Name: Mediciones basadas en fluorescencia del intercambio de fosfatidilserina/fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprende a medir el intercambio de fosfatidilserina y fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas artificiales mediante fluorescencia. Este protocolo utiliza sensores lipídicos marcados con NBD y la proteína Osh6p para cuantificar la transferencia de lípidos en tiempo real.

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Estamos agradecidos a la Dra. A. Cuttriss por su cuidadosa revisión del manuscrito. Este trabajo está financiado por la beca ExCHANGE de la Agencia Nacional de Investigación de Francia (ANR-16-CE13-0006) y por el CNRS.

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Los resultados de estos ensayos dependen directamente de las señales de los sensores de lípidos fluorescentes. Por lo tanto, la purificación de estas sondas etiquetadas en una proporción de 1: 1 con NBD y sin contaminación libre de fluoróforos NBD es un paso crítico en este protocolo. También es obligatorio verificar si el LTP bajo examen está correctamente plegado y no agregado. La cantidad de LTP probada en los ensayos de extracción debe ser igual o superior a la de las moléculas accesibles de PS o PI(4)P para medir ad...

La distribución precisa de lípidos entre diferentes membranas y dentro de las membranas de las células eucariotas1,2 tiene profundas implicaciones biológicas. Descifrar cómo funcionan los LTP es un tema importante en biología celular3,4,5,6,y los enfoques in vitro son de gran valor para abordar este problema7,8,9,10,11. Aquí, se presenta una estrategia in vitrobasada en la fluorescencia que ha sido fundamental para establecer que varias proteínas ORP/Osh afectan el intercambio PS/PI(4)P entre las membranas celulares12 y con ello constituyen una nueva clase de LTPs. PS es un glicerofosfolípido aniónico que representa el 2-10% de los lípidos totales de membrana en células eucariotas13,14,16. Se distribuye a lo largo de un gradiente entre el ER y el PM, donde representa el 5-7% y hasta el 30% de los glicerofosfolípidos, respectivamente17,18,19. Además, el PS se concentra esencialmente en la valva citosólica del PM. Esta acumulación y la partición desigual de PS en el PM son críticas para los procesos de señalización celular19. Debido a la carga negativa de las moléculas de PS, la valva citosólica del PM es mucho más ancianómica que la valva citosólica de otros orgánulos1,2,19,20. Esto permite el reclutamiento, a través de fuerzas electrostáticas, de proteínas de señalización como el sustrato de C-quinasa rico en alanina miristoilada (MARCKS)21,sarcoma (Src)22,el oncogén viral del sarcoma de Kirsten-rat (K-Ras)23y el sustrato de toxina botulínica C3 relacionada con Ras 1 (Rac1)24 que contienen un tramo de aminoácidos cargados positivamente y una cola lipídica.
PS también es reconocido por la proteína quinasa C convencional de manera estereoselectiva a través de un dominio C225. Sin embargo, PS se sintetiza en el ER26,lo que indica que debe exportarse al PM antes de que pueda desempeñar su papel. No se supo cómo se logró esto19 hasta el hallazgo de que, en la levadura, Osh6p y Osh7p transfieren PS desde el ER al PM27. Estos LTP pertenecen a una familia evolutivamente conservada en eucariotas cuyo miembro fundador es OSBP y que contiene proteínas (ORPs en humanos, proteínas Osh en levaduras) integrando un dominio relacionado con OSBP (ORD) con una bolsa para albergar una molécula lipídica. Osh6p y Osh7p consisten solo en un ORD cuyas características estructurales están adaptadas para unirse específicamente a PS y transferirlo entre membranas. Sin embargo, no estaba claro cómo estas proteínas transfirieron direccionalmente PS de la ER a la PM. Osh6p y Osh7p pueden atrapar PI(4)P como un ligando lipídico alternativo12. En levaduras, PI(4)P se sintetiza a partir de fosfatidilinositol (PI) en el Golgi y el PM por PI 4-quinasas, Pik1p y Stt4p, respectivamente. Por el contrario, no hay PI(4)P en la membrana ER, ya que este lípido es hidrolizado a PI por la fosfatasa Sac1p. Por lo tanto, existe un gradiente PI(4)P tanto en las interfaces ER/Golgi como ER/PM. Osh6p y Osh7p transfieren PS del ER al PM a través de ciclos de intercambio PS/PI(4)P utilizando el gradiente PI(4)P que existe entre estas dos membranas12.
Dentro de un ciclo, Osh6p extrae PS del ER, intercambia PS por PI(4)P en el PM y transfiere PI(4)P de vuelta al ER para extraer otra molécula de PS. Osh6p/Osh7p interactúan con Ist2p28, una de las pocas proteínas que conectan y acercan la membrana ER y el PM entre sí para crear sitios de contacto ER-PM enlevaduras 29,30,31. Además, la asociación de Osh6p con membranas cargadas negativamente se debilita tan pronto como la proteína extrae uno de sus ligandos lipídicos debido a un cambio conformacional que modifica sus características electrostáticas32. Esto ayuda a Osh6p al acortar su tiempo de permanencia en la membrana, manteniendo así la eficiencia de su actividad de transferencia de lípidos. Combinado con la unión a Ist2p, este mecanismo podría permitir que Osh6p/7p ejecute de forma rápida y precisa el intercambio de lípidos en la interfaz ER/PM. En células humanas, las proteínas ORP5 y ORP8 ejecutan el intercambio PS/PI(4)P en los sitios de contacto ER-PM a través de mecanismos distintos33. Tienen un ORD central, similar a Osh6p, pero están anclados directamente al ER a través de un segmento transmembrana C-terminal33 y se acoplen al PM a través de un dominio de homología de Pleckstrin (PH) N-terminal que reconoce PI(4)P y PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 utiliza PI(4)P para transferir PS, y se ha demostrado que ORP5/8 regula adicionalmente los niveles de PM PI(4,5)P2 y presumiblemente modula las vías de señalización. A su vez, una disminución en los niveles de PI(4)P y PI(4,5)P2 reduce la actividad de ORP5/ORP8 ya que estas proteínas se asocian con el PM de una manera dependiente de PIP. La síntesis anormalmente alta de PS, que conduce al síndrome de Lenz-Majewski, afecta los niveles de PI(4)P a través de ORP5/836. Cuando se bloquea la actividad de ambas proteínas, el PS se vuelve menos abundante en el PM, disminuyendo la capacidad oncogénica de las proteínas de señalización37.
Por el contrario, la sobreexpresión de ORP5 parece promover la invasión de células cancerosas y los procesos metastásicos38. Por lo tanto, las alteraciones en la actividad de ORP5/8 pueden modificar severamente el comportamiento celular a través de cambios en la homeostasis lipídica. Además, ORP5 y ORP8 ocupan sitios de contacto ER-mitocondrias y preservan algunas funciones mitocondriales, posiblemente suministrando PS39. Además, ORP5 se localiza en los sitios de contacto de gotas lipídicas ER para administrar PS a las gotas lipídicas mediante el intercambio PS/PI(4)P40. La estrategia aquí descrita para medir (i) la extracción de PS y PI(4)P de liposomas y (ii) el transporte de PS y PI(4)P entre liposomas ha sido ideada para establecer y analizar la actividad de intercambio PS/PI(4)P de Osh6p/Osh7p12,32 y utilizada por otros grupos para analizar la actividad de ORP5/ORP835 y otras LTPs10, 41. Se basa en el uso de un lector de placas de fluorescencia, un espectrofluorómetro estándar de formato L y dos sensores fluorescentes, NBD-C2Lact y NBD-PHFAPP,que pueden detectar PS y PI(4)P, respectivamente.
NBD-C2Lact corresponde al dominio C2 de la glicoproteína, la lactadherina, que fue rediseñado para incluir una cisteína única expuesta a solvente cerca del presunto sitio de unión a PS; un fluoróforo NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) sensible a la polaridad está unido covalentemente a este residuo (Figura 1A)12. Para ser más precisos, el dominio C2 de la lactadherina (Bos taurus, UniProt: Q95114, residuos 270-427) se clonó en un vector pGEX-4T3 para ser expresado en fusión con glutatión S-transferasa (GST) en Escherichia coli. La secuencia C2Lact se mutó para sustituir dos residuos de cisteína accesibles al disolvente (C270, C427) con residuos de alanina e introducir un residuo de cisteína en una región cercana al supuesto sitio de unión a PS (mutación H352C) que posteriormente se puede etiquetar con N,N'-dimetil-N-(yodoacetil)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) etileno diamina (IANBD) 12. Un sitio de escisión para la trombina está presente entre la proteína GST y el N-terminal del dominio C2. Una ventaja importante es que este dominio reconoce selectivamente PS de una manera independiente de Ca2+a diferencia de otros dominios C2 conocidos o Anexina A542. NBD-PHFAPP se deriva del dominio PH de la proteína 1 humana adaptadora de cuatro fosfatos (FAPP1), que fue rediseñada para incluir una sola cisteína expuesta a solvente que puede etiquetarse con un grupo NBD cerca del sitio de unión PI(4)P(Figura 1A)43. La secuencia de nucleótidos del dominio PH de la proteína FAPP humana (UniProt: Q9HB20, segmento [1-100]) ha sido clonada en un vector pGEX-4T3 para ser expresado en tándem con una etiqueta GST. La secuencia PHFAPP ha sido modificada para insertar un residuo único de cisteína dentro de la interfaz de unión a la membrana de la proteína43. Además, se ha introducido un enlazador de nueve residuos entre el sitio de escisión de la trombina y el N-terminal del dominio PH para garantizar la accesibilidad a la proteasa.
Para medir la extracción de PS de liposomas, NBD-C2Lact se mezcla con liposomas hechos de fosfatidilcolina (PC) que contienen trazas de PS. Debido a su afinidad por PS, esta construcción se une a los liposomas, y el fluoróforo NBD experimenta un cambio en la polaridad a medida que entra en contacto con el ambiente hidrófobo de la membrana, lo que provoca un cambio de azul y un aumento en la fluorescencia. Si PS se extrae casi completamente por una cantidad estequiométrica de LTP, la sonda no se asocia con liposomas, y la señal NBD es menor (Figura 1B)32. Esta diferencia de señal se utiliza para determinar si un LTP(por ejemplo, Osh6p) extrae PS. Una estrategia similar se utiliza con NBD-PHFAPP para medir la extracción de PI(4)P(Figura 1B),como se describió anteriormente12,32. Se diseñaron dos ensayos basados en FRET para (i) medir el transporte de PS de los liposomas LA a LB, que imitan la membrana ER y el PM, respectivamente, y (ii) el transporte pi(4)P en la dirección inversa. Estos ensayos se realizan en las mismas condiciones(es decir, el mismo tampón, temperatura y concentración de lípidos) para medir el intercambio PS/PI(4)P. Para medir el transporte de PS, NBD-C2Lact se mezcla con liposomas LA compuestos de PC y se dopa con 5 mol% PS y 2 mol% de fosfatidiletanolamina (Rhod-PE)- fluorescente-marcando rodamina y liposomas LB que incorporan 5 mol% PI(4)P.
En el momento cero, FRET con Rhod-PE apaga la fluorescencia NBD. Si PS se transporta de liposomas LA a LB (por ejemplo, al inyectar Osh6p), se produce un desencanto rápido debido a la translocación de moléculas delact NBD-C2 de liposomas LA a LB (Figura 1C). Dada la cantidad de PS accesible, NBD-C2Lact permanece esencialmente en un estado unido a la membrana en el transcurso del experimento12. Por lo tanto, la intensidad de la señal NBD se correlaciona directamente con la distribución de NBD-C2Lact entre los liposomas LA y LB y se puede normalizar fácilmente para determinar cuánto PS se transfiere. Para medir la transferencia de PI(4)P en la dirección opuesta, NBD-PHFAPP se mezcla con liposomas LA y LB; dado que solo se une a liposomas LB que contienen PI(4)P, pero no Rhod-PE, su fluorescencia es alta. Si PI(4)P se transfiere a los liposomas LA, se transloca a estos liposomas, y la señal disminuye debido a FRET con Rhod-PE(Figura 1C). La señal se normaliza para determinar cuánto PI(4)P se transfiere43.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; L-cisteína &ge; 97 % (FG)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W326305-100G</td><td>Prepare una solución madre de L-cisteína de 10 mM en agua. Las alícuotas se almacenan a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, para el almacenamiento de lípidos en CHCL3</td><td>Wheaton</td><td>W224681</td><td></td></tr><tr><td>perlas de vidrio de 4 mm de diámetro</td><td>Sigma</td><td>Z265934-1EA 50</td><td></td></tr><tr><td>mL tubo de centrífuga cónico</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Purificador KTA</td><td>GE HEALTHCARE</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Papel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de aluminio Amicon Ultra-15 con un MWCO de 3 y 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC900324, UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 con un MWCO de 3 y 10 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC800324, UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td></td><td></td><td>Prepare una solución madre de 50 mg/mL con agua filtrada y esterilizada y guárdela a -20 y deg;C.</td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma</td><td>B8385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Células Competentes de Oro</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C16:0 Liss&nbsp; (Rhod-PE) en CHCl3 (1 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C-5MG</td><td></td></tr><tr><td>C16:0/C16:0-PI(4)P&nbsp; &nbsp;</td><td>Echelon Lipids</td><td>P-4016-3</td><td>Disuelva 1 mg de polvo C16:0/C16:0-PI(4)P en 250 &micro; L de MeOH y 250 &micro; L de CHCl3. A continuación, complete con CHCl3 a 1 mL. La solución debe ser clara.</td></tr><tr><td>C16:0/C18:1-PS (COPS) en CHCl3 (10 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>C18:1/C18:1-PC (DOPC) en CHCl3 (25 mg/mL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C-500mg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td>Prepare 10 mM de solución madre de CaCl2 en agua.</td></tr><tr><td>Disruptor</td> celular de <td>dinámica</td><td></td><td></td>constante</tr><tr><td>Cloroformo (CHCl3) RPE-ISO</td><td>Carlo Erba</td><td>438601</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel completo de inhibidores de proteasas sin EDTA</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td><td></td>desionizada (Milli-Q)</tr><tr><td>Dimetilformamida (DMF), anhidra, >99% pura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADNasa I Recombinante, libre de ARNasa, en polvo</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td>Prepare 1 M de solución madre de DTT en agua Milli-Q. Prepare alícuotas de 1 mL y guárdelas a -20 °C.</td></tr><tr><td>Columnas de cromatografía Econo-Pac (1,5 y veces; 12 cm).</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de electroporación 2 mm</td><td>Ozyme</td><td>EP102</td><td></td></tr><tr><td>Electroporador Eppendorf 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ángulo fijo Tubos Ti45 y Ti45</td><td>Beckman</td><td>Hilado de los lisados</td><td></td>de batcerial</tr><tr><td>Jeringas de vidrio (10, 25 y 50 &micro; L) para el experimento de fluorescencia</td><td></td> Jeringas de vidrio Hamilton <td></td><td></td></tr><tr><td>(25, 100, 250, 500 y 1000 &micro; L) para manejar soluciones madre lipídicas</td><td>Hamilton</td><td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN tipo3, 1001RN</td><td></td></tr><tr><td>Glutatión Sepharose 4B perlas</td> GE <td>Healthcare</td><td>17-0756-05</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (99% puro)</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de hemólisis con tapa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES , >99% puro</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Illustra Columna de desalinización NAP 10</td><td>GE healthcare</td><td>GE17-0854-02</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B</td><td>Prepare 1 M de solución madre IPTG en Milli-Qwater. Prepare alícuotas de 1 mL y guárdelas a -20 °C.</td></tr><tr><td>K-Acetato</td><td>Prolabo</td><td>26664.293</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Caldo medio sin glucosa</td><td></td><td></td><td>Preparado con agua milli-Q y esterilizado en autoclave.</td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido</td><td>Linde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol (MeOH) &ge; 99.8%</td><td>VWR</td><td>20847.24</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td></td><td>Prepare una solución de 2 M de MgCl2. Filtre la solución con un 0,45 &micro; Filtro M.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microplaca de 96 pocillos PS F-Botom Negro</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Miniextrusora con dos jeringas Hamilton herméticas al gas de 1 mL</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas de fluorescencia basado en monocromador</td><td>TECAN</td><td>M1000 Pro</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Dimetil-N-(Yodoacetil)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-il)Etilendiamina) (IANBD Amida)</td><td>Sondas moleculares</td><td></td><td>Disuelva 25 mg de IANBD en 2,5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) y prepare 25 alícuotas de 100 &micro; L en tubos de rosca de 1,5 mL. No enrosque completamente la tapa. A continuación, retire el DMSO en un liofilizador para obtener 1 mg de IANBD seco por tubo. Los tubos se cierran y se almacenan a -20 °C; C en la oscuridad.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1,8 mM KH2PO4, esterilizado en autoclave y almacenado a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Matraces de vidrio en forma de pera (25 mL, 14/23, vidrio Duran)</td><td>Duran Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>p5318-25mg</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-C2LACT&nbsp; plásmido</td><td></td><td></td><td>Disponible bajo pedido en nuestro laboratorio</td></tr><tr><td>pGEX-PHFAPP plásmido</td><td></td><td></td><td>Disponible a petición de nuestro laboratorio</td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) &ge; 98,5% (GC)</td><td>Sigma</td><td>P7626-25g</td><td>Prepare una solución madre de PMSF de 200 mM en isopropanol</td></tr><tr><td>Phosphoramidon</td><td>Sigma</td><td>R7385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de policarbonato (19 mm de diámetro) con un tamaño de poro de 0,2 y micro; m</td> Columna de cromatografía <td>Poly-Prep de Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>(con un volumen de lecho de 0-2 mL y un depósito de 10 mL)</td>Prefiltros <td>7311550</td><td></td> <td>Biorad</td></tr><tr><td>(10 mm de diámetro).</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>http://pymol.org/</td><td></td> <td>Construcción de los modelos 3D de las proteínas (Figura 1A)</td></tr><tr><td>Cubeta de cuarzo para fluorescencia UV/visible (volumen mínimo de 600 &micro; L)</td> Cubetas <td>de cuarzo Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Centrífuga refrigerada Hellma <td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Eppendorf 5427R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>Buchi</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca (1,5 mL)</td><td>Sarsted</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pequeña barra de agitación magnética PFTE (5 y veces; 2 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga con tapón a presión (0,5, 1 y 2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYPRO naranja</td><td></td><td></td><td>tinción fluorescente para detectar proteínas en el gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>THROMBIN, DE PLASMA HUMANO</td><td>Sigma</td><td>10602400001</td><td>Disolver 20 unidades en 1 mL de agua milli-Q y preparar 25 &micro; Alícuotas L en tubos Eppendorf de 0,5 mL. Luego congele y almacene a -80 ° C.</td></tr><tr><td>Tris,</td><td>ultracentrífuga ultrapura MP</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>L90K</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de absorbancia UV/visible</td> Espectrofluorómetro UV/visible <td>SAFAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>con soporte de celda con control de temperatura y dispositivo de agitación</td><td>Jasco o Shimadzu</td><td>Jasco FP-8300 o Shimadzu RF-5301PC</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de vacío</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XK 16/70 columna embalada con Sephacryl S200HR</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mediciones basadas en fluorescencia del intercambio de fosfatidilserina/fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Recientemente se ha encontrado que varios miembros de la familia de proteínas relacionadas con la proteína de unión al oxisterol (OSBP) (ORP)/homólogos OSBP (Osh) conservadas evolutivamente representan un nuevo grupo de proteínas de transferencia de lípidos (LTP) en levaduras y células humanas. Transfieren fosfatidilserina (PS) del retículo endoplásmico (ER) a la membrana plasmática (PM) a través de ciclos de intercambio PS/fosfatidilinositol 4-fosfato (PI(4)P). Este hallazgo permite una mejor comprensión de cómo el PS, que es crítico para los procesos de señalización, se distribuye por toda la célula y la investigación del vínculo entre este proceso y el metabolismo de la fosfoinosítida (PIP). El desarrollo de nuevos protocolos basados en la fluorescencia ha sido fundamental en el descubrimiento y caracterización de este nuevo mecanismo celular in vitro a nivel molecular. Este artículo describe la producción y el uso de dos sensores lipídicos etiquetados fluorescentemente, NBD-C2Lact y NBD-PHFAPP,para medir la capacidad de una proteína para extraer PS o PI(4)P y transferir estos lípidos entre membranas artificiales. En primer lugar, el protocolo describe cómo producir, etiquetar y obtener muestras de alta pureza de estas dos construcciones. En segundo lugar, este artículo explica cómo usar estos sensores con un lector de microplacas de fluorescencia para determinar si una proteína puede extraer PS o PI(4)P de liposomas, utilizando Osh6p como estudio de caso. Finalmente, este protocolo muestra cómo medir con precisión la cinética del intercambio PS/PI(4)P entre liposomas de composición lipídica definida y determinar las tasas de transferencia de lípidos por transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) utilizando un fluorómetro estándar.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> Figura 1: Descripción de los sensores lipídicos fluorescentes y ensayos in vitro. (A) Modelos tridimensionales de NBD-C2Lact y NBD-PHFAPP basados en la estructura cristalina del dominio C2 de la lactadherina bovina (PDB ID: 3BN648) y la estructura de RMN del dominio PH de la proteína FAP...

Aquí, describimos protocolos que utilizan sensores de lípidos fluorescentes y liposomas para determinar si una proteína extrae y transporta fosfatidilserina o fosfatidilinositol 4-fosfato in vitro.

Mediciones basadas en fluorescencia del intercambio de fosfatidilserina/fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Este método utiliza la fluorescencia para determinar si una proteína se transfiere a liqids biológicamente importantes entre la membrana sintética y así contribuir a la distribución de estos lípidos dentro de las células eucariotas. Esta técnica permite la extracción y transporte de un lípido natural por una proteína, requiere células de fluorescencia y liposomas que son fáciles de hacer. Este método se puede utilizar y modificar para obtener información sobre la biología celular mediante proteínas detrás de la distribución de algunos lípidos esenciales entre el órgano y las membranas.La demostración visual es fundamental para explicar cómo realizar mediciones en tiempo real de la transferencia de lípidos por fluorescencia. Así que demostrando el procedimiento también estará Maud Magdeleine, una ingeniera de mi laboratorio. Comience preparando un tampón de acetato de potasio HEPES fresco filtrado y des gaseado, complementado con un cloruro de magnesio milimolar para formar un tampón HKM.Luego, prepare liposomas solo hechos de PC o dopados adicionalmente con dos porcentajes molares PS o PI(4)P. Ahora, coloque el matraz en un evaporador rotativo para secar el lípido al vacío. En un pozo, mezcle liposomas que contengan dos porcentajes molares de PS con sensor de lípidos, NBD-C2 Lact, a una concentración final de 250 nanomolares y un volumen de 100 microlitros.Llene un segundo pozo con la misma cantidad de liposoma y lacta NBD-C2 mezclado con tres proteínas de transferencia de lípidos micromolares o LTP. Llene un tercer pozo con 250 lact nanomolares NBD-C2 mezclados con liposomas PC micromolares puros de 80 y un cuarto pozo con liposomas PC micromolares puros de 80. Repita estos pasos para preparar tres series adicionales de cuatro pozos.Luego coloque la placa de múltiples pozos en el lector de fluorescencia. Para cada pozo registre un espectro NBD de 505 a 650 nanómetros con un ancho de banda de cinco nanómetros tras la excitación a 490 nanómetros a 25 grados centígrados. Para cada serie, reste el espectro registrado con solo liposomas de los otros espectros.Para el ensayo de extracción PI(4)P preparar liposomas dopados con dos porcentajes molares de fosfatidilinositol-4-fosfato y realizar mediciones con la sonda NBD-PH FAPP. Realice experimentos de control y determine el porcentaje de extracción. Después de terminar de extruir los liposomas llenan un tubo con estos liposomas extruidos.Prepare un tampón HKM recién des gaseado y filtrado y mantenga los tubos que contienen liposomas extruidos a temperatura ambiente. Envuelva los tubos que contienen liposomas con fosfatidiletanolamina etiquetada con rodamina en papel de aluminio y guárdelos en una caja opaca para evitar cualquier fotoblanqueo. Ajuste la temperatura entre 25 y 37 grados centígrados y ajuste los monocromómetros de excitación a 460 nanómetros con un ancho de banda corto de uno a tres nanómetros y la emisión a 530 nanómetros con un gran ancho de banda de más de 10 nanómetros.Establezca el tiempo de adquisición en veinticinco minutos con la resolución de tiempo de como máximo un segundo. En la cubeta de cuarzo diluir 30 microlitros de la suspensión de liposomas LA y la solución madre de lact NBD-C2 y el tampón HKM precalentado para preparar una muestra de 570 microlitros que contiene 200 lípidos totales micromolares y 250 nanomolares o NBD-C2 lact. Agregue una pequeña barra de agitación magnética y coloque la cubeta en el soporte del fluorómetro.Una vez que la muestra está equilibrada térmicamente, se activa la medición. Después de un minuto, agregue 30 microlitros de la suspensión de liposomas LB a la muestra. Después de tres minutos, inyecte LTP en la muestra para que la concentración final de LTP sea de 200 nanomolares, luego adquiera la señal durante los 21 minutos restantes.Realizar un experimento paralelo para normalizar la señal NBD. Mezclar 30 microlitros de suspensión de liposomas de equilibrio LA con 250 lact nanomolares NBD-C2 en tampón HKM a un volumen final de 570 microlitros. Después de un minuto, inyecte 30 microlitros de suspensión de liposomas de equilibrio LB.Convierta las curvas cinéticas medidas con un LTP de interés para determinar la cantidad de PS transferido de LA a liposomas LB a lo largo del tiempo. A continuación, normalice cada punto de datos de la curva. Realice el experimento PI(4)P utilizando los mismos ajustes y condiciones del emisor de suelo que para el ensayo de transferencia PS.En la cubeta, mezcle 30 microlitros de suspensión de liposomas lb y sonda NBD-PH FAPP con tampón HKM precalentado para obtener un volumen final de 570 microlitros. Una vez alcanzado el equilibrio térmico de la muestra, iniciar la medición. Después de un minuto, inyecte 30 microlitros de suspensión de liposomas LA.Después de tres minutos, inyecte el LTP de interés y grabe la señal. Realice un segundo experimento para normalizar la señal NBD. Mezcle 30 microlitros de suspensión de liposomas de equilibrio lb con 250 nanomolares NBD-PH FAPP y 570 microlitros de tampón HKM.Después de un minuto, inyecte 30 microlitros de suspensión de liposomas de equilibrio LA. Convierta las curvas cinéticas para determinar la cantidad de PI(4)P transferido de LB a liposomas LA a lo largo del tiempo, luego normalice cada punto de datos. Cuantificar el grado en que un LTP es eficiente.Realizar una regresión lineal de los primeros puntos de datos de la cinética de transferencia para obtener una pendiente. Divida el valor de pendiente por la concentración de LTP en la mezcla de reacción para determinar el número de moléculas lipídicas transferidas por proteína por unidad de tiempo. La recuperación eficiente de la lactancia C2 de las cuentas se verificó con el análisis de la página SDS.El espectro absorbente ultravioleta visible de C2 lact etiquetado con NBD confirmó que todas las moléculas de C2 lact fueron etiquetadas con un grupo NBD. La pureza del lacto NBD-C2 y su fluorescencia se determinaron mediante el análisis de páginas SDS. La fluorescencia de NBD-C2 lact o NBD-PH FAPP fue máxima cuando solo se utilizaron liposomas que contenían PS o PI(4)P para la incubación, lo que indica que el sensor estaba unido a la membrana.Se observó una baja fluorescencia cuando Osh6p también estaba presente, lo que indica que esta proteína extrajo eficientemente PS o PI(4)P de los liposomas. Se muestran los resultados de un ensayo de transferencia de PS utilizando Osh6p como LTP. Se calcularon las curvas cinéticas promedio de transferencia de PS de liposomas LA a liposomas LB, dopados o no dopados con fosfatidilinositol-4-fosfato.La tasa media inicial de transporte de PS se determinó a partir de tres experimentos distintos. Del mismo modo, los resultados de un ensayo de transferencia PI(4)P utilizando Osh6p como LTP se muestran aquí. Junto con las curvas cinéticas medias obtenidas tras la normalización de la señal.Las tasas medias de transferencia se midieron con liposomas de LA dopados o no dopados con PS. Al realizar este protocolo utilice un búfer nuevo y prepárese los mismos días. Minimice la exposición a la luz de liposomas y proteínas fluorescentes, use proteínas bien purificadas con la etiqueta NBD y manténgalas en hielo. se puede confirmar midiendo la transferencia de PS y PI(4)P entre orgánulos dentro de la célula procariota utilizando sensores de lípidos fluorescentes codificados genéticamente.Esta técnica allana el camino para una mejor comprensión de PS y PI(4) se distribuyen dentro de la célula, y su actividad sufre la especificidad de varios LTPS.

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Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este video, demostramos las interacciones proteína-fosfoinositida en un patrón microfluídico utilizando el ensayo de modulación de pH, utilizando un colorante fluorescente sensible al pH marcado con el lípido de fosfatidiletanolamina de una bicapa lipídica soportada, llamada plataforma microfluídica. Las modulaciones en el pH después de la unión de proteínas a fosfolípidos causan extinción de fluorescencia.

Ensayo de modulación del pH en bicapas lipídicas soportadas para detectar interacciones proteína-fosfoinositida

Basado en polarización reflexión interna total microscopía de fluorescencia (pTIRFM) permite la detección en tiempo real de la dinámica de la membrana celular. En este artículo se describe la implementación del pTIRFM para el estudio de la remodelación de la membrana durante la exocitosis regulada. La técnica es generalizable a otros procesos en biología celular que directa o indirectamente implican cambios en la forma de la membrana.

Imaging membrana plasmática Deformaciones Con pTIRFM

La distribución espacial y la dinámica temporal de las proteínas y lípidos de la membrana plasmática es un tema candente en biología. En este caso, este problema se aborda mediante un análisis de fluctuación de imagen espacio-temporal que proporciona conceptualmente las mismas cantidades físicas de seguimiento de una sola partícula, pero utiliza etiquetas moleculares pequeñas y configuraciones de microscopía estándar.

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Presentamos una nueva técnica para medir la difusión lateral de una especie tensioactiva en la interfaz fluido-fluido mediante la fusión de una monocapa de gota en una monocapa plana.

La recuperación de fluorescencia después de combinar una gotita de medir la difusión de dos dimensiones de un fosfolípido monocapa

Fosfoinosítidos están señalando los lípidos cuya abundancia relativa cambia rápidamente en respuesta a diversos estímulos. Este artículo describe un método para medir la abundancia de fosfoinosítidos por las células metabólicamente etiquetado con 3 H- myo -inositol, seguido por extracción y desacilación. Glicero-inositides extraídos se separan luego por cromatografía líquida de alta resolución y cuantificados por centelleo de flujo.

El radiomarcado y cuantificación de los niveles celulares de Fosfoinosítidos por acoplado a cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de centelleo

PI (4,5) P 2 regula diversas funciones celulares, pero su organización nanoescala en la membrana plasmática de la célula es poco conocido. Por PI etiquetado (4,5) P 2 con una sonda fluorescente de dos colores fusionado con el dominio de homología Pleckstrin, se describe un nuevo enfoque para estudiar la PI (4,5) P 2 distribución espacial en la membrana plasmática en la escala nanométrica .

Single-molécula de super-resolución de imagen de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en la membrana plasmática con la novela fluorescentes Sondas

Describimos un ensayo basado en fluorescencia para medir la mezcla de fosfolípidos en grandes liposomas unilamelares reconstituidos con opsina.

Un ensayo basado en la fluorescencia de fosfolípido escramblasa Actividad

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

La utilización de receptores de etiquetado pHluorin de Seguimiento de localización subcelular y el Tráfico

Este protocolo presenta un método de imagen de fluorescencia que utiliza una clase de fluoróforos lipídicos sensibles al pH para monitorear el tráfico de membranas lipídicas durante la exocitosis celular y el ciclo de endocitosis.

Medición del recambio de lípidos de membrana con el análogo lipídico fluorescente sensible al pH ND6

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía TIRF para rastrear canales iónicos individuales y determinar su actividad en las membranas lipídicas soportadas, definiendo así la interacción entre el movimiento de la membrana lateral y la función del canal. Describe cómo preparar las membranas, registrar los datos y analizar los resultados.

Imágenes de una sola molécula de la movilidad lateral y la actividad del canal iónico en bicapas lipídicas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

Describimos un método para utilizar la ciclodextrina para mediar el intercambio entre lípidos de la membrana plasmática con lípidos exógenos. Esta técnica se puede combinar con experimentos que estudian proteínas transmembrana, que se comportan de manera diferente en entornos lipídicos similares a balsas que en entornos no similares a balsas.

Ensayo de intercambio de lípidos en células vivas

Aprende a medir el intercambio de fosfatidilserina y fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas artificiales mediante fluorescencia. Este protocolo utiliza sensores lipídicos marcados con NBD y la proteína Osh6p para cuantificar la transferencia de lípidos en tiempo real.

Mediciones basadas en fluorescencia del intercambio de fosfatidilserina/fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas

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