Visualización Y Cuantificación De La Endonucleasa Basada En El Daño Específico Del ADN Específico Del Sitio

Este video de la metodología presenta los pasos cruciales de los protocolos de inmunoprecipitación de inmunotinción y cromatina utilizados regularmente para estudiar el proceso celular relacionado con el daño del ADN y para visualizar y cuantificar el reclutamiento de proteínas implicadas en la reparación del ADN. Esta técnica proporciona herramientas poderosas para que los investigadores identifiquen nuevas proteínas unidas al locus genómico dañado, así como sus modificaciones post-traduccionales necesarias para la regulación afinada durante la reparación del ADN. Dado que estas técnicas se pueden aplicar para estudiar diferentes procesos celulares, tienen relevancia potencial si se utiliza una microirradiación láser o los sistemas de inducción perjudiciales del ADN basados en núcleos.

Recientemente, se han desarrollado varias herramientas poderosas para inducir daños en el ADN específicos del sitio que se pueden utilizar para ampliar nuestra comprensión de la reparación del ADN. Aplicando acercamientos bioquímicos y genéticos, estos utensilios son esenciales en revelar los acontecimientos celulares asociados al reclutamiento y al montaje de los complejos de la reparación de la DNA en el sitio del daño de la DNA. Además, estas técnicas permiten el estudio de estos procesos a resolución unicelular utilizando tanto células fijas como vivas.

Mantenga las células de U2OS en monocapas en el medio de cultivo de DMEM complementado con el suero fetal del becerro del 10%, la glutamina millimolar 2, y la solución antibiótico-antimicótica del 1%. Cultivar células en un ambiente humidificado de 5% de dióxido de carbono a 37 grados hasta lograr un 80% de confluencia, renovando el medio cada dos o tres días. Aspirar el medio y lavar las células con PBS.

Desconecte las células con la solución de tripsina-EDTA. Cuando las células se desprenden, detenga la actividad de la tripsina agregando medios de cultivo a las células, produciendo una suspensión celular. Cuente las celdas utilizando una cámara de recuento de celdas.

Placa 20, 000 células por mililitro por pozo en la placa de 24 pozos con cubierta redonda estéril de 12 milímetros se desliza en cada pozo. Incubar las células durante 24 horas a 37 grados en un ambiente humidificado de dióxido de carbono al 5% para permitir la fijación a los resbalones de la cubierta. Trate las células con 10 nanogramos por mililitro neocarzinostatina o utilice el método apropiado para inducir roturas de doble cadena a través de sistemas basados en endonucleusas.

Incubar las células durante una a ocho horas a 37 grados en un ambiente humidificado al 5% de dióxido de carbono para seguir la cinética de la reparación del ADN. Fije las células con la solución de PBS del formaldehído del 4% por 20 minutos en 25 grados. Retire la solución de fijación y lave las celdas tres veces con PBS durante cinco minutos cada una.

Retire el PBS y agregue 0.2% Triton X disuelto en PBS. Incubar las muestras durante 20 minutos. Lave las células tres veces con PBS.

Bloquee la unión inespecí específica con BSA al 5% diluido en BSA-PBST e incube las muestras durante al menos 20 minutos. Añadir la cantidad adecuada de anticuerpo primario diluido en solución BSA-PBST al 1%. Coloque cada resbalón de la cubierta boca abajo sobre una parapelícula o una gota de 10 microlitros del anticuerpo diluido.

Incubar las muestras en una cámara de humedad durante una hora y media a cuatro grados. Coloque los resbalones de la cubierta hacia atrás estando de lado hacia arriba en la placa de 24 pozos y el lavado tres veces con PBS. Añadir la cantidad adecuada de anticuerpo secundario diluido en 1%BSA-PBST.

Coloque cada resbalón de la cubierta boca abajo sobre el parafilm sobre una gota de 10 microlitros del anticuerpo diluido. Incubar las muestras en una cámara de humedad a cuatro grados durante una hora. Coloque los resbalones de la cubierta que se están configurando en la placa de 24 pozos y lave tres veces con PBS.

Antes de retirar la última solución de lavado de PBS, saque suavemente los resbalones de la cubierta con la mitad de la pinza y la aguja, y luego colóquelos boca abajo en los portaobjetos de vidrio con gotitas de medio de montaje. La inmunoprecipitación de la cromatina es una técnica ampliamente utilizada para identificar patrones de unión de proteínas al ADN. Para revelar la ocupación de una proteína de reparación del deseo alrededor del DSB, se utiliza un anticuerpo específico para inmunoprecipitar la proteína de interés de la preparación de la cromatina junto con la región del ADN a la que está unida.

Además, ChIP se ha aplicado comúnmente para mapear la presencia de modificación post-traduccional específica en uso por DSBs en un lugar geométrico genómico dado. Aproximadamente 20 millones de células por mililitro deben cultivarse en un plato de 15 centímetros para cada muestra. Retire el medio de cultivo y lave las células dos veces con PBS helado.

Fije las células con la solución 1%formaldehído-PBS. Coloque la placa en una coctelera orbital y agite suavemente durante 20 minutos. Detenga la fijación con glicina para alcanzar una concentración final de 125 milimolares e incube en un agitador orbitador con agitación suave durante cinco minutos a 25 grados.

Coloque la placa sobre hielo y lave dos veces con PBS helado. Raspe las células en PBS helado y transfilíquelas a 15 tubos cónicos mililitros. Centrifugar las células a 5.000 rpm durante cinco minutos a cuatro grados.

Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspend el pellet en dos mililitros de lisis celular tampón e incubar en hielo durante 10 minutos. Centrífuga a 5.000 rpm durante cinco minutos a cuatro grados. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y resuspend el pellet en 500 a 1, 500 microlitro tampón de lisis nuclear e incube en hielo durante 30 a 60 minutos.

Transferir el lisato en un tubo cónico de poliestireno adecuado para la sonicación. Sonicar el lisato para cizallar el ADN a un tamaño de fragmento promedio de 300 a 1000 pares de bases. Prepare Dynabeads para los pasos de prelimpieza e inmunoprecipitación.

Lave las cuentas dos veces durante 10 minutos a cuatro grados con tampón RIPA. Resuspend Dynabeads en el mismo volumen de búfer RIPA que sacó de la solución de stock original en los pasos 3.1. Pre-borrar 25 a 30 microgramos de cromatina de cada muestra con cuatro microlitro Dynabeads vía rotación durante una a dos horas a cuatro grados.

Precipitar los Dynabeads con un imán y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf. Agregue la cantidad adecuada de anticuerpos a cada muestra de cromatina y gire durante la noche a cuatro grados. Al día siguiente, agregue 40 microlitros de Dynabeads lavados a cada muestra e incubarlos durante la noche girando a cuatro grados.

Lavar una vez con 300 microlitros tampón bajo en sal durante 10 minutos con rotación a cuatro grados. Lavar una vez con 300 microlitros de tampón de sal alta durante 10 minutos con rotación a cuatro grados. Lavar una vez con tampón de cloruro de litio de 300 microlitros durante 10 minutos con rotación a cuatro grados.

Lavar dos veces con 300 microlitros TE durante 10 minutos con rotación para el primer lavado a cuatro grados y el segundo lavado a 25 grados. Agregue 200 tampón de elución de microlitro a las perlas e incubarlas a 65 grados en un termo-agitador durante 15 minutos con agitación continua. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y elute perlas de nuevo en un tampón de elución de 200 microlitros.

Agregue 500 microgramos por mililitro proteinasa-K y medio por ciento de SDS e incube las muestras a 50 grados durante dos horas. Realizar la extracción de cloroformo y transferir la fase acuosa superior a un nuevo tubo eppendorf. Añadir dos volúmenes y medio de etanol absoluto y 0,1 volúmenes tres molares de acetato de sodio pH 5,2.

Incubar durante al menos 20 minutos a menos 80 grados. Retire el etanol y seque al aire el pellet. Resuspend el pellet en 50 microlitro TE. Para estudiar su distribución especial en el ADN, se debe aplicar inmunoprecipitación de cromatina.

En esta figura se presenta un resultado experimental típico obtenido por ChIP-qPCR, que demuestra el enriquecimiento temporal de la histona gamma AX como respuesta al daño inducido por I-PpoI en el ADN. En la parte izquierda de la imagen, la señal de AX de histona gamma detectada oportunamente se muestra en el lado de ruptura, mientras que en la parte derecha, la distribución de AX de histona gamma se presenta en la región del gen de control en la que no se han inducido roturas demostradas. Aunque la reparación de la DNA sea un campo de investigación relativamente reciente, nuestro conocimiento está aumentando rápidamente con la ayuda de métodos bioquímicos y microscópicos.

No obstante, las técnicas bioquímicas, tales como una mancha blanca /negra occidental, la inmunoprecipitación, y la espectrometría de masa requieren una gran cantidad de células. Los procesos de reparación del estudio representan una instantánea de la población celular deseada. El campo microscópico ha sido revolucionado por técnicas de alta resolución, como el microscopio de súper resolución, que permite la visualización de procesos celulares inducidos por el daño del ADN a nivel nucleosomal, así como asegurar el mapeo preciso de la co-localización de proteínas.

Por otro lado, la inmunoprecipitación de la cromatina es una herramienta poderosa, especialmente combinándola con métodos de secuenciación para visualizar su patrón de unión a todo el genoma de las proteínas relacionadas con la reparación del ADN deseadas y las roturas de doble cadena en las regiones de cromatina o heterocromatina.