Name: Condensados de proteínas inducidas por dimerización química en telómeros (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprende a inducir condensados proteicos en telómeros mediante dimerización química con control temporal preciso. Este método permite estudiar la formación y dinámica de condensados cromatínicos en células vivas.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (1K22CA23763201 a H.Z., GM118510 a D.M.C.) y la fundación Charles E. Kaufman a H.Z. Los autores desean agradecer a Jason Tones por revisar el manuscrito.

1. Producción de líneas celulares transitorias
<ol><li>Cultite células aceptoras U2OS en fundas de vidrio de 22 x 22 mm (para imágenes vivas) o cubiertas circulares de 12 mm de diámetro (para IF o FISH) recubiertas con poli-D-lisina en placa de 6 pozos con medio de crecimiento (10% de suero bovino fetal y solución de penicilina-estreptomicina al 1% en DMEM) hasta que alcancen una confluencia del 60-70%.</li>
	<li>Reemplace el medio de crecimiento con 1 ml de medio de transfección (medio de crecimiento sin solución de penicilina-estreptomicina) antes de la transfección.</li>
	<li>Para cada pozo de transfección, agregue 4 μL de reactivo de transfección a 150 μL de medios séricos reducidos, vórtice durante 10 segundos y luego incube durante 5 minutos.</li>
	<li>Para cada pomo, agregue el plásmido de construcción halo (Halo-GFP-TRF1 o Halo-TRF1) y el plásmido de construcción eDHFR (mCherry-eDHFR-SIM o mutante mCherry-eDHFR-SIM) a una relación de masa de 1:1 (plásmido de construcción Halo 0.5 μg con plásmido de construcción eDHFR 0.5 μg) a medios séricos reducidos 150 μL, en forma gota, mezclados por pipeteo. NOTA: Las etiquetas son relativamente pequeñas (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) y no se observó ningún efecto sobre la separación de fases. Sin embargo, se recomienda el uso de mutantes como el mutante SIM utilizado aquí para asegurarse de que el comportamiento de fase sea sensible a las mutaciones, no a las etiquetas. SIM es de PIASx28,30. La secuencia SIM es AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. El mutante SIM se genera mutando los aminoácidos SIM VIDL a VADA28,y la secuencia es AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGATCCACCGGCTAAACGT. Depositamos nuestros plásmidos a addgene: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mutante mCherry-eDHFR-SIM.</li>
	<li>Agregue 150 μL de mezcla de medios séricos reducidos con reactivo de transfección a medios séricos reducidos de 150 μL con ADN, en sentido de gota, mezcle mediante pipeteo, incube durante 5 minutos.</li>
	<li>Agregue los 300 μL de mezcla de reactivo de transfección y ADN a las células, gota a gota y luego coloque las células de nuevo en la incubadora.</li>
	<li>Espere de 24 a 48 horas antes de la obtención de imágenes en vivo, la inmunofluorescencia (IF) o la hibridación fluorescente in situ (FISH).</li>
</ol>2. Dimerización en telómeros
<ol><li>Disolver los dimerizadores en sulfuro de dimetilo a 10 mM y almacenar en tubos de microcentrífuga de plástico a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo. NOTA: En lugar de utilizar el dimerizador con TMP directamente vinculado a Halo (TMP-Halo, TH), se utiliza el dimerizador TMP-NVOC-Halo (TNH) que tiene un enlazador fotosensible, 6-nitroveratrilo oxicarbonilo (NVOC), entre TMP y Haloligand31. Esto se debe a que el TNH (~5 minutos) tarda menos tiempo en difundirse en la célula que el TH (~20 minutos). Los resultados que se muestran aquí también se pueden obtener utilizando TH. Cuando use TNH, tenga cuidado de no exponer el dimerizador a la luz para evitar la escisión de NOVC. Manipule TNH en una habitación oscura con una lámpara de luz roja tenue, guarde el dimerizador en tubos de plástico ámbar y envuelva el recipiente que contiene TNH o células tratadas con papel de aluminio. La obtención de imágenes de TNH con DIC es segura.</li>
	<li>Tomar una alícuota de dimerizador de 10 mM desde -80 °C y diluir en medio de imagen hasta una concentración de stock de 10 μM y almacenar a -20 °C.</li>
	<li>Cuando esté listo para usar, diluya los diluyeres de una solución de stock de 10 μM a una concentración de trabajo final de 100 nM en medio de crecimiento (para imágenes fijas) o medio de imagen. Tratar las células con dimerizadores de 100 nM (concentración final) en el escenario para imágenes en vivo o incubar durante 4-5 horas para inmunofluorescencia (IF) e hibridación fluorescente in situ (FISH). NOTA: La concentración de dimerizadores utilizados afecta la eficiencia de la dimerización y, por lo tanto, la separación de fases. La concentración del dimerizador que permite la máxima eficiencia de dimerización depende del tipo de célula y la concentración de proteína de anclaje, por lo que deberá determinarse para diferentes experimentos. Una forma sencilla es incubar células que expresan la proteína de anclaje y mCherry-eDHFR (sin fusionarse a la proteína separador de fase o fusionada a un mutante separador no fase) e identificar la concentración de dimerizador a la que se alcanza la mayor intensidad de mCherry en el anclaje. Un enfoque más sistemático es incubar células que expresan el anclaje solo con diferentes concentraciones de dimerizadores y luego con un tinte de unión a Halo para ayudar a determinar la concentración del dimerizador a la que la intensidad del tinte de unión a Halo comienza a estabilizarse (es decir, todos los anclajes fusionados con Halo están ocupados por el dimerizador y no quedan más para el tinte de unión Halo)32.</li>
	<li>Para revertir la dimerización, incube las células con dimerizadores durante 2-5 horas (con o sin imágenes vivas) o hasta que se logre el tamaño de gota deseado y agregue 100 μM de TMP libre (concentración final) diluido en medio de imágenes a las células.</li>
</ol>3. Inmunofluorescencia (IF) 
<ol><li>Semilla 105 celdas en vidrios de cubierta circular de 12 mm de diámetro recubiertos con poli-D-lisina en placa de 6 pozos. Luego transfecta los dos plásmidos (Halo-GFP-TRF1 con mCherry-eDHFR-SIM o mutante mCherry-eDHFR-SIM) y espere 24-48 horas antes de proceder a la inmunofluorescencia. NOTA: Esperar más de un día después de la transfección puede obtener una mayor expresión.</li>
	<li>Diluir los diluyers con medio de crecimiento para alcanzar una concentración final de 100 nM, añadir dimerizers diluidos a las células e incubar a 37 °C durante 4-5 horas. NOTA: La separación de fases se induce rápidamente después de agregar dimerizadores (< 30 minutos). Una incubación más larga ayuda a que las gotas se ensaquen en tamaños más grandes. Después del crecimiento de las gotas con imágenes en vivo se puede utilizar para determinar el tiempo que tardan las gotas en alcanzar el estado deseado.</li>
	<li>Fije las células en una solución de PBS que contenga 4% de formaldehído y 0,1% de Tritón X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente para permeabilizar las células. Lave las células 3 veces con PBS. NOTA: Después de este paso, se puede pausar y las celdas se pueden almacenar a 4 ° C durante un hasta una semana. Precaución: El formaldehído es dañino por inhalación y si se ingiere, también irrita los ojos, el sistema respiratorio y la piel y es un posible peligro de cáncer. Necesidad de usar equipo de protección personal, use solo en una campana de humos químicos. También colóqueles en un contenedor de residuos después de su uso, no lo deseche en el fregadero.</li>
	<li>Lave las fundas dos veces con 50 μL TBS-Tx y una vez con 50 μL Antibody Dilution Buffer (AbDil). TBS-Tx fue fabricado por TBS, 0.1% Triton X-100 y 0.05% Na-azide. AbDil fue fabricado por TBS-Tx, 2% BSA y 0.05% Na-azide.</li>
	<li>Incubar cada funda con 50 μL primario anti-PML (dilución 1:50 en AbDil) / anti-SUMO1 (dilución 1:200 en AbDil) / anticuerpo anti-SUMO2/3 (dilución 1:200 en AbDil) a 4 °C en una cámara humidificada durante la noche. El anticuerpo mCherry también se puede usar (dilución 1:200 en AbDil) para ayudar a detectar la señal mCherry para FISH. NOTA: FISH apaga la señal fluorescente mCherry, lo que dificulta la diferenciación de las células transfectadas con plásmidos mCherry de las no transfectadas en los experimentos FISH. Se recomienda el uso de anticuerpos mCherry. Alternativamente, se puede hacer una línea celular estable que exprese eDHFR que contenga proteínas.</li>
	<li>Lave las fundas 3 veces con AbDil para eliminar el anticuerpo primario no unido.</li>
	<li>Incubar células con anticuerpo secundario [anticuerpo secundario anti-ratón IgG (H+L) conjugado con Alexa Fluor 647 para PML y SUMO, anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) conjugado con Alexa Fluor 555 para mCherry, ambos con dilución 1:1000 en AbDil] durante 1 hora en caja oscura a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave los cubrecubres 3 veces con TBS-Tx.</li>
	<li>Portaobjetos de etiquetas, diluya DAPI en medios de montaje para alcanzar la concentración final de DAPI de 1 μg/mL. Luego coloque 2 μL DAPI diluido en la diapositiva. Voltee los cubrecufolios y colóquelos en la gota DAPI, aspire líquido adicional desde el borde del cubrecos.</li>
	<li>Sellar con esmalte de uñas, dejar secar y enjuagar desde la parte superior de la funda con agua. Guardar en el congelador para la obtención de imágenes.</li>
</ol>4. Hibridación fluorescente in situ (FISH)
<ol><li>Semilla 105 celdas en vidrios de cubierta circular de 12 mm de diámetro recubiertos con poli-D-lisina en placa de 6 pozos. Transfectar células con plásmidos mutantes Halo-TRF1 y mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDHFR-SIM y esperar 24-48 h antes de proceder a FISH. El paso de dimerización es el mismo que se describe en 3.2. NOTA: Aquí TRF1 no está fusionado con GFP, por lo que el canal verde se libera para la sonda de ADN de los telómeros.</li>
	<li>Fije las células con formaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente y lave 4 veces con PBS. Para IF-FISH, proceda al protocolo IF desde aquí y después de lavar el anticuerpo secundario en IF (3.8), vuelva a fijar las células con formaldehído al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente y lave tres veces con PBS.</li>
	<li>Deshidrate los cubrecundos en una serie de etanol (70%, 80%, 90%, 2 minutos cada uno).</li>
	<li>Incubar la cubiertas con sonda PNA de 488 telC (relación 1:2000) en solución de hibridación de 5 μL a 75 °C durante 5 minutos. La solución de hibridación contiene 70% de formamida desionizada, 10 mM Tris (pH 7.4), 0.5% de reactivo de bloqueo. Luego incubar durante la noche en una cámara humidificada a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave las fundas con tampón de lavado (70% formamida, 10 mM Tris) 2 minutos durante 3 veces a temperatura ambiente y monte con 1 μg/mL DAPI en medios de montaje para imágenes. NOTA: El protocolo FISH es un protocolo publicado33'34.</li>
</ol>5. Imágenes en vivo
<ol><li>Cuando las células estén listas para la obtención de imágenes, monte cubiertas en cámaras magnéticas con células mantenidas en un medio de imágenes de 1 ml sin rojo fenol en una etapa calentada en una cámara ambiental.</li>
	<li>Instalar microscopio y aparato de control ambiental. Las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal de disco giratorio con un objetivo de 100x 1.4 NA, un Piezo Z-Drive, una cámara de dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones (EMCCD) y un módulo de fusión láser equipado con láseres de 455, 488, 561, 594 y 647 nm controlados por software de imágenes. Las potencias de salida para todos los láseres son de 20 mW medidos en el extremo de la fibra.</li>
	<li>Localice las células con señal GFP brillante en los telómeros y señal mCherry difusivamente localizada en el nucleoplasma. Encuentre alrededor de 20 celdas, memorice cada posición con información x, y, z y configure parámetros para imágenes de lapso de tiempo con espaciado de 0,5 μm para un total de 8 μm en Z e intervalo de tiempo de 5 minutos durante 2-4 horas para los canales GFP y mCherry. Utilice el 30% de la intensidad de potencia de 594 nm y el 50% de 488 nm, con tiempos de exposición de 200 ms y ganancia de cámara de 300. NOTA: La potencia de salida de las unidades láser es de 20 mW. Los focos brillantes de GFP indican un tamaño de anclaje más grande que puede nuclear los condensados más fácilmente. Encuentre células con un amplio rango de señal mCherry porque la separación de fases depende de la concentración de SIM en la célula. Es posible que las células con una señal mCherry demasiado tenue o demasiado brillante no se separen en fase. Para evitar el fotobleaching, no use demasiada potencia láser ni un tiempo de exposición demasiado largo.</li>
	<li>Comience a tomar imágenes y tome un bucle de una sola vez como predmerización. Pausar las imágenes, agregar medios de imagen de 0,5 ml que contengan 15 μL de dimerizador de 10 μM a la cámara de imágenes en el escenario para que la concentración final del dimerizador sea de 100 nM. Reanudar la obtención de imágenes.</li>
	<li>Cuando esté listo para la dimerización inversa, detenga las imágenes, agregue medios de imagen de 0,5 ml que contengan 2 μL de TMP de stock de 100 mM a la cámara de imágenes en el escenario para obtener una concentración final de TMP de 100 μM. Continúe con las imágenes de las células durante 1-2 horas.</li>
</ol>6. Imágenes fijas
<ol><li>Mismo microscopio configurado como imágenes en vivo, no se necesita calentamiento de etapa. Utilice 488 nm para obtener imágenes de los telómeros FISH, 561 nm para mCherry IF y 647 nm para PML o SUMO IF. NOTA: Si no usa un anticuerpo mCherry, simplemente imagine directamente la proteína mCherry, pero la señal puede atenuarse debido al enfriamiento en FISH.  Siga utilizando el láser de 561 nm en lugar de 594 nm para obtener imágenes de mCherry para evitar el sangrado de la señal de Cy5 a mCherry.</li>
	<li>Localice alrededor de 30-50 células con señal roja (mCherry o mCherry IF) para seleccionar las células transfectadas.</li>
	<li>Las imágenes se tomaron con un espaciado de 0,3 μm para un total de 8 μm en Z para recoger más señales. Utilice el 80% de la intensidad de potencia de 647 nm, el 80% de 561 nm y el 70% de 488 nm, con tiempos de exposición de 600 ms y ganancia de cámara de 300.</li>
</ol>7. Procesar imágenes de lapso de tiempo
<ol><li>Definir binario para telómeros Elija una celda con toda la información de tiempo y z-stack, elija solo el canal GFP y cree una capa binaria definiendo el umbral. Ajuste los valores inferior y superior del umbral y utilice funciones como "Suavizar", "Limpiar" y "Rellenar agujeros" para ver qué tan bien el umbral recoge los objetos deseados a través de todos los puntos de tiempo.</li>
	<li>Restar fondo Elija todos los canales, dibuje el rectángulo Región de interés (ROI) en el fondo (aparte de la celda). Defina este ROI como fondo y luego reste la intensidad del fondo.</li>
	<li>Vincular binario de telómeros a intensidad de telómeros Elija binario de telómeros y conéctelo al canal GFP para calcular la intensidad de GFP en los objetos binarios como intensidad de telómeros.</li>
	<li>Calcular el número de telómeros y la intensidad a lo largo del tiempo Especifique la información que se va a exportar, como la hora, el ID del objeto, la intensidad media, la intensidad de la suma y los datos de exportación. Utilice el software de trazado de figuras para leer la tabla exportada y generar cifras de número de telómeros e intensidad de telómeros (resuma la intensidad sobre el volumen en cada telómero y luego promedie todos los telómeros en una celda) a lo largo del tiempo.</li>
</ol>8. Procesar imágenes de celda fija
<ol><li>Definir binario para ABs Elija células transfectadas para el análisis buscando señal en el canal de 561 nm. Siguiendo el procedimiento de 7.1, definir umbral tanto en el canal GFP (TELOMERE DNA FISH) como en el Cy5 (PML o SUMO IF) para generar binarios para telómeros y cuerpos PML o SUMO, respectivamente. Fusione las capas binarias GFP y Cy5 y cree una nueva capa que contenga partículas que tengan señal GFP y Cy5 para representar la colocalización del cuerpo de PML en los telómeros, por lo tanto, APU.</li>
	<li>Calcular el número y la intensidad de APB/SUMO Reste el fondo de la imagen después de 7.2. Vincule la capa binaria APB/SUMO al canal Cy5 después de 7.3. Calcule el número y la intensidad de APB/SUMO. Exportar y trazar datos siguiendo 7.4.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo demostró la formación y disolución de condensados en telómeros con un sistema de dimerización química. La cinética de la separación de fases y la agrupación de telómeros inducida por la fusión de gotas se monitorean con imágenes en vivo. La localización y composición del condensado se determinan con ADN FISH y proteína IF.
Hay dos pasos críticos en este protocolo. El primero es determinar la concentración de proteínas y dimerizantes. El éxito en la inducción de la separación de ...

Muchas proteínas y ácidos nucleicos se someten a separación de fase líquido-líquido (LLPS) y se autoensamblan en condensados biomoleculares para organizar la bioquímica en las células1,2. LLPS de proteínas de unión a cromatina conduce a la formación de condensados que están asociados con loci genómicos específicos y están implicados en varias funciones locales de cromatina3. Por ejemplo, LLPS de la proteína HP1 subyace a la formación de dominios de heterocromatina para organizar el genoma4,5,LLPS de factores de transcripción forma centros de transcripción para regular la transcripción6,LLPS de mRNAs nacientes y peines multi-sexo la proteína genera cuerpos de locus histonas para regular la transcripción y procesamiento de mRNAs de histonas7.  Sin embargo, a pesar de que se han descubierto muchos ejemplos de condensados asociados a la cromatina, los mecanismos subyacentes de formación, regulación y función del condensado siguen siendo poco conocidos. En particular, no todos los condensados asociados a la cromatina se forman a través de LLPS y aún se necesitan evaluaciones cuidadosas de la formación de condensado en células vivas8,9. Por ejemplo, se ha demostrado que la proteína HP1 en ratones tiene solo una capacidad débil para formar gotas líquidas en células vivas y los focos de heterocromatina se comportan como glóbulos de polímero colapsado10. Por lo tanto, las herramientas para inducir condensados de novo en la cromatina en las células vivas son deseables, particularmente aquellas que permiten el uso de imágenes en vivo y ensayos bioquímicos para monitorear la cinética de la formación de condensados, las propiedades físicas y químicas de los condensados resultantes y las consecuencias celulares de la formación de condensados.
Este protocolo reporta un sistema de dimerización química para inducir condensados de proteínas en la cromatina11 (Figura 1A). El dimerizador consiste en dos ligandos vinculados que interactúan con proteínas: trimetoprima (TMP) y ligando Halo y puede dimerizar proteínas fusionadas a los receptores cognados: Escherichia coli dihidrofolato reductasa (eDHFR) y una enzima alquilldehalogenasa bacteriana (enzima Halo), respectivamente12. La interacción entre el ligando Halo y la enzima Halo es covalente, lo que permite que la enzima Halo se use como ancla fusionándola con una proteína de unión a la cromatina para reclutar una proteína de separación de fase fusionada con eDHFR a cromatina. Después del reclutamiento inicial, el aumento de la concentración local de la proteína que separa la fase pasa la concentración crítica necesaria para la separación de fases y, por lo tanto, nuclea un condensado en el anclaje (Figura 1B). Al fusionar proteínas fluorescentes (por ejemplo, mCherry y eGFP) a eDHFR y Halo, la nucleación y el crecimiento de condensados se pueden visualizar en tiempo real con microscopía de fluorescencia. Debido a que la interacción entre eDHFR y TMP no es covalente, se puede agregar un exceso de TMP libre para competir con el dimerizador por la unión de eDHFR. Esto liberará la proteína de separación de fase del anclaje y disolverá el condensado asociado a la cromatina.
Utilizamos esta herramienta para inducir la formación de cuerpo nuclear de leucemia promielocítica (LMP) de novo en telómeros en células cancerosas negativas para telomerasa que utilizan una vía alternativa de alargamiento de telómeros (ALT) para el mantenimiento de los telómeros13,14.  Los cuerpos nucleares PML son compartimentos sin membrana involucrados en muchos procesos nucleares15,16 y se localizan de manera única en los telómeros ALT para formar AB, para los cuerpos PML asociados a los telómeros ALT17,18. Los telómeros se agrupan dentro de los AB, presumiblemente para proporcionar plantillas de reparación para la síntesis de ADN de telómeros dirigidos por homología en ALT19. De hecho, se ha detectado la síntesis de ADN de telómeros en AB y los AB juegan un papel esencial en el enriquecimiento de los factores de reparación del ADN en los telómeros20,21. Sin embargo, se desconocieron los mecanismos subyacentes al ensamblaje de APB y la agrupación de telómeros dentro de los AB. Dado que las proteínas de los telómeros en las células ALT se modifican de forma única mediante un pequeño modificador similar a la ubiquitina (SUMO)22,muchos componentes de APB contienen sitios de sumoilación 22,23, 24,25 y / o motivos que interactúan con SUMO (SIM)26,27 y las interacciones SUMO-SIM impulsan la separación de fases28, planteamos la hipótesis de que la sumoilación en los telómeros conduce al enriquecimiento de proteínas que contienen SUMO / SIM y Las interacciones SUMO-SIM entre esas proteínas conducen a la separación de fases.  La proteína PML, que tiene tres sitios de sumoilación y un sitio SIM, se puede reclutar a telómeros sumoilados para formar AB y la coalescencia de AB líquidos conduce a la agrupación de telómeros. Para probar esta hipótesis, utilizamos el sistema de dimerización química para imitar la formación de APB inducida por la sumoilación mediante el reclutamiento de SIM a telómeros (Figura 2A)11. GFP se fusiona con Haloenzyme para visualización y con la proteína de unión a telómeros TRF1 para anclar el dimerizador a los telómeros. SIM se fusiona con eDHFR y mCherry. La cinética de la formación de condensados y la agrupación de telómeros inducida por la fusión de gotas se siguen con imágenes de células vivas.  La separación de fases se invierte añadiendo un exceso de TMP libre para competir con la unión eDHFR. La inmunofluorescencia (IF) y la hibridación fluorescente in situ (FISH) se utilizan para determinar la composición del condensado y la asociación telomérica. Recruiting SIM enriquece suMO en telómeros y los condensados inducidos contienen PML y por lo tanto son APBs. El reclutamiento de un mutante SIM que no puede interactuar con SUMO no enriquece SUMO en telómeros ni induce la separación de fases, lo que indica que la fuerza impulsora fundamental para la condensación de APB es la interacción SUMO-SIM. De acuerdo con esta observación, los polímeros poliSUMO-polySIM que se fusionan a un factor de unión TRF2 RAP1 también pueden inducir la formación de APB29. En comparación con el sistema de fusión polySUMO-polySIM donde la separación de fases ocurre siempre que se produzcan suficientes proteínas, el enfoque de dimerización química presentado aquí induce la separación de fases bajo demanda y, por lo tanto, ofrece una mejor resolución temporal para monitorear la cinética de la separación de fases y el proceso de agrupamiento de telómeros. Además, este sistema de dimerización química permite el reclutamiento de otras proteínas para evaluar su capacidad para inducir la separación de fases y la agrupación de telómeros. Por ejemplo, una proteína desordenada reclutada a los telómeros también puede formar gotas y telómeros de racimo sin inducir la formación de APB, lo que sugiere que la agrupación de telómeros es independiente de la química de APB y solo se basa en la propiedad líquida de APB11.

<table><tbody><tr><td>0,25 % de tripsina, 0,1 % de EDTA en HBSS sin bicarbonato de calcio, magnesio y sodio</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>16 % de formaldehído (p/v), sin metanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td>Prepare el 1 % en 1x PBS</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 6 pocillos</td><td>VWR</td><td>10861-554</td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-101</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-mCherry</td><td>Abcam</td><td>Ab183628</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-PML</td><td>Santa Cruz</td><td>sc966</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-SUMO1</td><td>Abcam</td><td>Ab32058</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-SUMO2/3</td><td>Citoesqueleto</td><td>Asm23</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo bloqueante</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo BTX micro 1.5ML&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89511-258</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos circulares</td> Microscopio confocal <td>Thermo Scientific</td><td>3350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MQS31000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulphoxide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con L-Glutamina, 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodio</td><td>Corning</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>iXon Life&nbsp;</td><td>897</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Etanol Fisher Scientific</td><td>4355221</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino, Calificado, Regiones Aprobadas por el USDA</td><td>Gibco</td><td></td> A4766801 <td></td></tr><tr><td>Formamida, MilliporeSigma Desionizado</td><td></td><td>46-101-00ML</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Ratón IgG (H + L), Anticuerpo secundario recombinante, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A28181</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-conejo para cabras (H + L), anticuerpo secundario recombinante, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas/pinzas de punta ultrafina cónicas rectas de alta precisión</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de fusión láser&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NIIMHF47180</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reactivo de transfección</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Software de trazado de figuras, MATLAB</td><td>The MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slide Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>34487</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-071</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagen, NIS-Elements&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Medios de suero reducidos</td><td>Gibco 51985091</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X, pH 7.4</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-011-044</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina,100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>piezo Z-Drive&nbsp;</td><td>Physik Instrumente (PI)</td><td>91985</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>VWR</td><td>10017</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de esquina recortada lisos y esmerilados</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td></td></tr><tr><td>Solución de poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Disco giratorio</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos cuadrados</td><td>Thermo Scientific</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x solución</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2471500</td><td></td></tr><tr><td>TelC-Alexa488</td><td>PNA Bio</td><td>F1004</td><td></td></tr><tr><td>TMP</td><td>Sintetizado por el laboratorio</td><td></td> Chenoweth <td>Disponible bajo pedido</td></tr><tr><td>TNH</td><td>Sintetizado por el laboratorio Chenoweth Disponible</td><td></td><td>bajo pedido</td></tr><tr><td>Tris Solución</td><td>Fisher Scientific</td><td>92-901-00ML</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 10% Solución</td><td>MilliporeSigma</td><td>64-846-350ML</td><td>Prepare 0.5% en 1x línea celular PBS</td></tr><tr><td>U2Os</td><td>Del laboratorio E.V. Makayev (Universidad Tecnológica de Nanyang, Singapur)</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>NC9524612</td><td></td></tr></tbody></table>

condensados de proteínas inducidas por dimerización química en telómeros

Chemical Dimerization-Induced Protein Condensates on Telomeres

Los condensados asociados a la cromatina están implicados en muchos procesos nucleares, pero los mecanismos subyacentes siguen siendo difíciles de alcanzar. Este protocolo describe un sistema de dimerización de proteínas inducido químicamente para crear condensados en los telómeros. El dimerizador químico consiste en dos ligandos unidos que pueden unirse a una proteína: Halo ligando a Halo-enzima y trimetoprima (TMP) a E. coli dihidrofolato reductasa (eDHFR), respectivamente. La fusión de la enzima Halo a una proteína telómero ancla los dimerizantes a los telómeros a través de la unión covalente ligando-enzima de Halo. La unión de TMP a eDHFR recluta proteínas de separación de fase fusionadas con eDHFR a telómeros e induce la formación de condensado. Debido a que la interacción TMP-eDHFR no es covalente, la condensación se puede revertir mediante el uso de exceso de TMP libre para competir con el dimerizador para la unión de eDHFR. Se muestra un ejemplo de inducción de la formación de cuerpos nucleares de leucemia promielocítica (LMP) en los telómeros y determinación del crecimiento, disolución, localización y composición del condensado. Este método se puede adaptar fácilmente para inducir condensados en otras ubicaciones genómicas fusionando Halo a una proteína que se une directamente a la cromatina local o a dCas9 que está dirigida al locus genómico con un ARN guía. Al ofrecer la resolución temporal requerida para la obtención de imágenes en vivo de una sola célula mientras se mantiene la separación de fases en una población de células para ensayos bioquímicos, este método es adecuado para sondear tanto la formación como la función de los condensados asociados a la cromatina.

En la Figura 2se muestran imágenes representativas de localización telomérica de SUMO identificadas por ADN telómero FISH y PROTEÍNA SUMO IF. Las células con reclutamiento de SIM enriquecieron SUMO1 y SUMO 2/3 en telómeros en comparación con las células con reclutamiento de mutantes SIM. Esto indica que el enriquecimiento de SUMO inducido por la dimerización de SIM en telómeros depende de las interacciones SUMO-SIM.
Una película representativa de lapso de tiempo d...

Este protocolo ilustra un sistema de dimerización de proteínas inducido químicamente para crear condensados en la cromatina.  Se demuestra la formación del cuerpo nuclear de la leucemia promielocítica (LMP) en telómeros con dimerizadores químicos. El crecimiento, la disolución, la localización y la composición de las gotas se controlan con imágenes de células vivas, inmunofluorescencia (IF) e hibridación fluorescente in situ (FISH).

Condensados de proteínas inducidas por dimerización química en telómeros

Chromatin-associated condensates are implicated in many nuclear processes, but the underlying mechanisms remain elusive. This protocol describes a ...

Este protocolo describe el sistema de dimerización química para inducir condensados de proteínas en los telómeros. Se puede adaptar fácilmente para inducir condensados en otros loci genómicos, y es adecuado para sondear la formación y función de condensados asociados a la cromatina. Este método ofrece la resolución temporal requerida para la obtención de imágenes de células vivas y mantiene la separación de fases en la población de células para ensayos bioquímicos.Para comenzar, disuelva los dimerizadores en DMSO a 10 milimolares y guárdelos en tubos de microcentrífuga de plástico a menos 80 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo. Diluya una alícuota de dimerizador milimolar de 10 en un medio de imagen a una concentración de stock de 10 micromolares y guárdelo a menos 20 grados centígrados. Cuando esté listo para usar, diluya los diluyers a una concentración de trabajo final de 100 nanomolares en medio de crecimiento o medio de imagen.Sece de 10 a la quinta celda en vidrios de cubierta circular de 12 milímetros de diámetro recubiertos con Poly-D-Lysine en una placa de seis pozos. Luego transfecta las células con los plásmidos mutantes Halo-GFP-TRF1 y mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDFR-SIM y espere de 24 a 48 horas antes de proceder a la inmunofluorescencia. Agregue los diluidos de 100 diluydores nanomolares a las células e incube en 37 grados Celsius durante cuatro a cinco horas.Después de la incubación, fije las células en una solución de PBS que contenga 4% de formaldehído y 0.1% de Tritón X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente para permeabilizar las células. Luego lave las células tres veces con PBS. La cubierta de lavado se desliza dos veces con 50 microlitros de TBS-Tx y una vez con 50 microlitros de tampón de dilución de anticuerpos.Incubar cada resbalón de cubierta con 50 microlitros de anticuerpos primarios anti-PML, anti-SUMO-1 o anti-SUMO-2 y 3 a cuatro grados centígrados en una cámara humidificada durante la noche. La cubierta de lavado se desliza tres veces con tampón de dilución de anticuerpos para eliminar el anticuerpo primario no unido, luego incuba las células con anticuerpo secundario durante una hora en una caja oscura a temperatura ambiente. Después de manchar, lave los resbalones de la cubierta tres veces con TBS-Tx.Etiquete las diapositivas agregando dos microlitros de un microgramo por mililitro DAPI, luego voltee los deslizamientos de la cubierta y colóquelos en la gota de DAPI. Aspire el líquido adicional desde el borde del deslizamiento de la cubierta. Selle la diapositiva con esmalte de uñas, deje que se seque y enjuague la parte superior del resbalón de la cubierta con agua.Coloque los portaobjetos en el congelador hasta obtener la imagen. Sece de 10 a la quinta célula en vasos de cubierta circular de 12 milímetros recubiertos con Poli-D-lisina en una placa de seis pomos y transfectarlos con halo-TRF1 y plásmidos mutantes mCherry-eDHFR-SIM o mCherry-eDHFR-SIM. Fije las células con 4% de formaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente y lávelas cuatro veces con PBS.Para IF-FISH, mante las células con anticuerpos primarios y secundarios y vuelva a fijarlas con 4% de formaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego lávelas cuatro veces con PBS y deshidrate los resbalones de la cubierta en una serie de etanol. Incubar los resbalones de la cubierta con la sonda C-PNA de telómeros 488 en cinco microlitros de solución de hibridación a 75 grados centígrados durante cinco minutos, luego incubar los deslizamientos de la cubierta durante la noche en una cámara humidificada a temperatura ambiente. Lave los resbalones de la cubierta tres veces con tampón de lavado durante dos minutos por lavado a temperatura ambiente y móntelos con un microgramo por mililitro DAPI en medios de montaje para imágenes.Para imágenes en vivo, monte los resbalones de la cubierta en cámaras magnéticas en un escenario calentado en una cámara ambiental, manteniendo las células en un mililitro de medio de imagen sin rojo fenol. Configure el microscopio y el aparato de control ambiental como se describe en el manuscrito de texto. Localice las células con una señal GFP brillante en los telómeros y una señal mCherry difusivo en el citosol.Encuentre alrededor de 20 celdas, memorizando cada posición con la información XYZ y configure parámetros para imágenes de lapso de tiempo. Utilice un espaciado de 0,5 micrómetros para un total de ocho micrómetros en Z y un intervalo de tiempo de cinco minutos durante dos a cuatro horas para los canales GFP y mCherry. Utilice el 30% de la intensidad de potencia de 594 nanómetros y el 50% de 488 nanómetros, con tiempos de exposición de 200 milisegundos y una ganancia de cámara de 300.Comience a tomar imágenes y tome un bucle de tiempo como pre-dimerización. Luego detenga las imágenes, agregue 0.5 mililitros de medios de imágenes que contengan 15 microlitros de dimerizador micromolar a la cámara de imágenes, teniendo cuidado de no tocar el escenario y reanude las imágenes. Cuando esté listo para revertir la dimerización, detenga las imágenes y agregue 0,5 mililitros de medios de imagen que contengan dos microlitros de TMP de 100 milimolares a la cámara de imágenes.Continúe tomando imágenes de las células durante una o dos horas. Para imágenes fijas, use la misma configuración de microscopio que las imágenes en vivo, pero sin el calentamiento de la etapa. Localice alrededor de 30 a 50 células con la señal roja para seleccionar las células transfectadas.Adquiera imágenes con un espaciado de 0,3 micrómetros para un total de ocho micrómetros en Z.Utilice el 80% de 647 nanómetros, el 80% de 561 nanómetros y el 70% de la intensidad de potencia de 488 nanómetros, con tiempos de exposición de 600 milisegundos y una ganancia de cámara de 300. La localización telomérica de SUMO se identificó utilizando adn telómero FISH e inmunofluorescencia de proteínas SUMO. Las células con reclutamiento DE SIM enriquecieron SUMO-1 y SUMO-2 y 3 en comparación con las células con reclutamiento de mutantes SIM, lo que indica que el enriquecimiento de SUMO inducido por dimerización de SIM en telómeros depende de las interacciones SUMO-SIM.Aquí se muestra una película de lapso de tiempo de TRF-1 y SIM después de la dimerización. SIM se reclutó con éxito para telómeros, y los focos SIM y TRF-1 se hicieron más grandes y brillantes, como se predijo para la formación y el crecimiento de gotas líquidas. Además, se observó la fusión de focos de TRF-1, lo que condujo a la agrupación de telómeros, como se muestra en la reducción del número de telómeros y el aumento de la intensidad de los telómeros con el tiempo.Por el contrario, el mutante SIM fue reclutado para telómeros después de la dimerización, pero no indujo ninguna formación de gotas o agrupamiento de telómeros, lo que indica que la separación de fases y la agrupación de telómeros es impulsada por las interacciones SUMO-SIM. Se observó la inversión de la separación de fases y la agrupación de telómeros después de agregar un exceso de TMP libre. El número de telómeros aumentó y la intensidad de los telómeros disminuyó con el tiempo.Aquí se muestran imágenes representativas de AB identificados por el ADN telómero FISH y la proteína PML IF. Las células con SIM reclutadas tienen más AB que las células con mutante SIM reclutado, lo que sugiere que los condensados inducidos por la dimerización son de hecho AB. Al realizar este protocolo, no exponga los dimerizadores sensibles a la luz a la luz.Trabaje en una habitación oscura con una lámpara que emite luz roja y envuelva las celdas con papel de aluminio durante la incubación. Siguiendo este procedimiento, el etiquetado de proximidad se puede utilizar para generar una lista completa de componentes en el condensado inducido. Las imágenes en vivo se pueden utilizar para seguir la dinámica de los componentes en el condensado.Estos métodos pueden ayudar a determinar las funciones de gobernar el control de la composición del condensado.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe un método para visualizar un ADN de doble hebra proteína rotura de señalización activada en respuesta al daño del ADN, así como su localización durante la mitosis.

De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN

Este video describe un método para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en moléculas de ADN en loci específicos utilizando imágenes de una sola molécula. Estos condensados se forman debido a las interacciones LCD-LCD y LCD-DBD, que permiten el reclutamiento de ARN polimerasa II y una mejor transcripción de genes.

Imágenes de una sola molécula para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en cortinas de ADN

La creación de sistemas de dimerización de proteínas inducidos químicamente con la afinidad y especificidad deseadas para cualquier ligando de moléculas pequeñas dado tendría muchas aplicaciones de detección y accionamiento biológico. Aquí, describimos un método eficiente y generalizable para la ingeniería de novo de sistemas de dimerización inducidos químicamente a través de la selección escalonada de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio visualizada por fago.

Creación de sistemas de dimerización de proteínas altamente específicos inducidos químicamente por la selección de fagos escalonados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos de un solo dominio

Aquí, describimos el uso del método de imagen de molécula única, cortinas de ADN, para estudiar el mecanismo biofísico de los condensados EWS-FLI1 que se ensamblan en el ADN.

Imágenes de una sola molécula de condensados EWS-FLI1 ensamblados en ADN

El presente protocolo destaca un método modificado para detectar y cuantificar los enlaces cruzados ADN-proteína (DPCs) y sus modificaciones postraduccionales (PTMs), incluyendo la ubiquitilación, la SUMOilación y la ADP-ribosilación inducida por inhibidores de la topoisomerasa y por formaldehído, permitiendo así el estudio de la formación y reparación de DPCs y sus PTMs.

Detección cuantitativa de enlaces cruzados ADN-proteína y sus modificaciones postraduccionales

Se ha demostrado que muchas proteínas intrínsecamente desordenadas participan en la formación de condensados biomoleculares altamente dinámicos, un comportamiento importante para numerosos procesos celulares. Aquí, presentamos un método basado en imágenes de una sola molécula para cuantificar la dinámica por la cual las proteínas interactúan entre sí en condensados biomoleculares en células vivas.

Medición de una sola molécula de la dinámica de interacción de proteínas dentro de condensados biomoleculares

Presentamos un protocolo para la preparación de condensados biomoleculares sintéticos consistentes en nanoestrellas de ADN anfifílico a partir de sus oligonucleótidos de ADN constituyentes. Los condensados se producen a partir de un solo componente de nanoestrella o de dos componentes y se modifican para mantener la transcripción in vitro de ARN a partir de una plantilla de ADN incrustada.

Condensados sintéticos y arquitecturas similares a células a partir de nanoestructuras de ADN anfifílico

Este protocolo demuestra el uso de pinzas magnéticas de una sola molécula para estudiar las interacciones entre las proteínas teloméricas de unión al ADN (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] y TRF2) y los telómeros largos extraídos de células humanas. Describe los pasos preparatorios para los telómeros y los factores de unión de repetición telomérica, la ejecución de experimentos de una sola molécula y los métodos de recopilación y análisis de datos.

Análisis de las interacciones teloméricas proteína-ADN utilizando pinzas magnéticas de una sola molécula

Un protocolo corto para la tinción de proteínas con Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 en geles de poliacrilamida se describe sin el uso de disolventes orgánicos o en ácido acético como en los procedimientos clásicas de tinción con CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

El video que acompaña describe el uso del sistema de fraccionamiento GELFREE 8100, las particiones que las muestras de proteínas complejas sobre la base del peso molecular y se recupera la fracción en fase líquida. El video describe cómo funciona la tecnología, cómo se utiliza, y proporciona los datos resultantes, con el análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida de homogeneizado fraccionada hígado de bovino.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

Aprende a inducir condensados proteicos en telómeros mediante dimerización química con control temporal preciso. Este método permite estudiar la formación y dinámica de condensados cromatínicos en células vivas.

Condensados de proteínas inducidas por dimerización química en telómeros

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