bacteriana de una infección de la herida en ratones. Este protocolo se puede utilizar para probar la eficacia de las terapias antimicrobianas y anti-biofilm tópicas, o para evaluar la capacidad de dispersión de diferentes cepas o especies bacterianas.

Evaluación de la dispersión de biopelículas en heridas murinas

Biofilm-related infections are implicated in a wide array of chronic conditions such as non-healing diabetic foot ulcers, chronic sinusitis, reoccurring ...

Los microbiólogos y los médicos de enfermedades infecciosas están empezando a darse cuenta de lo importantes que son las infecciones asociadas a biopelículas en las enfermedades crónicas. Los NIH incluso han dicho que más del 80% de las infecciones crónicas se deben a biopelículas bacterianas. Así que esto ha instado al énfasis en abordar el biofilm, y el desarrollo de terapias que aborden el problema del biofilm.Y un lotta esas terapias se centran en la dispersión de las células bacterianas que están en las biopelículas fuera de la biopelícula para que puedan ser más fácilmente asesinados. Pero realmente no hay muchos protocolos en la literatura actual que aborden cómo determinar la eficacia de tal agente de dispersión. Así que sentimos que este es un buen protocolo para usar.Es un tipo de infección bacteriana que está asociada a biopelículas. Y también creemos que se puede optimizar con bastante facilidad para estudiar muchos tipos diferentes de especies bacterianas, y cómo forman biopelículas y se dispersan, así como diferentes agentes de dispersión. Y creemos que es importante entregar esto en un formato de video, porque hemos visto que hay matices, especialmente en la entrega

assessing-biofilm-dispersal-in-murine-wounds

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Source: Hunt, A. M. A., et al. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp.(2017).This video demonstrates the procedure for assessing infection clearance and healing progression in a wounded diabetic mouse using bioluminescent and microscopic images.

Bioluminescence Imaging to Track Bacterial Infection and Wound Healing in a Mouse Model

Este video muestra imágenes in vivo para estudiar la dinámica de reclutamiento de neutrófilos en un sitio de infección en un ratón transgénico inmunocomprometido con neutrófilos que expresan GFP. Consiste en inyectar bacterias luminiscentes para causar una infección. Esto conduce al reclutamiento de neutrófilos al sitio de la infección, cuyo seguimiento se realiza mediante imágenes.

Monitorización de la dinámica de reclutamiento de neutrófilos y la carga bacteriana en el lugar de la infección en un modelo murino

Este video muestra una técnica para generar un modelo murino de infección de heridas en la piel. Al infectar ratones, modificados genéticamente para expresar una proteína fluorescente en neutrófilos, con un Staphylococcus aureus bioluminiscente modificado genéticamente, una bacteria patógena. La carga bacteriana en el sitio de la infección y la dinámica de reclutamiento de neutrófilos se pueden estudiar utilizando imágenes de animales enteros.

Un modelo de infección de heridas cutáneas murinas para estudiar la respuesta inmunitaria frente a un patógeno bacteriano

Este video demuestra el desarrollo de un modelo de ratón in vivo para estudiar la formación de biopelículas de Candida albicans en tejido subcutáneo. El experimento consiste en implantar dispositivos infectados con Candida en la región posterior del animal para el desarrollo de la biopelícula.

Candida albicans Formación de biopelículas en un modelo de ratón in vivo

Un modelo murino de cicatrización de heridas cutáneas que se puede utilizar para evaluar los compuestos terapéuticos en los entornos fisiológicos y fisiopatológicos.

Modelo murino de Curación de Heridas

Presentamos un procedimiento experimental de desarrollo de biofilm de Candida albicans en un modelo subcutáneo de ratón. Las biopelículas fúngicas se cuantificaron determinando el número de unidades formadoras de colonias y mediante una imagen de bioluminiscencia no invasiva, donde la cantidad de luz que se produce se corresponde con el número de células viables.

Candida albicans biopelícula Desarrollo de Cuerpos Extraños médicamente relevantes en un modelo de ratón subcutánea Seguido por bioluminiscencia Imaging

Aquí describimos un nuevo modelo murino diabético utilizando ratones sin pelo en tiempo real, no invasivo, vigilancia de infecciones de la herida del biofilm de bioluminiscente Pseudomonas aeruginosa. Este método puede adaptarse para evaluar infección de otras especies de bacterias y microorganismos modificados genéticamente, como los biofilms multiespecies y comprobar la eficacia de estrategias antibiofilm.

Llegado al lado de la luz: Vivo en monitoreo de Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecciones en las heridas crónicas en un diabético sin pelo modelo murino

Describimos un protocolo de inoculación retardada para generar infecciones crónicas por heridas en ratones inmunocompetentes.

Un modelo de inoculación tardía de la infección crónica por la herida de Pseudomonas aeruginosa

Las heridas crónicas resistentes a los antibióticos son una gran amenaza para el sistema sanitario. Las infecciones por biofilm son persistentes y hostiles y pueden causar un cierre funcional deficiente de la herida. Presentamos un modelo porcino clínicamente relevante de heridas crónicas de espesor total infectadas con biofilm. Este modelo es poderoso para estudios mecanicistas, así como para probar intervenciones.

Modelo porcino de infección por biofilm y heridas invisibles

Este protocolo describe un modelo experimental único de infecciones relacionadas con implantes que permite la incubación simultánea de dos implantes con bacterias en condiciones idénticas dentro de un solo ratón. También permite una evaluación precisa de la formación de biopelículas en las superficies de los implantes utilizando métodos analíticos comparativos optimizados, demostrando técnicas avanzadas para evaluar las propiedades antimicrobianas de los biomateriales.

Un modelo de ratón único para la evaluación cuantitativa de la formación de biopelículas en implantes quirúrgicos en abscesos subcutáneos

Aprenda a evaluar agentes dispersores de biopelículas en heridas murinas usando modelos in vivo e in vitro. Este protocolo permite medir la eficacia de tratamientos enzimáticos contra infecciones crónicas.

Evaluación de la dispersión de biopelículas en heridas murinas

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