Name: Inmunostaining De Retinas De Montaje Completo Con El Método De Claro De Tejido CLARITY (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprende el protocolo CLARITY para inmunotinción de retinas de montaje completo en ratón. Este método mejora la transparencia óptica y permite la imagen tridimensional de alta resolución de neuronas retinianas.

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Nos gustaría agradecer a Bing Ye, Nathan Spix y Hao Liu por su soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Becas de Salud EY022640 (D.-Q.Z.) y oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).

El cuidado del ratón y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud para animales de laboratorio y fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Oakland (protocolo no. 18071).
Nota: Los nombres de las soluciones y sus composiciones se enumeran en la tabla 1.
1. Preparación de tejidos
<ol><li>Eutanasiar el ratón con una sobredosis de CO2,seguida de dislocación cervical.</li>
	<li>Enuclear los ojos con fórceps curvos y transferirlos a una pequeña placa de Petri con 0,1 M PBS (Tabla 1). Bajo un microscopio de disección, haga un pequeño agujero a lo largo de la unión córnea-esclerótica con una aguja. Transferencia al paraformadehído al 4% (PFA) durante 1 hora.</li>
	<li>Transferir el ojo de nuevo a un plato con PBS. Bajo un microscopio de disección, use tijeras de disección para cortar todo el camino alrededor de la unión córnea-esclerótica. Retire la córnea y el cristalino. Corte en la base del nervio óptico y desprenda cuidadosamente la esclerótica con las autopsas para aislar la retina.</li>
	<li>Haga cuatro pequeños cortes uniformemente alrededor de la retina y use un cepillo de punta fina sumergido en PBS para ponerlo plano (lado GCL hacia abajo) en forma de trébol en un pequeño corte cuadrado de papel de filtro de nitrocelulosa para estabilizar la retina.</li>
	<li>Transfiera la retina usando fórceps para sostener la esquina del papel de nitrocelulosa (sin tocar la retina montada) y colóquela en una placa de 48 pocillos con 4% de PFA durante 1 hora.</li>
	<li>Transfiera el papel de filtro y la retina a un pozo con PBS y lave (3x durante 5 min cada uno).</li>
	<li>Transferir a A4P0 (Tabla 1) e incubar durante la noche a 4 °C con agitación suave.</li>
	<li>Pipetee el aceite vegetal en el pozo para cubrir completamente la solución A4P0. Incubar en un baño de agua a 40 °C durante 3 horas sin agitar.</li>
	<li>Lave (3x durante 5 minutos cada uno) en PBS, asegurándose de que todo el aceite se haya enjuagado. Si es necesario, use una pipeta para retirar cuidadosamente el aceite restante de la parte superior del pozo antes del último enjuague.</li>
	<li>Incubar en SDS al 10% a 40 °C durante dos días con temblores suaves. Reemplace SDS con una solución nueva el segundo día.</li>
	<li>Transferir el papel de filtro y la retina a PBS con Triton-X-100 (PBST, Tabla 1)y lavar (5x para 1,5 h cada uno).</li>
	<li>Conservar a 4 °C en PBST con azida de sodio al 0,01% (NaN3)o pasar directamente a inmunotensoración.</li>
</ol>2. Inmunosutención y correspondencia del índice de refracción
<ol><li>Retire la retina del papel de filtro desprendiéndolo suavemente con un cepillo de punta fina en PBST.</li>
	<li>Incubar la retina en anticuerpo primario(Tabla 2)diluido en solución bloqueador(Tabla 1)durante 2 días a 40 °C con un suave temblor.</li>
	<li>Lavar (5x, 1,5 h cada uno) en PBST.</li>
	<li>Incubar con los anticuerpos secundarios apropiados(Tabla 3)diluido en solución de bloqueo durante 2 días a 40 °C con agitación suave y proteger de la luz durante el resto del procedimiento.</li>
	<li>Lavar (5x, 1,5 h cada uno) en tampón de fosfato de 0,02 M (ver Tabla 1).</li>
	<li>Incubar en solución de correspondencia de índice de refracción a base de sorbitol (sRIMS, ver Tabla 1)a 40 °C durante la noche con agitación suave.</li>
</ol>3. Montaje
<ol><li>Delinee una cubierta de vidrio de 18 mm x 18 mm x 1,5 mm con un marcador permanente de punta fina para marcar un límite cuadrado en la parte posterior de un portaobjetos de microscopio de vidrio.</li>
	<li>Voltee la diapositiva y use una jeringa para trazar el límite con una delgada línea de grasa de silicona en la parte frontal de la diapositiva, dejando un pequeño espacio en una esquina para que escape el exceso de solución de montaje.</li>
	<li>Transfiera la retina al centro del área acotada y arregle con un cepillo de punta fina para que quede plano con el lado del fotorreceptor contra el portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Pipetee aproximadamente 60 μL de sRIMS para que cubra la retina aplanada y se extienda hasta una esquina del recinto, cuidando que la retina se mantenga plana y en su lugar.</li>
	<li>Aplique el cubrebocas a partir de la esquina con el sRIMS y baje lentamente hasta que toque la grasa por todos los lados, evitando la formación de burbujas de aire.</li>
	<li>Coloque una pila de 3 cubrebocas a cada lado de la retina montada como espaciador. Utilice el borde largo de otra diapositiva para presionar hacia abajo la cubierta para que el montaje sea plano y uniforme.</li>
	<li>Guarde los portaobjetos planos a 4 °C hasta la toma de imágenes.</li>
</ol>4. Imágenes
<ol><li>Muestras de imagen en un microscopio de fluorescencia convencional o en un microscopio confocal(Tabla de materiales). Comience colocando el portaobjetos en la etapa del microscopio y localizando la muestra. NOTA: Si se está utilizando un microscopio objetivo invertido, coloque la corredera boca abajo en el escenario, primero asegurándose de que las áreas expuestas de la diapositiva estén despejadas de toda la grasa de silicona y la solución de montaje.</li>
	<li>Para obtener imágenes apiladas en z de muestras co-etiquetadas, primero concéntrese en la señal en cada canal individualmente y establezca el tiempo de exposición o la velocidad de escaneo, para microscopios de fluorescencia o confocales, respectivamente.</li>
	<li>Establezca el rango para la pila z estableciendo manualmente el plano focal en la parte superior e inferior del rango deseado, o estableciendo el punto medio y luego especificando un rango alrededor del punto medio.</li>
	<li>Ajuste el tamaño del paso o el número de sectores como desee.</li>
	<li>Capturar la imagen y guardar el archivo original, así como exportarlo como un archivo TIFF u otro formato deseado.</li>
</ol>5. Análisis de imágenes
<ol><li>Utilice el software de análisis de imágenes de elección(Tabla de materiales)para ajustar el brillo y el contraste en cada canal hasta que se logre una claridad óptima tanto en las imágenes individuales como en la representación en 3 dimensiones de la pila z. NOTA: Si el tamaño de paso seleccionado es lo suficientemente pequeño, también se puede realizar la deconvolución 3D para mejorar la señal.</li>
</ol>

<ol><li>Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Dopamine and retinal function.</a> Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).</li>
<li>McMahon, D. G., Iuvone, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+the+mammalian+retina%3A+from+gene+regulation+to+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).</li>
<li>Prigge, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+ipRGCs+Influence+Visual+Function+through+Retrograde+Signaling+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).</li>
<li>Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin+mediates+retrograde+visual+signaling+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina.</a> PLoS One. 7 (8), 42647(2012).</li>
<li>Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GluA2-containing+calcium-impermeable+AMPA+receptors+on+dopaminergic+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).</li>
<li>Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+Receptors+Contribute+to+Retrograde+Synaptic+Transmission+from+Ganglion+Cell+Photoreceptors+to+Dopaminergic+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279(2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332(2013).</li>
<li>Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+to+perform+CLARITY+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Simplified method to perform CLARITY imaging.</a> Molecular Neurodegeneration. 9, 19(2014).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Magliaro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+CLARITY%3A+Quantitative+Optimization+of+the+Diffusion+Based+Delipidation+Protocol+for+Genetically+Labeled+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 179(2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Zheng, H., Rinaman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+CLARITY+for+visualizing+immunofluorescence+labeling+in+the+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain.</a> Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).</li>
<li>Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+dopaminergic+neurons%3A+differential+maturation+of+somatodendritic+and+axonal+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments.</a> Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Modificación del protocolo CLARITY para las retinas de montaje completo. Hemos simplificado el protocolo CLARITY para lograr una polimerización adecuada sin necesidad de una cámara de evacuación o desecación al vacío, como se utiliza en la mayoría de los estudios previos7,9,11. El proceso de polimerización es inhibido por el oxígeno, requiriendo que la muestra sea aislada del aire durante la etapa de polimeri...

La retina de los vertebrados es quizás la parte más accesible del sistema nervioso central (SNC), y sirve como un excelente modelo para estudiar el desarrollo, la estructura y la función del cerebro. Cinco clases de neuronas en la retina se distribuyen en tres capas nucleares separadas por dos capas plexiformes. La capa nuclear externa (ONL) consiste en fotorreceptores clásicos (varillas y conos) que convierten la luz en señales eléctricas. Las señales eléctricas son procesadas por las neuronas en la capa nuclear interna (INL), incluyendo las células bipolares, horizontales y amacrinas, y luego transmitidas a las células ganglionares de la retina (CRG) en la capa de células ganglionares (GCL). Los CRG son las neuronas de salida de la retina, con los axones que se proyectan hacia el cerebro para contribuir a la función visual formadora y no formadora de imágenes. Además, tres tipos de células gliales (células de Muller, astroglia y microglía) proporcionan nutrientes a las neuronas y protegen a las neuronas de los cambios dañinos en su entorno extracelular.
Una subpoblación especializada de células amacrinas produce y libera dopamina, un importante neuromodulador en el SNC, reconfigurando los circuitos neuronales de la retina durante la adaptación a la luz1,2. Las células dopaminérgicas del amacrine (DAC) tienen una característica única de perfiles morfológicos. Sus somatas se localizan en el INL proximal con dendritas que se ramifican en la parte más distal de la capa plexiforme interna (IPL). Axón-como los procesos de DAC son unmyelinated, delgado y largo, escasamente ramificado, y varicosidades del oso (los sitios del lanzamiento de la dopamina). Forman un plexo denso con dendritas en el IPL, incluyendo estructuras en forma de anillo alrededor de la somata de las células amacrinas AII. Los axones también corren a través del INL hacia el OPL, formando una vía centrífuga a través de la retina3. Hemos demostrado que dac procesa receptores expresos en respuesta a la liberación de glutamato de las neuronas presinápticas, incluyendo las células bipolares y las células ganglionares de la retina intrínsecamente fotosensibles (ipRGCs)4,5,6. Sin embargo, no está claro si los receptores de glutamato se expresan en los axones, dendritas o ambos, ya que están cortados en secciones verticales de la retina y no se pueden distinguir entre sí5,6. Immunostaining necesita ser realizado en retinas de montaje completo para revelar la ramificación tridimensional de DAC y la presencia de receptores del glutamato en compartimientos subcelulares. Aunque la retina es relativamente transparente, el grosor de una retina de montaje completo de ratón es de aproximadamente 200 μm, lo que limita la penetración de anticuerpos en el tejido profundo, así como reduce la penetración de la luz para imágenes de alta resolución debido a la dispersión de la luz del tejido. Para superar estas limitaciones, adaptamos el método de delipidación de hidrogel tisular compatible con inmunosuficiente (CLARITY) desarrollado recientemente para secciones cerebrales gruesas a retinas de ratón de montaje completo7.
El método CLARITY fue desarrollado originalmente por el laboratorio Deisseroth para inmunosupertenimiento e imágenes de muestras cerebrales gruesas7. Utiliza un detergente fuerte, sulfato de dodecil sódico (SDS) y electroforesis para eliminar los componentes lipídicos (que causan la dispersión de la luz del tejido), dejando las proteínas y los ácidos nucleicos en su lugar. Los lípidos eliminados se reemplazan con un andamio transparente compuesto de monómeros de hidrogel como la acrilamida para apoyar la estructura proteica restante. El tejido despejado se puede etiquetar a través de inmunohistoquímica y tomar imágenes con una profundidad de penetración de luz sustancialmente mayor a través del tejido (hasta varios milímetros por debajo de la superficie del tejido). Desde entonces, el método CLARITY ha sido optimizado y simplificado por varios grupos de investigación8,9,10. Un protocolo CLARITY modificado utiliza una técnica pasiva de limpieza para evitar el posible daño tisular producido por la electroforesis para limpiar todo el cerebro y otros órganos intactos11. Sin embargo, este método todavía no se ha aplicado a las retinas de montaje completo. Aquí, adaptamos la técnica pasiva de la CLARIDAD para las retinas del entero-montaje para hacerlas más transparentes para immunohistochemistry y la proyección de imagen. Encontramos que preservaron a una mayoría de las proteínas retinianas probadas durante este proceso para immunohistochemistry. Utilizando la solución de coincidencia de índice de refracción, pudimos obtener imágenes de neuronas de la retina a través de los aproximadamente 200 μm de espesor de la ONL a la GCL en retinas de montaje completo.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehído al 16%</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>15710</td><td>Fijador</td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP170</td><td>Monómero de hidrogel</td></tr><tr><td>Axio Imager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscopio de fluorescencia</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td>Agente bloqueador</td></tr><tr><td>Eclipse Ti</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Confocal de barrido microscopio</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td>Componente tampón</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Componente tampón</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td>Componente tampón</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Componente tampón</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0751</td><td>Componente tampón</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>Conservante bacteriostático</td></tr><tr><td>NDS</td><td>Aurion</td><td>900.122</td><td>Agente bloqueante</td></tr><tr><td>NIS Elements AR</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>de análisis de imágenes SDS</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>Agente de deslipidación</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51876</td><td>Componente tampón</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Surfactante</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td>Surfactante</td></tr><tr><td>VA-044</td><td>Wako Chemicals</td><td>011-19365</td><td>Iniciador térmico</td></tr></tbody></table>

inmunostaining de retinas de montaje completo con el método de claro de tejido clarity

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

El método de delipidación de hidrogel tisular (CLARITY), desarrollado originalmente por el laboratorio Deisseroth, ha sido modificado y ampliamente utilizado para la inmunotensación y la obtención de imágenes de muestras cerebrales gruesas. Sin embargo, esta tecnología avanzada aún no se ha utilizado para retinas de montaje completo. Aunque la retina es parcialmente transparente, su grosor de aproximadamente 200 μm (en ratones) todavía limita la penetración de anticuerpos en el tejido profundo, así como la reducción de la penetración de la luz para imágenes de alta resolución. Aquí, adaptamos el método CLARITY para retinas de ratón de montaje completo polimerizándolas con un monómero de acrilamida para formar un hidrogel nanoporoso y luego despejandolas en sulfato de dodecil sódico para minimizar la pérdida de proteínas y evitar daños tisulares. las retinas CLARIDAD-procesadas immunostained con los anticuerpos para las neuronas retinianas, las células glial, y las proteínas sinápticas, montadas en una solución que emparejaba del índice de refracción, e imagendas. Nuestros datos demuestran que la CLARIDAD puede mejorar la calidad de la coloración e proyección de imagen immunohistochemical estándar para las neuronas retinianas y las células glial en la preparación del entero-montaje. Por ejemplo, la resolución 3D de las estructuras ariíticas y axones finos de las células dopaminérgicas de amacrina fueron mejoradas mucho por CLARITY. En comparación con las retinas de montaje completo no procesadas, CLARITY puede revelar inmunotensión de proteínas sinápticas como la proteína de densidad postsináptica 95. Nuestros resultados muestran que la CLARIDAD hace la retina más ópticamente transparente después de la eliminación de lípidos y preserva las estructuras finas de las neuronas de la retina y sus proteínas, que se pueden utilizar rutinariamente para la obtención de imágenes de alta resolución de las neuronas de la retina y sus estructuras subcelulares en la preparación de montaje completo.

Las retinas procesadas clarity modificadas son tejido ópticamente transparente. Para formular un método de limpieza de tejido que es compatible con aplicaciones inmunohistoquímicas en la retina, mientras que proporciona una delipidación adecuada y la retención de la integridad estructural de las proteínas celulares, se adaptó el método de claro de tejido CLARITY para todo el monte de las retinas de ratón. Pudimos simplificar el protocolo y modificarlo para retinas de montaje completo (ver Protocolo). ...

Aquí presentamos un protocolo para adaptar el método de la CLARIDAD de los tejidos cerebrales para las retinas del entero-montaje para mejorar la calidad de la coloración immunohistochemical estándar y de la proyección de imagen de alta resolución de neuronas retinianas y de sus estructuras subcelulares.

Inmunostaining De Retinas De Montaje Completo Con El Método De Claro De Tejido CLARITY

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...

Este protocolo permite la investigación de la morfología fina de neuronas retinianas y puede dar la penetración en los cambios morfológicos celulares y subcelulares que ocurren en estados de la enfermedad. Este método mejora perceptiblemente la transparencia óptica de la retina y permite la proyección de imagen de alta resolución, tridimensional, el cableado del circuito, y las estructuras subcelulares finas de neuronas retinianas en la preparación de la retina de la hormona. Enuclee los ojos del ratón con fórceps curvos y transfiéntelos en una pequeña placa de Petri con PBS de 0,1 M.Haga un pequeño agujero a lo largo de la unión de la esclerótica de la córnea con la aguja debajo del microscopio de disección, luego transfiera el ojo a formaldehído de potencia al 4% durante una hora. Transferir el ojo de nuevo a un plato con PBS. Bajo un microscopio de disección, use tijeras de disección para cortar todo el camino alrededor de la unión corneoescleral.Retire la córnea y el cristalino. Luego córtela en la base del nervio óptico y pela cuidadosamente la esclerótica con pórceps para aislar la retina. Haga cuatro pequeños cortes uniformemente alrededor de la retina y use un cepillo de punta fina sumergido en PBS para ponerlo plano GCL lateralmente hacia abajo en forma de trébol en un pequeño corte cuadrado de papel de filtro de nitrocelulosa.Recoja la esquina del papel de nitrocelulosa con las autorórceps y colóquelo en una placa de 48 pocillos con formaldehído al 4% de potencia durante una hora, luego transfiera el papel de filtro y la retina a un pozo con PBS y lave tres veces durante cinco minutos cada uno. Descongelar la solución A4P0 sobre hielo. Luego transfiera la retina a la solución A4P0 e incube durante la noche a cuatro grados Centígrados con una agitación suave.Agregue aceite vegetal en el pozo para cubrir completamente la solución A4P0. Incubar en un baño de agua a 40 grados centígrados durante tres horas sin agitar. Luego lavar tres veces en PBS durante cinco minutos por lavado.Incubar la retina en sulfato de dodecil al 10% de sodio a 40 grados centígrados durante dos días con agitación suave y luego transferir el papel de filtro y la retina a PBS con Triton X-100 y lavar cinco veces durante 90 minutos por lavado. Después del lavado final, almacene la retina a cuatro grados centígrados en PBS-T con azida de sodio al 0,01% o muévase directamente a la tinción inmunológica. Retire la retina del papel de filtro desprendiéndolo suavemente con un cepillo de punta fina en PBS-T.Incubado en anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo durante dos días a 40 grados centígrados con agitación suave. Después de la incubación, lavar cinco veces durante 90 minutos en PBS-T. Incubar la retina con anticuerpos secundarios apropiados diluido en solución de bloqueo durante dos días a 40 grados centígrados con temblores suaves.Proteja las muestras de la luz durante el resto del procedimiento. Lave la retina cinco veces durante 90 minutos en tampón de fosfato de 0,02 M. Finalmente, incube la retina en una solución de coincidencia de índice de refracción a base de sorbitol a 40 grados centígrados durante la noche con una agitación suave.Delinee un resbalón de cubierta de vidrio con un marcador permanente de punta fina para marcar un límite cuadrado en la parte posterior de un portaobjetos de microscopio de vidrio. Voltee la diapositiva y use una jeringa para trazar el límite con una delgada línea de grasa de silicona en la parte frontal de la diapositiva. Deje un pequeño espacio en una esquina para que se escape el exceso de solución de montaje.Transfiera la retina al centro del área acotada y colóquela con un cepillo de punta fina para que quede plana con el lado del fotorreceptor contra el portaobjetos de vidrio. Pipetee aproximadamente 60 microlitros de sRIMS para que cubra la retina aplanada y se extienda hasta una esquina del recinto. Asegúrese de que la retina permanezca plana y en su lugar.Aplique el resbalón de la cubierta, comenzando desde la esquina con el sRIMS y baje lentamente hasta que toque la grasa en todos los lados. Coloque una pila de tres resbalones de cubierta a cada lado de la retina montada como un espaciador. Utilice el borde largo de otra diapositiva para presionar hacia abajo el resbalón de la cubierta para que el montaje sea plano y uniforme.Guarde las diapositivas a cuatro grados centígrados hasta obtener imágenes. Comience colocando el portaobjetos en la etapa del microscopio y localizando la muestra. Para obtener imágenes Z apiladas de muestras, primero concéntrese en la señal en cada canal individualmente y establezca el tiempo de exposición o la velocidad de escaneo para microscopios de fluorescencia o confocales, respectivamente.Establezca el rango para la pila Z estableciendo manualmente el plano focal en la parte superior e inferior del rango deseado o estableciendo el punto medio y luego especificando un rango alrededor del punto medio. Ajuste el tamaño del paso o el número de sectores como desee. Capture la imagen y guarde el archivo original.A continuación, se exporta como un archivo TIF u otro formato deseado. Utilice el análisis de imágenes, software de elección para ajustar el brillo y el contraste en cada canal hasta que se logre una claridad óptima tanto en las imágenes individuales como en la representación tridimensional de la pila Z. Cuando se procesó con el protocolo CLARITY modificado se observó una transparencia óptica completa en todo el grosor de la retina en comparación con las retinas de control no procesadas.Las imágenes apiladas Z para los conos etiquetados arrestin en ONL, los DAC etiquetados TH en INL, y los RGCs marcados RBPMS en GCL se muestran aquí. La localización relativa de neuronas a través del grueso entero de la retina fue observada en la imagen del recubrimiento. La coloración del TH y la CLARIDAD procesaron las retinas enteras del montaje fueron comparadas con las imágenes obtenidas de la preparación estándar.Las dendritas y axón-como procesos de DAC fueron reveladas más claramente en una retina procesada claridad que en una retina estándar. Axón-como procesos de DAC exhibió completo anillo-como las estructuras en una retina de la claridad comparada a una retina estándar. Anillo-como las estructuras de la retina de la CLARIDAD tomadas usando microscopia de la fluorescencia eran casi idénticas a ésas observadas usando microscopia confocal.Los procesos axón-como también funcionaron hacia la retina externa. La coloración inmunológica contra GluA2 y PSD-95 demostró el puncta distinto, revelando GluA2 individual que contenía los receptores de AMPA y los sitios sinápticos supuestos del poste, respectivamente. Una imagen de superposición mostró algunos puncta en los procesos DAC.Los puntos de la co-localización supuesta fueron presentados en los planos XZ, YZ, y XY y el TH co-localizado claramente con GluA2 y PSD-95. Es importante que la retina permanezca plana durante el proceso de polimerización por hidrogel para que la retina despejada pueda colocarse plana para el proceso de montaje e imagen.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La retina murino neonatal proporciona un modelo bien caracterizado fisiológica de la angiogénesis, que permite que las investigaciones de las funciones de los diferentes genes o fármacos que modulan la angiogénesis en...

Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

ACT-PRESTO (claridad técnica de presión activa derivada de la transmisión eficiente y estable de macromoléculas en órganos) permite el despeje rápido de los tejidos, eficiente, pero de bajo costo y la penetración rápida de anticuerpos en los tejidos aclarados por difusión pasiva o el parto asistido por presión. Usando este método, una amplia gama de tejidos se puede borrar, immunolabeled de múltiples anticuerpos, y la imagen de volumen.

ACT-PRESTO: Aclaración del tejido biológico y métodos para immunolabeling Volume Imaging

Demostrar técnicas de preparación de tres tejidos diferentes para la visualización de immunohistochemical del pericitos microvasculares retina de rata, es decir, cryo-secciones, todo-montajes e hipotónica aislamiento de la red vascular.

Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares

La combinación de etiquetado de anticuerpos, limpieza óptica y microscopía de luz avanzada permite el análisis tridimensional de estructuras u órganos completos. Aquí se describe un método sencillo para combinar la inmunoetiquetado de rodajas renales gruesas, la limpieza óptica con la canela etílico y la imagen confocal que permite la visualización y cuantificación de estructuras renales tridimensionales.

Limpieza óptica e imágenes del tejido renal inmunoetiquetado

Este protocolo describe el procedimiento para aislar la retina de ratón de montaje completo y realizar inmunotinción para marcar todas las células ganglionares de la retina (RGC). Al proceso le siguen las imágenes y el recuento automático de las RGC mediante un software basado en IA, lo que proporciona un método sencillo, rápido y preciso para cuantificar las RGC en toda la retina del ratón.

Inmunotinción de montaje completo y recuento automático de células ganglionares de la retina de ratón

Los pericitos de la vasculatura de la retina se examinaron mediante tinción inmunofluorescente con receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β después de la inyección retroorbitaria de lectina fluorescente de tomate. La retina marcada se trató posteriormente con el método de limpieza de tejidos y se montó completa para visualizar las vistas tridimensionales de los pericitos que rodean la vasculatura de la retina bajo un microscopio confocal.

Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción 

Este protocolo combina el aclaramiento óptico y el inmunomarcaje para obtener imágenes confocales de volumen completo de organoides de retina de montaje completo. Preserva la estructura 3D, lo que permite una visualización detallada de las vías neuronales clave, mejorando el estudio de la maduración de la retina, la organización espacial y sus posibles aplicaciones en el modelado de enfermedades y la medicina personalizada.

Visualización de organoides retinianos de montaje completo con resolución celular

Se describe el procedimiento para preparar...

Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

Identificación de inmuno periféricos subtipos de fibras nerviosas sensoriales (y la detección de la expresión de proteínas en ella) son fundamentales para la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la sensación periférica. A continuación se describen los métodos para la preparación de las muestras de los tejidos periféricos / visceral, como los huesos y la piel del miembro, por inmunotinción específica de las fibras nerviosas sensoriales periféricas.

Preparación y tejido de fibras inmunotinción ratón nerviosas sensoriales que inervan la piel y los huesos de extremidades

Aprende el protocolo CLARITY para inmunotinción de retinas de montaje completo en ratón. Este método mejora la transparencia óptica y permite la imagen tridimensional de alta resolución de neuronas retinianas.

Inmunostaining De Retinas De Montaje Completo Con El Método De Claro De Tejido CLARITY

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