Imágenes de calcio in vivo de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas de ratón a los estímulos del gusto

Esta técnica puede responder a preguntas funcionales importantes sobre las respuestas neuronales al gusto en los ganglios geniculados, una parte crucial de la vía del gusto tímpano de la cuerda interior. Esta técnica se puede utilizar para monitorear las reacciones en tiempo real de múltiples neuronas individuales en un solo ensayo experimental, ya que las células registradas por animal son significativamente más altas de lo que normalmente se observa a través del método electrofisiológico. Con el ratón montado en la cabecera en posición supina sobre una almohadilla térmica, haga una incisión de dos centímetros en la línea media en la piel sobre la garganta, desde el esternón hasta la barbilla.

Y retraiga la piel y las glándulas submaxilares para exponer completamente los músculos digástricos. Después de localizar la costura en la musculatura paratraqueal, separe la costura con disección roma y retraiga el tejido para abrirla. Corte cuidadosamente una abertura en la parte superior de la tráquea lo suficientemente grande como para caber en un trozo de tubo de polietileno sin cortar más de la mitad del diámetro de la tráquea e inserte el tubo en la tráquea hacia los pulmones.

Reposicione los retractores para liberar la musculatura paratraqueal y retraer las glándulas submaxilares. Luego, use una pequeña cantidad de pegamento veterinario para sellar la musculatura paratraqueal sobre el tubo. Para romper la bulla timpánica, burle suavemente el músculo digástrico deseado hacia arriba y separe el tejido conectivo.

Haga una incisión en el extremo anterior del músculo, evitando los vasos sanguíneos. Y tirar hacia atrás hacia atrás hasta que se despeje de la bulla timpánica. Incline la cabeza ligeramente hacia atrás para levantar la bulla timpánica y localizar la rama de la arteria carótida anterior al punto de inserción posterior del músculo digástrico.

Palpar justo después de este vaso sanguíneo para la estructura convexa de la bulla timpánica y localizar una costura en la musculatura. Usando dos juegos de fórceps finos, diseccionar romamente en la costura hasta que el hueso de la bulla timpánica sea visible y usar retractores para mantener una visión clara del hueso. Localice la costura que corre de anterior a posterior en la bulla y use una sonda quirúrgica para perforar un agujero en el hueso en el centro de la costura, Luego, use un conjunto de tijeras de extremo fino para cortar un área circular en el hueso, teniendo cuidado de no cortar los vasos sanguíneos anteriores y posteriores a o debajo de la bulla.

Para exponer el geniculado, localice la cóclea. Anterior a la cóclea es el músculo tensor tímpano. Use tijeras de resorte para cortar y eliminar este músculo.

Use la sonda quirúrgica para hacer un agujero en el promontorio coclear e inmediatamente use la succión para aspirar cualquier líquido que fluya fuera del orificio. Agrandar el orificio en la cóclea, teniendo cuidado de no dañar el vaso sanguíneo que rodea la cóclea, hasta el borde posterior y lateral. E incline la cabeza del ratón hacia adelante para localizar el agujero en el hueso temporal debajo de la estructura coclear anterior.

Tome nota de la cresta anterior al orificio que se encuentra directamente sobre el séptimo nervio. E inserte una sonda quirúrgica en el orificio para permitir que el hueso temporal se levante cuidadosamente para exponer el séptimo nervio. Si el geniculado no es completamente visible, incline suavemente la cabeza del animal hacia atrás e intente levantar el hueso anterior al nervio.

Si los ganglios aún están oscurecidos, extraiga más hueso de debajo, teniendo cuidado de no colocar la sonda profundamente debajo del hueso, ya que esto puede dañar el geniculado. Para ejecutar el panel de sabor, use succión para eliminar el líquido de encima del geniculado y coloque el mouse en una almohadilla absorbente bajo un microscopio de disección. Use el orificio dejado en la bulla, el orificio en el hueso temporal y el séptimo nervio para localizar el ganglio geniculado.

Y use el filtro FITCGFP en el endoscopio epifluorescente para verificar si hay neuronas ganglionares geniculadas que expresan GCaMP individuales. Coloque la aguja dispensadora para una línea de sabor firmemente en la boca del animal y coloque una placa de Petri debajo de la boca para atrapar cualquier líquido. Sincronice el inicio de la grabación de video con el inicio de la presentación sabrosa, viendo la transmisión en vivo para obtener respuestas, deriva y filtraciones durante la grabación.

Si se produce una filtración, succiones el líquido hasta que la vista del geniculado sea clara y volver a entregar el saborante. Si se produce una deriva, compruebe que todas las partes de la cabecera estén firmemente apretadas. Si no se produce respuesta, compruebe que el líquido está fluyendo y que el microscopio y la cámara están enfocados en la ubicación adecuada sin que nada oscurezca el campo de visión.

Cuando se completen todos los experimentos deseados, alivie suavemente los retractores y repita la exposición y el análisis de sabor en el lado opuesto del animal. Como se observa, los estímulos gustales aplicados a la lengua deberían resultar en un rápido aumento transitorio de la fluorescencia GCaMP, causando un cambio notable en el brillo entre las neuronas que responden. El análisis de las imágenes de video de fluorescencia permite la generación de trazas correspondientes a los cambios en la fluorescencia sobre la respuesta de referencia dentro de las regiones individuales de interés a lo largo del tiempo.

Los cambios en la intensidad de la fluorescencia por encima del nivel umbral se consideran una respuesta positiva. Además de dañar los ganglios, es importante evitar el sangrado. Si se produce sangrado, espere a que la sangre coagule antes de aplicar solución salina y succión para extraer la sangre del campo visual.

La visualización de los ganglios geniculados ha permitido a los investigadores medir directamente las respuestas de las neuronas a estímulos similares al sabor e identificar estas neuronas con herramientas como GCaMP dependiente de Cre.