Name: Un modelo de rata de la infección cerebral EcoHIV (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprende a establecer un modelo de infección cerebral EcoHIV en ratas mediante inyección estereotáxica. Este método permite estudiar trastornos neurocognitivos asociados al VIH y comorbilidades en neurociencia.

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Este trabajo fue financiado por las subvenciones HD043680, MH106392, DA013137 y NS100624 de los NIH.

Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur (número de garantía federal: D16-00028). La rata masculina adulta de seises F344/N era par alojada en un ambiente controlado bajo luz 12/12: ciclo oscuro con el acceso del ad libitum al alimento y al agua. Todos los animales fueron atendidos utilizando las directrices establecidas por los Institutos Nacionales de Salud en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Empaquetado de virus en 293 células FT
<ol><li>Cultivar las 293 células FT (5×105/mL)en matraces recubiertos de gelatina de 75 cm2 con DMEM más FBS al 10%11. Cultivar células a 37 °C para que sean confluentes al 50% en la transfección.</li>
	<li>Diluir 22,5 μL de reactivo de transfección (por ejemplo, lipofectamina 3000) en 750 μL de medio (por ejemplo, Opti-MEM) en un tubo de microcentrifugación de 1,5 mL y vórtice durante 3 s.</li>
	<li>Diluir 20 μg de ADN plásmido EcoHIV en 750 μL de medio en un tubo de microcentrifugación de 1,5 mL y mezclar bien.</li>
	<li>Agregue adn diluido en el tubo del reactivo de transfección diluido y mezcle suavemente. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir la mezcla a 10 mL de medio DMEM precalentado en matraz de 75 cm2. Incubar las células durante 2 días a 37 °C.</li>
	<li>Cosechar y combinar 24 mL de medio condicional de los dos matraces que incluyen el lentivirus envasado.</li>
	<li>Centrifugar los 24 mL de medio condicional a 500 x g durante 10 minutos a 4 °C. Transfiera el sobrenadante clarificado a un tubo estéril de 50 mL.</li>
	<li>Combinar 8 mL de concentrador Lenti-x con 24 mL de sobrenadante clarificado (relación 1:3). Mezclar por inversión suave. Incubar la mezcla a 4 °C durante dos días.</li>
	<li>Mezcla de centrífuga a 1.500 x g durante 45 minutos a 4 °C. Retire cuidadosamente el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender suavemente el pellet con 100 μL de PBS de 100 mM.</li>
	<li>Concentración del virus del título con un kit p24 ELISA.</li>
</ol>2. Cirugías estereotáxicas del virus EcoHIV-EGFP
<ol><li>Anestesiar ratas usando sevoflurano al 3%. Proceda al paso 2.2 cuando las ratas no responden a los estímulos nocivos y los reflejos están ausentes.</li>
	<li>Afeitarse los pelos de la región del cerebro y esterilizar la piel dos veces con etanol al 70% y un exfoliante a base de clorhexidina. Asegure la rata en una posición propensa en el aparato estereotáxico.</li>
	<li>Haga una incisión (5-6 cm) a través de la piel a lo largo de la línea media del cuero cabelludo.</li>
	<li>Marque dos posiciones de perforación a 0,8 mm laterales, 1,2 mm rostral a bregma. Taladrar un agujero (diámetro 0,4 mm) en cada posición del cráneo.</li>
	<li>Llene la solución de lentivirus EcoHIV con título (1,04 × 106 TU/mL) en una jeringa de inyección de 10 μL. Asegure la jeringa al aparato estereotáxico.</li>
	<li>Mueva hacia abajo la aguja cerca de la superficie del orificio de perforación. Medir y mover 2,5 mm de profundidad.</li>
	<li>Infundir 1 μL de solución de virus a una velocidad de 0,2 μL/min. Mantenga la aguja dentro del área de inyección durante 5 min. Mueva lentamente la aguja hacia arriba hasta que esté fuera del cráneo de la rata.</li>
	<li>Sutura la piel con un hilo de seda 4-0.</li>
	<li>Esterilice la incisión con etanol al 70% una vez. Inyectar butorfenol por vía subcutánea (Dorolex, 0,1 mg/kg de peso corporal).</li>
	<li>Transfiera la rata a una cámara de recuperación con una almohadilla térmica hasta que se despierte.</li>
</ol>3. Visualización de las secciones cerebrales
NOTA: Espere de una a ocho semanas después de la infusión viral de EcoHIV.
<ol><li>Anestesiar la rata con 5% sevoflurano. Continúe con el paso 3.2 cuando las ratas no responden a los estímulos nocivos y los reflejos están ausentes.</li>
	<li>Fije la rata en una posición supina dentro de una campana extractora de humos.</li>
	<li>Incise la piel a lo largo de la línea media torácica. Cortar el diafragma y abrir la cavidad torácica.</li>
	<li>Inserte una aguja de 20 G × 25 mm en el ventrículo izquierdo.</li>
	<li>Abra inmediatamente la aurícula derecha con unas tijeras.</li>
	<li>Perfundir 50 mL de PBS prechilled 100 mM a razón de 5 mL/min.</li>
	<li>Perfundir 100 mL de paraformadehído frío al 4% a razón de 5 mL/min.</li>
	<li>Decapitar la rata, abrir el cuero cabelludo y quitar el cerebro.</li>
	<li>Postfix durante la noche con paraformaformadehído al 4%.</li>
	<li>Transfiera el cerebro a 40 mL de sacarosa al 30% en PBS de 100 mM en un tubo de 50 mL hasta que el cerebro flote hasta el fondo (aproximadamente 3 días).</li>
	<li>Snap congelar el cerebro en metilbutanol durante 2 min a - 80 °C.</li>
	<li>Asegure el tejido cerebral en una plataforma metálica dentro de un criostato de -20 °C.</li>
	<li>Corte las secciones coronales de 50 μm de espesor usando el criostato.</li>
	<li>Transfiera las rebanadas cerebrales a los portaobjetos de vidrio con un cepillo fino.</li>
	<li>Montar secciones en 0,3 mL de medio antifade y cubrir con cubrebocas de 22 mm y 50 mm.</li>
	<li>Mantenga los portaobjetos de vidrio en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que se sequen.</li>
	<li>Imagen de las neuronas objetivo con un microscopio confocal utilizando Z-pila basada en los límites de la región del cerebro y las características morfológicas de las neuronas. NOTA: Los ajustes de microscopio confocal utilizados fueron: aumento de 60 X (A/1.4, aceite), y un intervalo de plano Z de 0.15 μm (tamaño del agujero de alfiler 30 μm; radio del agujero de alfiler proyectado hacia atrás 167 nm) utilizando una longitud de onda de 488 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse%3A+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li>
<li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li>
<li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li>
<li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).</li>
<li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+in+neuroscience+research%3A+is+it+a+rat+race%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models%2C+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li>
<li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).</li>
<li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+vigilance+in+rats%3A+task+validation+and+effects+of+age%2C+amphetamine%2C+and+benzodiazepine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li>
<li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li>
<li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+NeuroVirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.

En este protocolo, establecimos un modelo de infección por VIH inducida por EcoHIV en ratas. Específicamente, describimos una inyección stereotaxic bilateral de EcoHIV en la corteza que indujo con éxito la infección vih activa en el cerebro de la rata 7 días de poste-inyección. Además, demostramos que la infección por EcoHIV en ratas podría ser un buen sistema biológico para estudiar aspectos clave de HAND. Ocho semanas de infección post-EcoHIV, ratas exhibieron deterioros neurocognitivos significativos, que incluyeron l...

Los sistemas biológicos han mejorado nuestra comprensión de los trastornos neurocognitivos asociados al VIH-1 (HAND) y sus mecanismos neuronales subyacentes2. La determinación del sistema biológico más apropiado para un estudio determinado depende a menudo de la cuestión de interés2. La limitación de la gama de modelos animales huésped desafía los estudios de desarrollo de la enfermedad VIH-1. Para investigar la replicación viral y la patogénesis del VIH-1, Potash et al.3 crearon un modelo de ratón de infección activa por VIH-1, reemplazando la región codificante de la glicoproteína de la envoltura superficial del VIH, gp120, con mlv ecotrópica gp80, lo que llevó a la replicación viral exitosa en ratones4. Después de las inyecciones de venas de cola en ratones quiméricos de VIH (EcoHIV), se observaron muchas características que se asemejaban a las de los individuos seropositivos del VIH-1 (por ejemplo, linfocitos y macrófagos infectados, dirigidos a respuestas inmunitarias antivirales, e inflamación3,5,6).
Aunque los ratones y las ratas son miembros de muridos, las diferencias fundamentales de las especies pueden influir en su idoneidad para cuestiones experimentales específicas7. Por lo tanto, la extensión del modelo de infección por EcoHIV a ratas (comúnmente utilizado en estudios de abuso de drogas y trastornos neurocognitivos) sería ventajosa en el estudio de neuroHIV. Por ejemplo, su mayor tamaño hace que la implantación de catéteres yugulares para procedimientos de autoadministración de fármacos sea más práctica8. Las técnicas de autoadministración de fármacos en ratas se han utilizado para evaluar la motivación en el VIH-19. Además, muchas tareas neurocognitivas/conductuales fueron diseñadas inicialmente para ratas10. Aquí, divulgamos la utilización de inyecciones stereotaxic de EcoHIV en ratas para extender el modelo de la infección de EcoHIV y para permitir una oportunidad dominante de dirigir las preguntas nuevas relacionadas con neuroHIV y la MANO.

<table><tbody><tr><td>293FT celdas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Solución antibiótica-antimicótica</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Corning BioCoatGelatina 75cm&sup2; Matraz de cultivo celular de cuello inclinado rectangular con tapón ventilado Life</td><td>Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM con L-glutamina, 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodio</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>taladro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #7</td><td>World Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrífuga con tapa a presión Biopur Tubos de bloqueo seguro</td> Life <td>Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Plus Antibacterial, 4-0 Polyglactin 910 Sutura, 27 pulg. FS-2</td><td>Med Vet International</td><td>VCP422H</td><td></td></tr><tr><td>jeringa Hamilton Hamilton</td><td></td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Lipofectamine 3000 Reactivo de transfección</td><td>Life Technologies</td><td>Pinzas</td> de iris L3000015 <td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ELISA p24 asociado a lentivirus</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador Lenti-X</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Suero Reducido</td><td>Tecnologías de Vida Media 11058021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>aparato estereotáxico</td><td>Kopf Instruments</td><td>Modelo 900</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tijeras</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de rata de la infección cerebral ecohiv

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

Se ha estudiado bien que el modelo de ratón infectado ecoHIV es de gran utilidad en la investigación de las complicaciones neurológicas asociadas al VIH. El establecimiento del modelo de rata infectada EcoHIV para estudios de abuso de drogas y trastornos neurocognitivos, sería beneficioso en el estudio de neuroHIV y trastornos neurocognitivos asociados al VIH-1 (HAND). En el actual estudio, demostramos la creación acertada de un modelo de la rata de la infección vih activa usando el VIH quimérico (EcoHIV). En primer lugar, la construcción lentiviral de EcoHIV se envasaba en células cultivadas de 293 FT durante 48 horas. Entonces, el medio condicional fue concentrado y ºteado. Después, realizamos inyecciones stereotaxic bilaterales del EcoHIV-EGFP en el tejido cerebral de la rata de F344/N. Una semana después de la infección, se detectaron señales de fluorescencia de EGFP en el tejido cerebral infectado, lo que indica que EcoHIV induce con éxito una infección activa por VIH en ratas. Además, immunostaining para el marcador microglial de la célula, Iba1, fue realizado. Los resultados indicaron que la microglía era el tipo de célula predominante que albergaba EcoHIV. Además, las ratas de EcoHIV exhibieron alteraciones en el proceso temporal, un mecanismo neurobehavioral subyacente potencial de la MANO así como la disfunción sináptica ocho semanas después de la infección. En conjunto, el presente estudio extiende el modelo EcoHIV de la infección por VIH-1 a la rata que ofrece un valioso sistema biológico para estudiar los reservorios virales del VIH-1 en el cerebro, así como la MANO y las comorbilidades asociadas, como el abuso de drogas.

El medio condicionado fue recogido del lentivirus de las células infectadas EcoHIV-EGFP 293FT. Después, fue concentrado y ºdado, entonces stereotaxically inyectado en el cerebro (región cortical) de las ratas de F344/N. Siete días después de la inyección, las ratas fueron sacrificadas y las imágenes fueron tomadas de las rebanadas coronales del cerebro que se extendían de bregma 5.64 milímetros a bregma -4.68 milímetros. En la Figura 1A,hay señales significativas de EcoHIV-EGFP en todo el ce...

Aquí, presentamos un protocolo para establecer un nuevo modelo de rata de infección activa por VIH usando VIH quimérico (EcoHIV), que es fundamental para mejorar nuestra comprensión de los reservorios virales del VIH-1 en el cerebro y ofrecer un sistema para estudiar los trastornos neurocognitivos asociados al VIH y las comorbilidades asociadas (es decir, el abuso de drogas).

Un modelo de rata de la infección cerebral EcoHIV

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Usando ratas, este protocolo se puede utilizar para establecer un nuevo modelo de la infección vih activa usando el VIH quimérico. con ratas, el establecimiento del modelo de infección por EcoHIV para estudios de abuso de drogas y trastornos neurocognitivos podría ser beneficioso para el estudio del neuro VIH y los trastornos neurocognitivos asociados al VIH-1. La demostración del procedimiento será Hailong Li, un investigador asociado de mi laboratorio.Para el envasado del virus en 293 células T, sembra de cinco veces 10 a la quinta 293 células T por mililitro de DMEM suplementado con 10% de FBS en cada uno de los dos frascos de 75 centímetros cuadrados recubiertos de gelatina e incubar las células a 37 grados centígrados hasta que los cultivos alcancen el 50% de confluencia. El día de la transfección, diluir 22,5 microlitros de reactivo de transfección en 750 microlitros de medio por matraz en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y vórtice la solución durante tres segundos. Diluir 20 microgramos del ADN quimérico del plásmido EcoHIV en 750 microlitros de medio en un segundo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros por matraz con mezcla exhaustiva.Combine el ADN diluido con el reactivo de transfección diluido con una mezcla suave e incube la solución resultante durante 15 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, añadir cada suspensión de virus a 10 mililitros de medio DMEM de preguerra y añadir cada solución complementada por virus a un matraz de 293 células T. Después de dos días de cultivo celular, acoge el sobrenadante de los matraces en un solo tubo cónico de 50 mililitros para la centrifugación y transfiera el sobrenadante clarificado a un nuevo tubo de 50 mililitros.Agregue ocho mililitros de Lenti-X Concentrator al sobrenadante clarificado y mezcle con una inversión suave. Después de una incubación de dos días a cuatro grados Centígrados, centrífuga la mezcla y retire cuidadosamente el sobrenadante, luego resuspiente suavemente el pellet con 100 microlitros de PBS de 100 milimolares y use un kit P24 ELISA para diezmar la concentración del virus. Para la inyección ecoHIV-EGFP, después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal, afeite el cabello de la región cerebral y esterilice la piel expuesta dos veces con etanol al 70% y un exfoliante a base de clorhexidina.Asegure la rata en una posición propensa en un aparato esteretáxico y haga una incisión de cinco a seis centímetros a través de la piel a lo largo de la línea media del cuero cabelludo. Marque una posición de perforación a 0,8 milímetros de lateral y una rostral de 1,2 milímetros a bregma y perfore un agujero de 0,4 milímetros de diámetro en cada posición del cráneo. Cargue de 1,04 veces de 10 a las sextas unidades de transducción por mililitro de solución de Lentivirus EcoHIV titulada en una jeringa de inyección de 10 microlitros y asegure la jeringa al aparato estereotáxico.Mueva la aguja cerca de la superficie de un orificio de perforación e inserte la aguja 2,5 mililitros en el orificio. Infunda un microlitro de solución de virus a una velocidad de 0,2 microlitros de virus por minuto. Cuando se haya inyectado todo el virus, deje la aguja dentro del área de inyección durante cinco minutos antes de retraer lentamente la aguja hasta que esté fuera del cráneo de la rata.Cierre la incisión de la piel con una sutura de hilo de seda 4-0 y esterilice la solución con etanol al 70%, luego coloque a la rata en una cámara de recuperación con una almohadilla térmica con monitoreo hasta que recoste. De una a ocho semanas después de la infusión viral, después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal, fije la rata en una posición supina dentro de una campana extractora e incise la piel a lo largo de la línea media torácica. Corte el diafragma para abrir la cavidad torácica e inserte una aguja calibre 20 por 25 milímetros en el ventrículo izquierdo.Abra inmediatamente la aurícula derecha con tijeras y perfunda 50 mililitros de PBS preenfriado de 100 milimolares a una velocidad de flujo de cinco mililitros por minuto. Cuando se haya entregado todo el PBS, perfundir con 100 mililitros de paraformadehído frío al 4%. Cuando se haya entregado todo el fijador, extraiga el cerebro del cráneo y fije el tejido durante la noche en paraformacionaldehído fresco al 4%.A la mañana siguiente, coloque la muestra en 40 mililitros de sacarosa al 30% en PBS de 100 milimolares en un tubo de 50 mililitros durante aproximadamente tres días hasta que el cerebro se asiente en la parte inferior del tubo antes de congelar el tejido cerebral en butanol de metilo durante dos minutos a menos 80 grados Celsius. Después de congelar, use un criostato de menos 20 grados Celsius y un pincel fino para adquirir secciones coronales de 50 micras de espesor. Una vez obtenidas todas las secciones, cubra las muestras con 300 microlitros de medio antidesvanecimiento y montelas con 22 cubrebocas de 50 mililitros.Cuando el medio se ha secado, imagen de las secciones por microscopía confocal. Siete días después de la inyección de Lentivirus, las imágenes de rebanadas cerebrales coronales de rata revelan una presencia significativa de señales ecoHIV-EGFP en todo el tejido cerebral, especialmente dentro de la corteza y la circunvolución dentada del hipocampo. El etiquetado dual con las sondas Iba1 y EcoHIV-EGFP proporciona una fuerte evidencia de que la microglía es el tipo de célula predominante que alberga la expresión de EcoHIV en el cerebro.Ocho semanas después de la infección, EcoHIV inyectó animales exhiben una insensibilidad relativa a la manipulación del intervalo interestímulo como lo demuestra una función de intervalo relativamente más plana en comparación con los controles salinos. Además, las ratas inyectadas EcoHIV muestran alteraciones profundas en su morfología dendrítica de la espina dorsal según lo evidenciado por una frecuencia relativa creciente de espinas dendríticas más cortas con diámetros crecientes de la cabeza y del cuello en relación con animales de control. La concentración y titulación del medio de condición antes de la inyección estereotáxica es fundamental para garantizar los resultados consistentes y replicables en todos los experimentos.Esta inyección estereotáxica regional específica de EcoHIV proporciona una infección eficiente por el VIH dentro del cerebro y produce déficits de procesamiento temporal en ratas. La utilización de inyecciones estereotáxicas contra el VIH en ratas para extender el modelo de infección por EcoHIV ofrece una oportunidad clave para abordar nuevas preguntas relacionadas con el neuro VIH en cuestión.

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Investigación

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Neurociencia

El modelo de rata postnatal para la lesión cerebral hipóxico-isquémica es un modelo bien establecido de los derechos humanos neonatal encefalopatía hipóxica isquémica (EHI). En este artículo se describe el modelo de HIE en crías de ratas post-natal.

El modelo de encefalopatía isquémica hipóxica de la isquemia perinatal

Este video muestra el procedimiento de inyectar virus quiméricos del VIH en la corteza del cerebro de una rata, donde el ARN del virus se integra en el genoma del huésped, se replica y se propaga para establecer una infección activa por el VIH en el modelo experimental.

Establecimiento de una infección activa por el VIH en un modelo de ratas

La encefalopatía del prematuro abarca las anomalías del sistema nervioso central asociadas con las lesiones del parto prematuro. Este informe describe un modelo de rata clínicamente relevante de hipoxia-isquemia sistémica transitoria en el útero y administración de lipopolisacáridos intraamnióticos (LPS) que imita la corioamnionitis, y el impacto relacionado de los estímulos infecciosos y la subperfusión placentaria en el desarrollo del SNC.

Modelado Encefalopatía del Prematuro El uso prenatal hipoxia-isquemia con lipopolisacárido intraamniótica en ratas

El protocolo presentado aquí permite la reproducción de una desmielinización generalizada de la materia gris de ambos hemisferios corticales en ratas agouti oscuras macho adultas. El método consiste en la implantación intracerebral de un catéter, la inmunización subclínica contra la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina y la inyección intracerebral de una mezcla de citoquinas proinflamatorias a través del catéter implantado.

Modelo de rata de desmielinización cortical cerebral generalizada inducida por una inyección intracerebral de citoquinas proinflamatorias

Aquí, presentamos un protocolo para crear un modelo murino irevolucionario inmunocompetente (Instituto de Investigación del Cáncer) de infección del sistema nervioso central para mostrar el desarrollo de la neuropatía. El control de trastornos encefalíticos víricos agudos por puntuaciones idénticas de enfermedad podría realizarse para mostrar in vivo la neuropatía inducida por el virus del dengue.

Un modelo murino de enfermedad similar a la encefalitis vírica aguda inducida por el virus del dengue

El propósito de este estudio es establecer y validar un modelo animal para la investigación en las etapas de recuperación y secuenciación de la isquemia cerebral mediante la prueba de infarto cerebral y la función sensorimotor después de la oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media (MCAO/R) después de 1-90 días en ratas.

Un modelo preclínico para evaluar la recuperación cerebral después de un accidente cerebrovascular agudo en ratas

Aquí presentamos un método de limpieza de tejido hidrofóbico que permite la visualización de moléculas objetivo como parte de estructuras cerebrales intactas. Esta técnica ha sido validada para el control de F344/N y ratas transgénicas VIH-1 de ambos sexos.

Un método de limpieza de tejido hidrófobo para el tejido cerebral de rata

La hidrocefalia poshemorrágica del prematuro (PHHP, por sus siglas en inglés) se puede modelar en ratas neonatas mediante la combinación de corioamnionitis y hemorragia intraventricular. La combinación de estos eventos prenatales y postnatales recapitula con precisión las características clínicas distintivas de la PHHP, incluida la macrocefalia, la ventriculomegalia y la presión intracraneal elevada, a lo largo de la vida.

Modelización de la hidrocefalia poshemorrágica de la prematuridad en ratas

Este protocolo describe cómo la combinación de la infección por EcoHIV con ratones Tmem119-EGFP ofrece un valioso sistema biológico para investigar las alteraciones microgliales y los reservorios virales en modelos de roedores con trastornos neurocognitivos asociados al VIH.

Identificación de células infectadas por EcoHIV en ratones transgénicos manipulados con microglía

Este artículo presenta un protocolo para la inducción de un modelo único de trastorno bipolar en ratas que captura tanto el comportamiento maníaco como el depresivo.

Desarrollo de un modelo de rata para el trastorno bipolar

Aprende a establecer un modelo de infección cerebral EcoHIV en ratas mediante inyección estereotáxica. Este método permite estudiar trastornos neurocognitivos asociados al VIH y comorbilidades en neurociencia.

Un modelo de rata de la infección cerebral EcoHIV

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