Name: Visualización de los efectos del daño oxidativo en las cámaras de huevos de Drosophila usando imágenes en vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprende a visualizar el daño oxidativo en ovarios de Drosophila melanogaster mediante imágenes en vivo con peróxido de hidrógeno. Este protocolo permite estudiar cambios en mitocondrias y partículas Clu bajo estrés celular controlado.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Jeremy Smyth por el apoyo a las imágenes y a Ann C. Shenk por ilustraciones, producción y videografía. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (1R01GM127938 a R.T.C.).

1. Preparación de medios de disección e imágenes
NOTA: El medio más adecuado para este experimento de imágenes en vivo contiene los medios Drosophila de Schneider que contienen un 15% de suero bovino fetal inactivado por calor, 0,6 veces Pen-Strep y 200 μg/ml de insulina bovina, en lo sucesivo denominados medios de comunicación de Complete Schneider.
<ol><li>Realice la preparación de los medios bajo condiciones estériles para asegurarse de que no se contamine. Los medios de comunicación fueron desarrollados para apoyar a Drosophila ovarioles durante largos períodos de tiempo9.</li>
	<li>Agregue un 15% de suero bovino fetal inactivado por calor, 0,6 veces pen-strep y 200 μg/ml de insulina bovina a los medios de comunicación de Schneider.</li>
	<li>Mezcle bien el contenido y guárdelo a 4 °C durante la noche. NOTA: La insulina no se disuelve por completo en los medios de comunicación de Complete Schneider, y notará un precipitado asentarse en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Haga alícuotas de los medios de comunicación, asegurándose de dejar el precipitado, ya que interferirá con las imágenes. NOTA: Esta solución se puede utilizar en el plazo de un mes si se almacena en alícuotas a 4 °C.</li>
</ol>2. Colección de Drosophila para la disección
NOTA: Los procedimientos detallados de recopilación y disección de Drosophila también se pueden encontrar en Weil et al.10 y Parker et al.11.
<ol><li>Para obtener imágenes óptimas de células germinales femeninas, primero prepare un vial que contenga alimentos estándar para moscas de la harina de maíz y un poco de pasta de levadura húmeda que es la consistencia de la mantequilla de maní. Esto garantiza que las moscas hembra estén bien alimentadas y produzcan todas las etapas de desarrollo folículo para la toma de imágenes.</li>
	<li>Para moscas óptimamente sanas, recoger hembras de 0-1 día de edad y transferir con machos en un vial de alimento mosca que contiene pasta de levadura húmeda. NOTA: Asegúrese de que las moscas durmientes no se pongan en contacto con la pasta de levadura, ya que pueden pegarse a ella.</li>
	<li>Alimente las moscas de 3 a 7 días, cambiando el vial y la pasta de levadura diariamente. NOTA: Asegúrese de que la pasta de levadura entre en contacto con el alimento para mosca para que no se seque.</li>
</ol>3. Disección del ovario Drosophila
NOTA: Es importante preparar las soluciones multimedia frescas porque el peróxido de hidrógeno es susceptible a la oxidación y TMRE se degrada con el tiempo.
<ol><li>Justo antes de la disección, en los medios de Complete Schneider, preparar una nueva alícuota de solución de 2 μM H2O2, una alícuota fresca de 46 nM tetrametilrhodamina, éster etílico (TMRE) y una nueva alícuota de una solución TMRE de 46 nM que contiene 2 μM H2O2.
</li>
	<li>Para la disección del ovario, utilice dos pares de fórceps finos y un par de agujas de tungsteno electrolíticamente afiladas12. Para diseccionar los ovarios, llene 2-3 pozos de un plato de disección de fondo de vidrio (vaso de reloj) con Complete Schneider's que se ha calentado a temperatura ambiente.</li>
	<li>Anestesiar el vial de moscas engordadas con dióxido de carbono y segregar el número deseado de moscas hembra para ser diseccionadas. Coloque una sola mosca en los medios usando fórceps.</li>
	<li>Bajo un microscopio diseccionador, sujete suavemente la mosca por el tórax usando un par de fórceps finos. Con el otro par de fórceps, agarre la parte posterior y tire suavemente para extirpar los ovarios. NOTA: si los ovarios no salen suavemente usando este método, también se puede extirpar todo el abdomen de la mosca, y los ovarios se pueden exprimir suavemente de cualquiera de los extremos del abdomen usando fórceps.</li>
	<li>Retire cualquier cutícula o tejido extraño y, a continuación, transfiera los ovarios a un nuevo pozo que contenga medios frescos. Los ovarios todavía deben moverse de la vatina muscular circundante.</li>
</ol>4. Preparación de los ovarioles para la toma de imágenes
<ol><li>Usando agujas de tungsteno afilados, burlarse suavemente de los ovarioles, teniendo cuidado de eliminar la sheath muscular circundante(Figura 1).</li>
	<li>Burlarse suavemente de cualquier vatina muscular y fibras nerviosas unidas a los ovarioles aislados(Figura 2). NOTA: Si no se elimina la vatina muscular, el ovariole se agitará y se moverá, causando problemas con la adquisición de imágenes(Video 1).</li>
	<li>Si las estructuras subcelulares de interés están etiquetadas endógenamente, proceda al paso 4.4. Si las estructuras de interés serán etiquetadas con un tinte fluorescente, proceda a la Sección 5.</li>
	<li>Una vez que los ovarioles hayan sido diseccionados limpiamente, usando un micropipette, transfiéralos en una caída de 100 μL de los medios de imágenes de Complete Schneider en la depresión de vidrio de un plato inferior de vidrio. Los ovarioles individuales se hundirán en la parte inferior de la gota.</li>
	<li>Vaya a la Sección 6 para obtener imágenes. NOTA: Para las mitocondrias por imágenes y las partículas de Clu bliss, no deben transcurrir más de cinco o diez minutos desde el inicio de la disección hasta la toma de imágenes.</li>
</ol>5. Mitocondrias de tinción con TMRE
NOTA: Se pueden encontrar procedimientos detallados adicionales sobre la tinción viva de mitocondrias con tintes fluorescentes en Parker et al. 2017.
<ol><li>Después del paso 4.3, transfiera los ovarioles aislados en una caída de 100 μL de soporte TMRE de 46 nM en la depresión de vidrio de un plato inferior de vidrio. Los ovarioles individuales se hundirán en la parte inferior de la gota.</li>
	<li>Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Coloque la tapa en el plato con fondo de vidrio y coloque el plato en una caja cubierta durante el experimento para protegerlo de la luz. NOTA: Después de la incubación, las muestras se pueden tomar imágenes directamente sin lavados.</li>
	<li>Repita los pasos 5.1-5.2 para preparar al menos dos platos de ovarioles etiquetados con TMRE, uno para servir como grupo experimental y otro para servir como control.</li>
</ol>6. Adquisición de imágenes en vivo
<ol><li>Una vez montados los ovarioles, coloque uno de los platos inferiores de vidrio en el microscopio y configure los parámetros de imagen según sea necesario. Las longitudes de onda óptimas de excitación/emisión para el TMRE utilizado aquí son de 549 nm/574 nm.</li>
	<li>Después de localizar el campo de visión deseado, adquiera imágenes fijas o videos breves de uno o más ovarioles como desee como un registro de condiciones previas al tratamiento.</li>
</ol>7. Adición de peróxido de hidrógeno durante la toma de imágenes
<ol><li>Pausa las imágenes en vivo, retira la tapa del plato inferior de vidrio y añade cuidadosamente 100 μL de solución de 2 μM H2O2 al plato usando un micropipette si se toma imágenes de estructuras etiquetadas endógenamente. Si se toma imágenes de mitocondrias, agregue cuidadosamente 100 μL de 46 nM TMRE con 2 μM H2O2 solución al plato utilizando un micropipette (Video 2).<ol>
<li>Evite romper la superficie de la gota de soporte existente o añadir la solución demasiado rápido para no desplazar los ovarioles que descansan en la parte inferior del plato(Video 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reemplace la tapa del plato (cubierta del plato), reubique y vuelva a enfocar el campo de visión deseado si es necesario, y reanude las imágenes(Vídeo 3, Video 4, Figura 3, Figura 4).<ol>
<li>Cuídate de reanudar las imágenes lo más rápido posible después de la adición de H2O2, ya que el tratamiento experimental es sensible al tiempo(Video 5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adquirir imágenes fijas o videos breves de uno o más ovarioles como se desee. Esto servirá como un registro de las condiciones posteriores al tratamiento.</li>
	<li>Para el control, coloque el segundo plato inferior de vidrio en el microscopio y repita la Sección 6.</li>
	<li>Repita el paso 7.1, esta vez añadiendo 100 μL de soporte solo TMRE al plato. Si se toma imágenes de estructuras etiquetadas endógenamente, añada 100 μL de la solución de solo medios de Complete Schneider.</li>
	<li>Repita los pasos 7.2 y 7.3 para adquirir datos para el grupo de control. NOTA: Para las mitocondrias por imágenes y las partículas Clu bliss, no deben transcurrir más de tres o cinco minutos desde la adición de peróxido de hidrógeno hasta la toma de imágenes.</li>
</ol>

<ol><li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+iron+and+hydrogen+peroxide%3A+the+Fenton+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction.</a> Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).</li>
<li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Balbiani+body+and+the+fusome+mediate+mitochondrial+inheritance+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis.</a> Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).</li>
<li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clueless%2C+a+conserved+Drosophila+gene+required+for+mitochondrial+subcellular+localization%2C+interacts+genetically+with+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin.</a> Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).</li>
<li>Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clueless%2C+a+protein+required+for+mitochondrial+function%2C+interacts+with+the+PINK1-Parkin+complex+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila.</a> Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).</li>
<li>Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clueless+forms+dynamic%2C+insulin-responsive+bliss+particles+sensitive+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress.</a> Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).</li>
<li>Sen, A., Cox, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clueless+is+a+conserved+ribonucleoprotein+that+binds+the+ribosome+at+the+mitochondrial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane.</a> Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).</li>
<li>Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+egg+chambers+for+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila egg chambers for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402(2010).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).</li>
<li>Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Mitochondrial+Structure+and+Function+in+Drosophila+Ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54989(2017).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).</li>
<li>Wang, S., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+for+bcd+mRNA+localization+from+spatial+distribution+of+exu+protein+in+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis.</a> Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo podría ser una adición útil como control de artefactos debido a la disección de ovarios y la incubación de tejidos para cualquier experimento de imágenes en vivo. Los pasos críticos son similares a los que se encuentran para otros protocolos de imágenes en vivo. Aprender a diseccionar ovarios drosophila enteros toma práctica; sin embargo, esta habilidad generalmente se puede aprender bastante rápido con las herramientas de disección adecuadas. Más difícil de dominar es extirpar el músculo envolviendo los ovarios y cadaovariole 13. Esto debe hacerse para asegurar que las contracciones musculares no interfieran con la adquisición de imágenes. Si el uso de agujas de tungsteno afilado para ello no resulta exitoso, el germarium en la punta del ovariole se puede agarrar con fórceps y el ovariole extraído de la vaa de músculo. Sin embargo, esta técnica es problemática si se van a examinar las primeras etapas de desarrollo porque pueden dañarse. Otro paso clave es no desalojar los ovarioles que descansan en la parte inferior del plato al añadir H2O2. Un aspecto adicional importante es compartido por todas las imágenes en vivo: el investigador debe asegurarse de que la estructura de interés esté fluorescentemente bien etiquetada antes del tratamiento. Los platos utilizados aquí(Tabla de Materiales)se utilizan comúnmente para imágenes en vivo; sin embargo, cualquier plato o tobogán con un tubo de cubierta de vidrio en la parte inferior o incluso un gran tubo de cubierta de vidrio debe funcionar siempre y cuando la caída de los medios pueda ser cubierta para evitar la evaporación de los medios. Si bien utilizamos un microscopio en particular, cualquier microscopio invertido con un objetivo de ampliación suficiente para ver la estructura subcelular en cuestión y una cámara conectada que tenga suficiente resolución y velocidad de captura de imágenes debe funcionar.
Mientras que nuestro laboratorio está principalmente interesado en la función mitocondrial, este método podría ser útil examinando la dinámica y localización de cualquier estructura subcelular u orgánulo, como el núcleo, citoesqueleto o reticulum endoplasmático. Sin embargo, este método tiene limitaciones. Con el fin de añadir peróxido de hidrógeno, el tejido debe estar en un medio acuoso. Un método alternativo para la toma de imágenes en vivo es utilizar aceite de halocarbono, que ha sido fundamental para describir muchos procesos importantes en Drosophila ovarioles incluyendo el primer ejemplo de movimiento dinámico de GFP en un organismo modelo7,14. Además, la adición de peróxido de hidrógeno a los medios de comunicación causa daño oxidativo de propagación amplia que puede ser un insulto demasiado general al tejido para ser informativo para el proceso celular de interés, particularmente para experimentos más largos que examinan el desarrollo. Aunque puede que no sea factible realizar experimentos que requieran visualizar la célula durante largos períodos de tiempo debido a este daño oxidativo rápido, extenso y probablemente irreversible, hemos visto que el tratamiento agudo de peróxido de hidrógeno que hemos descrito es aplicable a la mayoría de las etapas de la ogénesis, ya que somos capaces de ver los mismos efectos en la mayoría de las etapas dentro del período de tiempo de diagnóstico por imágenes. Dado el bajo costo y la facilidad del protocolo, puede ser un control útil para los daños y se puede utilizar como tratamiento antes de la fijación y el etiquetado de anticuerpos también.
En nuestras manos, el tratamiento H2O2 imita los cambios en la mislocalización mitocondrial y la dispersión de partículas Clu bliss que vemos en varios mutantes de Drosophila. También imita los resultados que vemos para los nuevos investigadores en las técnicas de disección de aprendizaje de laboratorio. Por lo tanto, este método reveló claramente que la preparación de la muestra y el estrés celular general pueden conducir a cambios inesperados y previamente inexplicables en la mislocalización mitocondrial y la presencia de partículas bliss. Al avanzar en esta técnica, las concentraciones de peróxido de hidrógeno podrían modularse utilizando una concentración mayor o menor. Si se observa un efecto celular usando una concentración más baja, es posible que el fenotipo de estrés pueda ser reversible reemplazando el medio por el de Complete Schneider. Diferentes factores estresantes celulares como la hidración de clorofenilo de cianuro de carbonilo (CCCP), arsenita o choque térmico simple podrían resultar útiles para el estrés celular general para otras estructuras subcelulares. Dado que las imágenes en vivo de los tejidos ex vivo requieren manipulación e incubación manual en diferentes medios, este control debe ser una adición útil para asegurar que cualquier observación esté lo más cerca posible de la fisiología normal.

Múltiples factores de estrés celular diferentes pueden surgir durante el cultivo experimental y la manipulación de los tejidos ex vivo, incluyendo choque de calor, estrés oxidativo, estrés osmótico, estrés nutricional, y condiciones de toxicidad. La imagen en vivo es una poderosa herramienta utilizada para visualizar los cambios en tiempo real en los tejidos ex vivo después del tratamiento experimental y la manipulación. Las disecciones y manipulación de tejidos finos toman práctica, y la cantidad de tiempo desde la disección hasta la toma de imágenes puede variar dependiendo de la experiencia. La razón para desarrollar este método se basa en la preocupación de que la preparación de tejido para imágenes en vivo puede causar estrés celular durante la disección y la preparación por imágenes. Esto podría ser particularmente problemático para los procesos sensibles a los cambios en el metabolismo celular y los niveles de oxígeno disponibles, como la función mitocondrial. Si bien tener una muestra paralela de tipo salvaje es un control importante, todavía existe la posibilidad de que algunos o todos los cambios observados en las estructuras subcelulares podrían deberse al daño o al estrés celular por disección y no reflejan la fisiología normal o el tratamiento o mutación que se está estudiando.
Para abordar este problema potencial, utilizamos la adición de peróxido de hidrógeno durante las imágenes en vivo con el fin de inducir daño oxidativo celular1. El propósito de este método es inducir daño a los tejidos con el fin de monitorear el efecto en las estructuras subcelulares. Este protocolo es útil para dos propósitos: 1) determinar si los cambios en la localización subcelular de la estructura de interés se deben al estrés causado por la disección inexperta y 2) una vez que el investigador confía en las técnicas de disección descritas para monitorear el efecto del estrés controlado en la estructura de interés. Aquí mostramos dos ejemplos de cómo el aumento del daño oxidativo causa cambios en dos estructuras subcelulares, mitocondrias y partículas Clu bliss. Para ello, utilizamos el ovario de Drosophila, que es un modelo común para los estudios de imágenes en vivo. El primer ejemplo examina la localización mitocondrial. En nuestra experiencia, la localización mitocondrial normal en las células germinales femeninas es altamente sensible a las perturbaciones y puede actuar como un presagio del estrés celular. Las mitocondrias en las células germinales femeninas de Drosophila normalmente se dispersan uniformemente a lo largo del citoplasma2. La adición de peróxido de hidrógeno hace que los orgánulos se deslocalicen rápidamente y se agrupe de manera similar a varias mutaciones3,4,5. El segundo ejemplo son las partículas bliss formadas por Clueless (Clu). Clu es una ribonucleoproteína que se difunde a lo largo del citoplasma; sin embargo, también forma partículas asociadas a mitocondrias en condiciones celulares óptimas5. Debido a que la presencia de partículas Clu depende de condiciones celulares saludables, las hemos llamado partículas "bliss"3,5,6. La adición de peróxido de hidrógeno hace que estas partículas se dispersen rápidamente y se vuelvan homogéneas en el citoplasma5. En el transcurso de nuestros estudios, hemos observado cambios en la localización de ambas estructuras subcelulares, pero sólo después de realizar estudios de imágenes en vivo podríamos apreciar plenamente el efecto del estrés celular y el daño oxidativo en la localización y dinámica de las mitocondrias y partículas bliss.
La utilidad de este protocolo como una adición a métodos ya establecidos o alternativos depende de varios factores. En primer lugar, el protocolo de imágenes debe ser apto para la adición de fármacos. Si la muestra se monta bajo un cubrecoches y en aceite de halocarbono, este método no sería posible7. H2O2 adición causa un rápido aumento en el daño oxidativo, por lo tanto, este escala de tiempo puede no ser apropiado. El daño oxidativo puede considerarse como un proxy para la hipoxia; sin embargo, puede ser demasiado duro o demasiado generalizado para funcionar como un control adecuado para el daño de ciertos componentes subcelulares. Por último, para los experimentos de imágenes que duran horas, como los que siguen un proceso de desarrollo, la adición de H2O2 puede ser demasiado fuerte (porejemplo, 8). Probar una curva de concentración puede superar esta limitación.

<table><tbody><tr><td>Levadura seca activa</td><td>Red Star&reg;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 gas</td><td></td><td></td> con <td>una pureza del 99,9 %</td></tr><tr>Almohadilla <td></td><td></td><td></td>de<td>CO2</td></tr><tr><td>Microscopio de disección, modelo Nikon SMZ645</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agujas de disección - PrecisionGlide Agujas BD</td><td></td><td>305165</td><td>B-D 21G1</td></tr><tr><td>Agujas de disección - Jeringas PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Punta Luer-Lok, tamaño de 3 ml</td></tr><tr><td>Agujas de disección - alambre de tungsteno</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>73800</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5 (2 pares)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>NI-150 Iluminador de alta intensidad</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Suero fetal bovino, inactivado por calor</td><td>Fisher Scientific</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Schneider's Drosophila Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno, 30% (p/p) en H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Insulina de páncreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Disco giratorio microscopio</td><td>Nikon</td><td></td><td>También se pueden utilizar visores equivalentes</td></tr><tr><td>Lonza BioWhittaker Antibióticos: Mezclas de penicilina y estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>MatTek Corporation Platos con fondo de vidrio, 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>NC9344527</tr><tr><td>Micropipetas y puntas de tamaño adecuado Tubos de</td> microcentrífuga <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 1,7 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina, éster etílico, perclorato (TMRE)</td><td>AnaSpec</td><td>AS-88061</td><td></td></tr><tr><td>w[1118]</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5905</td><td>Moscas de tipo salvaje</td></tr><tr><td>y w; clu[CA06604]</td><td></td><td>Disponible bajo petición.</td><td>Clu::GFP moscas trampa</td></tr></tbody></table>

visualización de los efectos del daño oxidativo en las cámaras de huevos de drosophila usando imágenes en vivo

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Las imágenes en vivo de los ovarios Drosophila melanogaster han sido fundamentales para comprender una variedad de procesos celulares básicos durante el desarrollo, incluyendo el movimiento de partículas ribonucleoprotein, localización de ARNM, movimiento de orgánulo y dinámica citoesquelético. Hay varios métodos para la toma de imágenes en vivo que se han desarrollado. Debido al hecho de que cada método consiste en diseccionar los ovarioles individuales colocados en medios o aceite de halocarbono, el daño celular debido a la hipoxia y/o manipulación física inevitablemente ocurrirá con el tiempo. Un efecto aguas abajo de la hipoxia es aumentar el daño oxidativo en las células. El propósito de este protocolo es utilizar imágenes en vivo para visualizar los efectos del daño oxidativo en la localización y dinámica de las estructuras subcelulares en los ovarios de Drosophila después de la inducción de daño celular controlado. Aquí, utilizamos peróxido de hidrógeno para inducir daño oxidativo celular y dar ejemplos de los efectos de tal daño en dos estructuras subcelulares, mitocondrias y partículas clu bliss. Sin embargo, este método es aplicable a cualquier estructura subcelular. Las limitaciones son que el peróxido de hidrógeno sólo se puede añadir a los medios acuosos y no funcionaría para imágenes que utilizan aceite de halocarbono. Las ventajas son que el peróxido de hidrógeno está disponible y barato, actúa rápidamente, sus concentraciones se pueden modular, y el daño oxidativo es una buena aproximación del daño causado por la hipoxia, así como el daño general del tejido debido a la manipulación.

Los protocolos descritos se pueden utilizar para estudiar los efectos del peróxido de hidrógeno durante las imágenes en vivo de los ovarios de Drosophila. Como se muestra en la Figura 3, Figura 4, Video 3 y Video 4, este procedimiento proporciona un medio eficaz para visualizar los cambios de tejido y la dinámica después del tratamiento experimental en tiempo real. Es importante destacar que este protocolo es específico para la adición de H2O2 a ovarioles mientras se toma imágenes; sin embargo, puede adaptarse para la adición exógena de otros fármacos o reactivos de interés. Además, los folículos pueden ser etiquetados con cualquier colorante fluorescente de interés (por ejemplo, tetrametilrhodamina (TMRE), LysoTracker) antes de la toma de imágenes (Video 3). Los pasos más críticos para obtener resultados claros por imágenes son 1) la disección y aislamiento adecuados de los elementos contractiles eliminados(Figura 1 y Figura 2)y 2) la velocidad a la que se reinicia la imagen después de la adición de peróxido de hidrógeno. Video 4 es una ilustración de un folículo correctamente diseccionado que permanece estable a lo largo de la duración de la imagen en comparación con video 1, que ilustra un folículo mal diseccionado saliendo del campo de visión durante la toma de imágenes. Video 5 es una ilustración en la que los efectos H2O2 en las mitocondrias etiquetadas con TMRE ya han progresado antes del inicio de las imágenes como resultado de demasiado tiempo transcurrido. En comparación con video 3 en el que las imágenes se reiniciaron inmediatamente después de la adición de peróxido de hidrógeno (tiempo 0) y las mitocondrias intactas y dispersas todavía son visibles, las mitocondrias en video 5 ya han comenzado a agruparse visiblemente y perder su potencial de membrana al reiniciar las imágenes. Este problema se atribuye principalmente a la interrupción de las posiciones de la muestra durante la adición de H2O2 y se puede aliviar siguiendo la técnica para mantener intacto el medio de imagen y la posición de la muestra (Vídeo 2). Cabe destacar que en los experimentos de control realizados sin H2O2 añadidos a los medios de comunicación, las mitocondrias en folículos permanecen debidamente dispersas, y el tinte TMRE permanece secuestrado en las mitocondrias.
<img alt="Diagrama de anatomía del óvulo e imágenes de microscopio; Estudio detallado de la estructura ovárica y las vainas musculares." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1:Aislamiento de ovarioles individuales de ovarios drosophila. (A) Caricatura que indica un par de ovarios, un solo ovariole (flecha) con el germarium en la punta (punta de flecha) y las dos sheaths musculares que rodean el ovariole (marrón, epitelial) y el ovario (marrón, peritoneal). (B) Ovario drosophila diseccionado. (C)Posterior separación del ovario burlado en ovarioles individuales (flecha). Barra de escala = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Comparación de la morfología de las células de levadura, imagen de microscopio, dos paneles, análisis de integridad de la pared celular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2:Eliminación de fibras nerviosas y elementos contractiles de un solo ovarioles. (A) Solo ovariole con restos de tejido nervioso y la colilla muscular todavía unida (flecha). (B) Extracción suave de todo el tejido restante unido a ovariole en A (flecha). Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Efecto del peróxido en el tejido a lo largo del tiempo; series de imágenes de microscopía de fluorescencia; Análisis de reacciones oxidativas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: H2O2 causa mislocalización mitocondrial. (A-A") Alambique de imagen en vivo de un folículo bien alimentado cluCA06604 (Clu::GFP flies) folículo. La adición de H2O2 hace que las mitocondrias se agrupen durante la duración de las imágenes. El etiquetado TMRE de mitocondrias indica que las mitocondrias se dispersan inicialmente en el momento 0(A),y que las mitocondrias comienzan a agruparse después de la adición H2O2 (A′) En un momento posterior, el etiquetado TMRE se vuelve irregular debido a que las mitocondrias pierden su potencial de membrana y por lo tanto su capacidad para secuestrar el tinte (A". Blanco = TMRE (A-A"). Barras de escala: 10 μm in (A) para A-A"5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Microscopía de lapso de tiempo de células con tratamiento con H2O2 que muestra estrés oxidativo durante 10 minutos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62157/62157fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: H2O2 dispersa Clu. (A-A") Imágenes en vivo de un folículo clu CA06604 bien alimentado. La adición de H2O2 hace que las partículas se dispersen y se vuelvan homogéneas en el citoplasma durante la duración de la toma de imágenes. Blanco = Clu::GFP (A-A". Barra de escala: 40 μm in (A) para A-A"5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/62157fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Vídeo 1: Folículo de una hembra clu CA06604. Como se describe en la Figura 2,la falta de eliminación de elementos contractiles de fibra nerviosa de un solo ovarioles provocará una marcada deriva y movimiento de los ovarioles durante la toma de imágenes y la posterior incapacidad para analizar los datos de imágenes. Blanco = Clu::GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%201%20-%20Failure%20to%20remove%20contractile%20elements.mov" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 2: Adición adecuada de H2O2 para probar el plato. El peróxido de hidrógeno debe añadirse a la platillo de muestra utilizando un micropipette de tamaño adecuado. Dispensar H2O2 sin romper la superficie de los medios. Se tiene cuidado de evitar romper la superficie del medio de imágenes para minimizar la deriva de la muestra durante la adición de peróxido de hidrógeno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%202%20-%20Proper%20Addition%20of%20H2O2%20to%20Sample%20Dish.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 3: Adición H2O2 durante la toma de imágenes de folículos etiquetados por TMRE. Folículo de una hembra clu CA06604 manchada con TMRE. H2O2 causa deslocalización mitocondrial en folículos de Drosophila. Blanco = tinte TMRE. Imagen de un fotograma por 15 s durante 20 min, y el vídeo es de 10 fotogramas por segundo5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%203%20-%20H2O2%20stresses%20mitochondria.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Vídeo 4: Adición H2O2 durante la toma de imágenes de folículos Clu::GFP. Folículo de una hembra clu CA06604. H2O2 dispersa las partículas Clu como se describe en la Figura 4. Blanco = Clu::GFP. Imagen de un fotograma por 15 s durante 15 minutos, y el vídeo es de 10 fotogramas por segundo. 5<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%204%20-%20H2O2%20disperses%20particles.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a> 
Vídeo 5: Imágenes retrasadas después dela adición de H2O2. Folículo de una hembra clu CA06604. La adición de hidrógeno-peróxido a los folículos es un tratamiento sensible al tiempo. El reinicio de las imágenes se retrasó en este video como resultado del desplazamiento de la muestra durante la adición de H2O2. Las mitocondrias ya han comenzado a agruparse visiblemente y a perder su potencial de membrana al reiniciar las imágenes en el momento 0 (en comparación con el tiempo 0 en video 3). La falta de reanudación de las imágenes rápidamente después del tratamiento dará lugar a resultados inexactos e inutilizables, ya que los primeros efectos experimentales se perderán antes de la toma de imágenes. Blanco = TMRE. Imagen de un fotograma por 15 s durante 20 min, y el vídeo es de 10 fotogramas por segundo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62157/Video%205%20-%20Delayed%20imaging%20after%20H2O2%20addition.mov" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>

El objetivo de este protocolo es utilizar imágenes en vivo para visualizar los efectos del daño oxidativo en la localización y dinámica de las estructuras subcelulares en los ovarios de Drosophila.

Visualización de los efectos del daño oxidativo en las cámaras de huevos de Drosophila usando imágenes en vivo

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Nuestro laboratorio utiliza Drosophila melanogaster para identificar y caracterizar genes y vías que regulan la función mitocondrial durante el desarrollo y la homeostasis fisiológica. El protocolo presentado aquí utiliza imágenes en vivo con la adición de peróxido de hidrógeno para visualizar los efectos del daño oxidativo en la localización y dinámica de las estructuras subcelulares en el ovario adulto de Drosophila. Con frecuencia utilizamos protocolos de diagnóstico por imágenes para estudiar cómo las mutaciones alteran la localización y el movimiento mitocondriales normales en las células germinales femeninas.En el transcurso de nuestros estudios encontramos que el estrés introducido por la disección u otros factores estresantes celulares tuvo un profundo impacto en la localización mitocondrial. Como control para identificar si el estrés general, a diferencia del tratamiento experimental, es la causa de cualquier cambio en la localización o el comportamiento de las estructuras subcelulares. Desarrollamos este protocolo para introducir el estrés de control utilizando peróxido de hidrógeno.En este video, demostraremos cómo el daño oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno cambia la distribución de las mitocondrias y la ribonucleoprotein Clu. Los medios más adecuados para esta técnica de imágenes en vivo contenían los medios Drosophila de Schneider que contenían 15% de suero bovino fetal inactivado por calor, 0,6 X Pen-Strep y 200 microgramos por insulina bovina microlitro, en lo sucesivo denominados medios completos de Schneider. La realización de la preparación de los medios bajo condiciones estériles garantizará que no se contamine.Mezcle bien el contenido y almacene durante la noche a cuatro grados. La insulina no se disuelve por completo en los medios completos de Schneider y notará un precipitado asentarse en la parte inferior del tubo. Haz aliquots, asegurándome de dejar esto precipitado, ya que interferirá con las imágenes.Esta solución se puede utilizar durante un mes si se almacena en alícuotas a cuatro grados. Para obtener imágenes óptimas de células germinales femeninas, primero prepare un vial que contenga un toque de pasta de levadura húmeda que sea la consistencia de la mantequilla de maní. Esto garantiza que las hembras estén bien alimentadas y produzcan todas las etapas de desarrollo folículo para la toma de imágenes.Para moscas óptimamente sanas, recoger cero a un día hembras viejas y transferir con los machos en un vial de alimento mosca que contiene pasta de levadura húmeda. Asegúrese de que las moscas durmientes no se pongan en contacto con la pasta de levadura, ya que pueden pegarse a ella. Alimenta a las moscas de tres a siete días, cambiando la pasta de levadura diariamente.Asegúrese de que la pasta de levadura entre en contacto con el alimento para moscas, para que no se seque. Para inducir daños oxidativos, utilizaremos una solución de stock de peróxido de hidrógeno al 30% y para visualizar mitocondrias, utilizaremos una solución de stock de 100 mililitros TMRE. Es importante preparar las soluciones multimedia frescas porque el peróxido de hidrógeno es susceptible a la oxidación y TMRE se degrada con el tiempo.Justo antes de la disección, en los medios de comunicación completos de Schneider, preparar una nueva alícuota de dos peróxidos de hidrógeno micromolares, un aliquot fresco de 46 TMRE nanomolar, y un aliquot fresco de 46 TMRE nanomolar más dos peróxidos de hidrógeno micromolares. Para la disección del ovario necesitarás dos pares de fórceps finos y un par de agujas de tungsteno electrolíticamente afiladas. Para diseccionar los ovarios llene un vaso de reloj con los medios completos de Schneider que ha sido calentado a temperatura ambiente, luego coloque una sola mosca en los medios de comunicación usando fórceps.Sujete suavemente la mosca por el tórax usando un par de fórceps finos. Con los otros fórceps, sujete el trasero y tire suavemente para extirpar los ovarios. Retire cualquier cutícula o tejido extraño y, a continuación, transfiera el ovario a un nuevo pozo que contenga medios frescos.Los ovarios todavía deben moverse de la vatina muscular circundante. Con las agujas de tungsteno afilados, se burla suavemente de los ovarioles, teniendo cuidado de eliminar la colícula muscular circundante. Si no se extirpa la vatina muscular, como se muestra aquí, la ovaria temblará, causando problemas con la adquisición de imágenes.Una vez diseccionados limpiamente los ovarioles, transfiéralos en una caída de 100 microlitros de medios a un plato MatTek si visualiza estructuras endógenamente etiquetadas. Transfiera los ovarioles en una caída de 100 microlitros de medios TMRE a un plato MatTek si visualiza mitocondrias etiquetadas con TMRE. Los ovarioles se hundirán en la parte inferior de la gota.Es importante practicar disecciones con el fin de comenzar a tomar imágenes del tejido lo más rápido posible. Una vez montados los ovarioles, coloque el plato en el microscopio invertido y adquiera imágenes fijas o videos breves como un registro de las condiciones de pretratamiento. Una vez hecho esto, pausa las imágenes en vivo, retira la tapa y añade cuidadosamente 100 microlitros de la solución preparada para peróxido de hidrógeno micromolar.Evite romper la superficie de la gota de soporte existente o agregar la solución demasiado rápido, para no desplazar los ovarioles que descansan en la parte inferior. Reemplace la cubierta del plato, reubique y reenfoque el ovariole deseado, y reanude las imágenes. Cuídate de reanudar las imágenes lo más rápido posible, ya que el tratamiento experimental es sensible al tiempo.Aquí se muestran imágenes fijas de una película, tomadas después del tratamiento con peróxido de hidrógeno. Las mitocondrias y las células germinales femeninas se dispersan a lo largo del citoplasma cuando las moscas están bien alimentadas y sanas. Después de la adición de peróxido de hidrógeno, el daño oxidativo hace que las mitocondrias se agrupen, lo que se puede ver tan rápido como 10 minutos después del tratamiento.Después de 20 minutos, el daño hace que el potencial de membrana mitocondrial se disipe. Por lo tanto, la mayoría de las mitocondrias se desvanecen. En esta película en vivo del proceso, las mitocondrias se pueden ver rápidamente aglutinando y la mayoría de las mitocondrias finalmente se desvanecen.El parpadeo pulsante en el citoplasma, particularmente en las células folículos circundantes, parece característico de la adición de TMRE. Como se mencionó anteriormente, las imágenes deben tener lugar rápidamente después de la adición de peróxido de hidrógeno. Como se muestra aquí, si transcurre demasiado tiempo, el potencial de membrana mitocondrial ya se pierde y el etiquetado TMRE se disipa, haciendo que los datos sean ininterpretables.En estas imágenes fijas de vídeo, las partículas Clu etiquetadas endógenamente GFP son robustas y abundantes en el germoplasma de hembras bien alimentadas. Después de la adición de peróxido de hidrógeno, las partículas Clu se dispersan en 10 minutos. Esto se demuestra en el video que lo acompaña.Después de la adición de peróxido de hidrógeno, las partículas de felicidad Clu se dispersan rápidamente. Hemos encontrado que este protocolo es una herramienta útil para asegurar imágenes precisas de la localización de mitocondrias de tipo salvaje y partículas de Clu bliss en células germinales femeninas de Drosophila. Este protocolo debe ser aplicable para una amplia gama de estudios de imágenes en vivo y podría utilizarse para tratar tejidos antes de la fijación también.Los pasos más importantes son aislar los ovarioles libres de la vaina muscular, para añadir suavemente el peróxido de hidrógeno, para no desalojar los ovarioles, e imagen rápidamente después de la adición de peróxido de hidrógeno. Esperamos que encuentre este un control útil para la toma de imágenes en vivo de una variedad de estructuras subcelulares. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.

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