Name: Establecimiento de un sistema de cultivo de esferoides epidérmicos de alto rendimiento para modelar la plasticidad de las células madre de queratinocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprende a cultivar esferoides epidérmicos en 3D usando queratinocitos humanos y el ensayo de replanteo. Este protocolo de alto rendimiento permite modelar enfermedades cutáneas y estudiar la plasticidad de células madre epidérmicas.

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El UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) proporcionó acceso a equipos de clasificación de imágenes y células y asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención 1R21CA201853. El MCF y el IRF reciben apoyo parcial de la subvención P20GM103499 de los NIH, SC INBRE. El MCF también recibe apoyo de la subvención P20GM109091 de los NIH. Yvon Woappi fue apoyado en parte por las subvenciones de los NIH 2R25GM066526-06A1 (PREP) y R25GM076277 (IMSD), y por una beca del Programa de Profesores Grace Jordan McFadden en UofSC. Geraldine Ezeka y Justin Vercellino fueron apoyados por las subvenciones de los NIH 2R25GM066526-10A1 (PREP) en UofSC. Sean M. Bloos fue apoyado por el Magellan Scholar Award 2016 en la UofSC.

El protocolo para la recolección y manejo de muestras de piel y aislamiento de queratinocitos humanos ha sido revisado por el IRB de la Universidad de Carolina del Sur (UofSC) y clasificado como "investigación que no involucra sujetos humanos", ya que los especímenes de prepucio eran descartes quirúrgicos producidos durante procedimientos quirúrgicos de rutina (circuncisión de niños neonatos) y estaban completamente desprovistos de información de identificación. El protocolo también fue revisado y aprobado por el Comité de Bioseguridad de la UofSC de forma regular, y todo el personal de laboratorio se sometió a capacitación en bioseguridad de laboratorio. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares de seguridad y ética de UofSC.
1. Aislamiento y cultivo de queratinocitos humanos a partir de tejido del prepucio neonatal
<ol><li>Prepare el medio de lavado agregando un tampón HEPES de 0.1 M a 500 ml de medio KSFM y ajústelo a un pH de 7.2. Esterilizar el medio en un filtro de vacío de 500 ml (tamaño de poro de 0,22 μm). El medio basal MCDB 153-LB también se puede utilizar como una solución de lavado alternativa en lugar de KSFM.</li>
	<li>En una campana de flujo laminar, lave el prepucio neonatal con 5 ml de medios de lavado en un tubo cónico de 50 ml. Repetir dos veces.</li>
	<li>Transfiera el prepucio lavado a una placa de Petri estéril. Usando un bisturí y forzapas, raspe los tejidos conectivos adiposos y sueltos de la capa dérmica. Vuelva a lavar el prepucio con 5 ml de medios de lavado en un tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Coloque la epidermis del prepucio hacia arriba en una placa de 6 ortes que contenga 2 ml de enzima dispasa diluida en medios de lavado (50 U / ml).</li>
	<li>Transfiera la placa a una incubadora durante 4 horas (37 ° C, 5% CO2,95% de humedad).</li>
	<li>Retire el prepucio de la incubadora y, en condiciones estériles, transfiéralo a una placa de Petri. Usando forrceps de punta fina, separe la epidermis de la capa de la dermis.</li>
	<li>Coloque la epidermis en un tubo cónico de 15 ml que contenga 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25%. Usando una pipeta serológica de 5 ml, aplaste mecánicamente la epidermis flotante. Incubar durante 15 min a 37 °C con vórtice periódico durante 5 s cada 5 min.</li>
	<li>Después de la incubación, agregue 2 ml de inhibidor de tripsina de soja y mezcle mediante pipeteo para neutralizar la tripsina.</li>
	<li>Suspensión de la célula centrífuga durante 2 min a 450 x g, y luego durante 8 min a 250 x g.</li>
	<li>Retire los escombros flotantes con pinzas, teniendo cuidado de no desalojar la bolita de la celda. Aspire cuidadosamente el sobrenadante de la bolita celular.</li>
	<li>Resuspend pellet en 12 mL de medio KSFM-scm completo y plato en un plato de 10 cm. Incubar el plato durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).</li>
	<li>Al día siguiente, retire el medio con una pipeta aspiradora y reemplácelo con 12 ml de KSFM-scm completo. Repita los días 4 y 7.</li>
	<li>Para mantener un crecimiento óptimo de los cultivos normales de queratinocitos humanos (NHKc), las células de paso 1:5 el día 10 para evitar que las células alcancen una confluencia superior al 80%.</li>
</ol>2. Generación de cultivos de epidermosfera cutánea in vitro
<ol><li>Prepare una mezcla de agarosa al 5% agregando 2.5 g de agarosa a 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), en una botella de vidrio de 50 ml. Botella de autoclave bajo ciclo líquido. Dejar enfriar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para preparar los platos, coloque la botella de vidrio enfriada que contiene la solución de agarosa en un vaso de precipitados de plástico de 1 L lleno de agua desionizada de 200 ml (dH2O). Derrita la mezcla de agarosa en un microondas de grado de investigación durante un tiempo de hasta 2 minutos, mezclando el agar cada 60 s inclinando suavemente la botella de lado a lado. PRECAUCIÓN: La fusión del agar en el microondas hará que el recipiente del matraz se caliente mucho, lo que provocará una acumulación de presión. Libera la acumulación de presión cada 30 s. Use el equipo de protección adecuado para evitar lesiones.</li>
	<li>Añadir 3 ml de agarosa derretida al 5% a 12 ml de KSFM-scm precalentado a 42 °C para una concentración final de agarosa al 1% (wt/vol). Opcional: precalentar las pipetas serológicas y las puntas de la pipeta para evitar la polimerización prematura del agar blando.</li>
	<li>Pipetee rápidamente 200 μL de la mezcla de agar al 1% en pozos individuales de una placa de fondo redondo de 96 pozos utilizando un pipeteador multicanal(Figura 1A). Deje la placa en un ambiente estéril a 25 °C durante 4 h para permitir que la agarosa se polimerice por completo. NOTA: La experimentación se puede detener aquí y continuar al día siguiente. Las placas de agarosa polimerizadas se pueden mantener a 37 °C hasta 24 h o a 4 °C durante un tiempo de hasta 48 h cuando se sellan con envoltura de parafilm. Caliente la placa a 37 °C en una incubadora humidificada durante al menos 1 h antes de su uso.</li>
	<li>Paso de NHKc formadora de esferoides mediante medios de aspiración y células de lavado en 2 mL de PBS. Aspire PBS y agregue 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% a las células lavadas. Incubar durante 5 min a 37 °C o hasta que todas las células se desprendan por completo. Agregue 2 ml de inhibidor de tripsina de soja a la placa y lave las células de la placa en un tubo de 15 ml. Centrífuga a 250 x g durante 5 min.</li>
	<li>Pellet resuspend en 1 mL de PBS. Cuantifique la viabilidad celular utilizando tinción azul tripano y un hemocitómetro o un contador celular automatizado.</li>
	<li>Alícuota 2 x 104 NHKc en 100 μL de KSFM-scm y semilla en pozos individuales de placa de fondo redondo de 96 pozos previamente preparada. Incubar la placa durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).</li>
	<li>Usando un microscopio de contraste de fase invertida, analice bien sembrado para la formación de epidermosfera. NOTA: Las epidermósferas humanas de queratinocitos humanos normales pueden permanecer viables en cultivo de suspensión 3D hasta 96 h, aunque con una disminución considerable de la viabilidad celular (Figura 2).</li>
</ol>3. Ensayo de re-recubrimiento de esferoides epidérmicos
<ol><li>24-48 h después de la formación de la epidermosfera 3D, agregue 4 ml de KSFM-scm precalentado a un plato de 6 cm. Use una punta de pipeta de 1 ml de diámetro ancho para transferir un solo esferoide a la placa, asegurándose de no romperla. Alternativamente, ensancha una punta de pipeta de 1 ml usando una cuchilla de afeitar estéril para cortar la punta.</li>
	<li>Incubar la placa durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).</li>
	<li>Analice el esferoide sembrado para su fijación a la parte inferior de la placa y observe la propagación de células utilizando un microscopio de contraste de fase invertida(Figura 3). Alimente las células cada 96 h retirando suavemente 2 ml del medio dentro de la placa y agregando lentamente 2 ml de medios KSFM-scm frescos a la placa.</li>
	<li>Paso derivado de esferoides derivados (SD) NHKc una vez que alcanzan el 70-80% de confluencia y continúan con el ensayo de elección. Monitoree SD-NHKc con frecuencia para evitar que las células alcancen la confluencia completa en cultivo, ya que esto resulta en una diferenciación prematura y una detención del crecimiento celular(Figura 3E-F).</li>
	<li>El ensayo de replanteo de esferoides epidérmicos modela la reparación de heridas mediada por queratinocitos capturando cada una de las fases secuenciales clave de la plasticidad regenerativa epidérmica: a) mantenimiento homeostático, b) detención / reversión de la diferenciación c) movilidad del linaje de estrés y d) restauración de tejidos(Figura 1B; Tabla 2). Este ensayo también se puede utilizar para producir poblaciones celulares para cultivos organotípicos en balsa o para modelar neoplasias mediadas por VPH como se demostró en nuestro trabajo anterior 11,12.</li>
</ol>4.3D seguimiento de células de fluorescencia
<ol><li>En un plato de 6 cm, transfectar cultivos NHKc monocapa 2D formadores de esferoides con 1 μg de vector plásmido pMSCV-IRES-EGFP que lleva el gen de la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP). Incubar la placa durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad) microscopio(Figura 4A). NOTA: Es importante que la transfección se complete en condiciones libres de suero y sin antibióticos.</li>
	<li>Sin eliminar la mezcla de transfección, agregue 2 ml de KSFM-scm precalentado a las células. Incubar la placa durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).</li>
	<li>Aspire todos los medios de transfección de la placa y las células de alimentación con 3 ml de KSFM-scm precalentado. Evalúe la presencia de células que expresan EGFP bajo el canal FITC de un microscopio fluorescente.</li>
	<li>Paso y siembra 2 x 104 células transfectadas por EGFP en pozos individuales de una placa de fondo redondo de 96 pozos previamente preparada. Incubar la placa durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad). Visualizar y monitorear el movimiento de las células esferoidespos EGFP bajo el canal FITC de un microscopio de fluorescencia (Figura 4B-C).</li>
	<li>24 h después del emplatado, agregue 3 ml de KSFM-scm precalentado a un plato de 6 cm. Use una punta de pipeta de 1 ml de diámetro ancho para transferir un solo esferoide a la placa, asegurándose de no romperla. Incubar la placa durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).</li>
	<li>Observe y analice la propagación de SD-NHKcEGFP utilizando un microscopio de fluorescencia. Alimente las células cada 96 h retirando suavemente 2 ml de los medios dentro de la placa y agregando lentamente 2 ml de medios KSFM-scm frescos a la placa.</li>
	<li>Cosecha SD-NHKCEGFP para aislamiento FACS o ensayos de elección.</li>
</ol>5. Caracterización de subalternes derivadas de esferoides (DE) por FACS
<ol><li>Pasaje SD-NHKc y correspondientes cultivos monocapa 2D autólogos mediante aspiración de medios viejos y células de lavado en 2 mL de PBS. Retire el PBS y agregue 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% a las células lavadas. Incubar a 37 °C durante 5 min o hasta que todas las células se desprendan por completo.</li>
	<li>Agregue 2 ml de inhibidor de tripsina de soja a la placa y transfiera las células a un tubo de 15 ml. Centrífuga a 250 x g durante 5 min.</li>
	<li>Resuspend pellets en 1 mL de PBS. Cuantificar la viabilidad celular utilizando azul tripano y un contador celular automatizado de hemocitómetro.</li>
	<li>Alícuota de 100 μL que contiene 0,1-4 x 106 células NHKc a 1,5 ml de tubos de microcentrífuga. Coloque el tubo sobre hielo en un ambiente oscuro, creado apagando las luces brillantes dentro de la campana laminar.</li>
	<li>Añadir 2 μL de anti-integrina conjugada con FITCα6 y 2 μL de anti-EGFR conjugado con PE a los tubos para lograr una dilución de 1:50. Prepare un tubo sin anticuerpos agregados para que sirva como control no manchado. Incubar tubos sobre hielo en la oscuridad o a 4 °C durante 30 min. El uso de perlas o una línea de SCC de piel puede servir como control positivo, ya que las células de SCC de la piel expresan niveles elevados de integrinaα6 y EGFR.</li>
	<li>Realizar análisis de citometría de flujo utilizando citómetro de flujo de elección que contenga con láseres apropiados.</li>
	<li>Use los controles negativo y positivo para establecer puertas. Ordenar la subpoblación de integrinaα6hi/EGFRlo células; estos son la fracción de células madre epidérmicas. Las células integrinα6hi/EGFRhi son la fracción de células progenitoras proliferativas. Las células integrinα6lo/EGFRhi son la fracción celular progenitora comprometida (Figura 4D). Los tubos FACS de clasificación deben contener al menos 1 ml de KSFM-scm helado.</li>
	<li>Pruebe la capacidad proliferativa de las subpoblaciones de células clasificadas transfiriendo el contenido de cada tubo de clasificación respectivo a un tubo cónico de 15 ml que contiene 10 veces el volumen de células clasificadas en PBS. NOTA: Es importante eliminar todas las células unidas al borde pipeteando la pared de los tubos FACS de clasificación varias veces, ya que los queratinocitos a menudo pueden adherirse allí.</li>
	<li>Centrífuga de 15 mL tubos a 250 x g durante 5 min. Retire el pellet sobrenadante y resuspend en 12 ml de KSFM-scm. Transfiera las células resuspendidas a una placa de 6 cm e incube durante la noche (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad).</li>
	<li>Al día siguiente, retire los medios en las placas y agregue 8 ml de KSFM-scm precalentados. Incubar a 37 ° C, 5% de CO2,95% de humedad. Re-alimentar las células con 12 ml de medio cada 3 días hasta un 70-80% de confluencia (Figura 4E).</li>
</ol>6. Inmunofluorescencia y tinción de epidermósferas para marcadores de células madre basales
<ol><li>Transfiera epidermósferas a fundas recubiertas con poli-lisina. Permita que SD-NHKc se propague hasta un 75% de confluente.</li>
	<li>Lave las células dos veces en PBS (4 °C) durante 5 minutos cada una.</li>
	<li>Fije las células con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 20 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Permeabilizar las células con 0,5% de Tritón X-100 en 1% de glicina. Bloquee usando 0.5% BSA y 5% de suero de cabra durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar muestras con anticuerpos contra P63 (1:200) y citoqueratina 14 (1:200) en solución de bloqueo durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Lavar tres veces con PBS (4 °C) que contenga Tween 20 (PBST), seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados FITC y Alexa 568 (dilución 1:1000).</li>
	<li>Teñir núcleos con 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (dilución 1:5000) antes de montar células.</li>
	<li>Observe las células utilizando un microscopio con capacidad fluorescente con líneas láser FITC y PE (Figura 4F).</li>
</ol>7. Análisis transcripcional de cultivos epidermósferos
<ol><li>Establecer placas triplicadas de cultivos NHKc de paso bajo para aislar el ARN puede ser de cultivos monocapa, esferoides y derivados de esferoides de la misma línea celular autóloga.</li>
	<li>Pool 3-5 epidermósferas correspondientes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Cosecha por separado cultivos autólogos SD-NHKc y monocapa 2D.</li>
	<li>Aislar el ARN total de los tres grupos.</li>
	<li>Realizar transcripción inversa con 1 μg de ARN total.</li>
	<li>Utilizando cDNA, realizar PCR en tiempo real, utilizando GAPDH como control interno (Tabla 1).</li>
	<li>Valide el tamaño del producto de amplicón mediante electroforesis en gel de agarosa (2% v/v). NOTA: Para el perfil transcriptómico de cultivos de epidermosfera utilizando el análisis de microarrays de genoma completo, aísle el ARN total de cultivos masivos de un solo donante de NHKc y el correspondiente SD-NHKc del mismo donante, en seis réplicas cada uno.</li>
	<li>Evalúe la calidad del ARN utilizando un bioanalizador para lograr números de integridad de ARN (RIN) que van desde al menos 9.0 a 9.1.</li>
	<li>Realizar experimentos de microarrays amplificando y biotinilando muestras de ARN total.</li>
	<li>Transcribir inversamente 100 ng de ARN total por muestra en ds-cDNA utilizando cebadores aleatorios de NNN que contienen una secuencia promotora de ARN polimerasa T7.</li>
	<li>Agregue la ARN polimerasa T7 a las muestras de ADNc para amplificar el ARN, luego copie el ARN a ss-cDNA. Degradar el exceso de ARN mediante el uso de RNasa H.</li>
	<li>Fragmente las moléculas de sscDNA y etiquete con biotina.</li>
	<li>Amplificar las muestras etiquetadas durante 16 h a 45 °C.</li>
	<li>Hibridar muestras utilizando un horno de hibridación y un kit de lavado y tinción.</li>
	<li>Lavar y teñir matrices hibridadas.</li>
	<li>Analice matrices utilizando un sistema y una estación de trabajo informática.</li>
	<li>Después de completar los escaneos de la matriz, importe los archivos de intensidad de celda de sonda (CEL) en el software de la consola de expresión y procese a nivel genético utilizando el archivo de biblioteca y el algoritmo de análisis multichip robusto (RMA) para generar archivos CHP.</li>
	<li>Después de confirmar la calidad de los datos en Expression Console, importe archivos CHP que contengan señales de expresión log2 para cada sonda en un software de análisis de transcriptoma para analizar las respuestas transcripcionales específicas del tipo de célula mediante el análisis unidireccional de la varianza entre sujetos.</li>
</ol>8. Evaluación de la eficiencia de formación de colonias SD-NHKc
<ol><li>Aspirar medios de placas cuando las células alcanzan el 70-80% de confluencia. Lave las células tres veces en PBS (4 °C) durante 5 minutos cada una.</li>
	<li>Fijar celdas con 3 mL de metanol al 100% (4 °C) durante 15 min. Lavar tres veces en PBS durante 5 min cada una.</li>
	<li>Tiñe las células en 3 mL de 10% Giemsa durante 30 min. Lavar tres veces en PBS durante 5 min cada una. Deje que las celdas se sequen al aire durante la noche.</li>
	<li>Analizar la formación de colonias al día siguiente y cuantificar el número de colonias obtenidas</li>
</ol>9. Determinar la duplicación de la población SD-NHKc
<ol><li>Pasaje SD-NHKc y correspondientes cultivos monocapa 2D autólogos mediante aspiración de medios viejos y lavado de células en PBS de 2mL. Retire el PBS y agregue 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% a las células lavadas. Incubar durante 5 min o hasta que todas las células se desprendan completamente (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).</li>
	<li>Agregue 2 ml de inhibidor de tripsina de soja a la placa y transfiera las células a un tubo de 15 ml.</li>
	<li>Centrífuga a 250 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 12 ml de KSFM-scm.</li>
	<li>Células de semillas a baja densidad 1-2 x 104 NHKc en platos individuales de 10 cm e incubar durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).</li>
	<li>Placas de alimentación con 8 mL KSMF-scm al día siguiente. Alimente cada 4 días hasta al menos un 25% de confluente, luego alimente cada 2 días.</li>
	<li>Pasar en serie las celdas 1:5 en platos de 60 cm hasta agotar la capacidad de proliferación celular. Cuantificar la viabilidad celular mediante tinción de azul tripano. Determinar las duplicaciones de población en cada pasaje utilizando la fórmula: log(N/N0) / log2, donde N representa el número total de células obtenido en cada pasaje y N0 representa el número de células chapadas al comienzo del experimento.</li>
</ol>

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<li>Kuo, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+targeting+versatile+tissue+bioassays+using+a+PDMS-based+hanging+drop+array%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array.</a> Scientific Reports. , (2017).</li>
<li>Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSE94244+-+Expression+data+from+normal+human+spheroid-forming+keratinocytes+in+monolayer+mass+culture+and+from+corresponding+cornified-like+spheroid+ring+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Omnibus+%28GEO%29%22%5BJournal%5D)">GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures.</a> Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen relaciones financieras que revelar.

El uso de sistemas de cultivo de esferoides 3D ha tenido una amplia utilidad en la evaluación de la madre celular. Se ha demostrado que estos sistemas mejoran el enriquecimiento de las células madre tisulares13, sin embargo, su utilidad para el estudio de las células madre epidérmicas humanas se ha explorado de manera limitada. Aquí, describimos una estrategia para enriquecer las células madre de queratinocitos humanos utilizando técnicas de cultivo 3D. En este sistema, los NHKc se cultivan como s...

El epitelio estratificado de mamíferos es la arquitectura epitelial más compleja en todos los sistemas vivos y con mayor frecuencia está sujeto a daños y lesiones. Como tejido protector, el epitelio estratificado ha evolucionado para generar una respuesta compleja y efectiva al daño tisular. Tras la lesión, estas células deben activar programas de plasticidad de linaje, que les permitan migrar al sitio lesionado y llevar a cabo la reparación1,2,3. Esta respuesta multifacética ocurre en varios pasos secuenciales que siguen siendo poco conocidos.
Un obstáculo importante en el estudio del intrincado proceso de regeneración epitelial radica en la escasez de sistemas modelo de alto rendimiento que puedan capturar actividades celulares dinámicas en etapas definidas de regeneración celular. Si bien los modelos de ratones in vivo ofrecen información relevante sobre la cicatrización de heridas y recapitulan más de cerca el proceso regenerativo humano, su desarrollo requiere esfuerzos laboriosos y un costo significativo, lo que limita su capacidad de rendimiento. Existe, por lo tanto, una necesidad crítica de establecer sistemas que permitan la investigación funcional de la regeneración del tejido epitelial humano a una escala de alto rendimiento.
En los últimos años, se han hecho varios intentos para enfrentar el desafío de la escalabilidad. Esto se ve a través de una gran expansión de modelos innovadores basados en células in vitro y ex vivo que imitan de cerca el contexto regenerativo in vivo. Esto incluye avances en organ-on-chip4,esferoide5,organoide6y cultivos organotípicos7. Estos sistemas basados en células 3D ofrecen ventajas únicas y presentan distintas limitaciones experimentales. Hasta la fecha, el cultivo de esferoides sigue siendo el modelo de cultivo celular 3D más rentable y ampliamente utilizado. Y aunque varios informes han indicado que los cultivos de esferoides se pueden utilizar para estudiar las características de las células madre de la piel, estos estudios se han realizado en gran medida con tejido animal8,9o con fibroblastos dérmicos10,sin prácticamente informes que caractericen a fondo las propiedades regenerativas de los cultivos de esferoides epidérmicos humanos. En este protocolo detallamos el desarrollo funcional, el cultivo y el mantenimiento de cultivos de esferoides epidérmicos a partir de queratinocitos humanos normales (NHKc). Igualmente describimos la utilidad de este sistema para modelar las fases secuenciales de la regeneración epidérmica y la plasticidad de las células madre queratinocitos in vitro.

<table><tbody><tr><td>Plataforma Affymetrix</td><td>Affymetrix</td><td></td><td>Para experimentos de microarrays</td></tr><tr><td>Affymetrix' s Archivo de biblioteca HuGene-2_0-st</td><td>Proceso Affymetrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizador Agilent 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td>Para experimentos de microarrays</td></tr><tr><td>Todo Prep ADN/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td>Utilizado para el aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>Consola de análisis Versión de software 3.0.0.466</td><td></td><td></td><td>Analice las respuestas transcripcionales específicas del tipo de célula utilizando el análisis de varianza unidireccional entre sujetos</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo BD FACSAria II</td><td>Beckman</td><td></td><td>Para citometría de flujo</td></tr><tr><td>Consola Versión de software 3.0.0.466/Consola de expresión Software</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para confirmar la calidad de los datos</td></tr><tr><td>Citoqueratina 14</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53253</td><td>Dilución 1:200</td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td>Para medios</td></tr> <tr><td>celularesanti-integrina y alfa conjugados con FITC; 6</td><td>Abcam</td><td>ab30496</td><td>Para el análisis FACS</td></tr><tr><td>Software GeneChip Command Console 4.0</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para confirmar la calidad de los datos</td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para el lavado y la tinción de matrices hibridadas</td></tr><tr><td>Matrices GeneChip HuGene 2.0 ST</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para la hibridación y amplificación de ARN total</td></tr><tr><td>Horno de hibridación GeneChip 640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para la hibridación y amplificación de ARN total | Amplifique las muestras etiquetadas</td></tr><tr><td>, GeneChip, Hybridization, Wash y Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific).</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para el lavado y la tinción de matrices hibridadas</td></tr><tr><td>Sistema GeneChip Scanner 3000 7G</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Matrices híbridas de escaneo</td></tr><tr><td>GeneChip WT PLUS Kit de reactivos</td><td>Affymetrix/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para la amplificación de ARN total biotinilante</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento básico de fibroblastos humanos (hFGF basic/FGF2)</td><td>Cell Tecnología de señalización</td><td>8910</td><td>Para medios celulares</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico humano (hEGF)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>8916</td><td>Para medios celulares</td></tr><tr><td>Insulina humana</td><td>Millipore Sigma</td><td>9011-M</td><td>Para medios celulares</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad</td><td>1708880</td><td>utilizado para RT-qPCR</td></tr><tr><td>iScript Kit de síntesis de ADNc</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td>utilizado para RT-qPCR</td></tr><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005041</td><td>Suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina, 20 ng/ml de EGF, 10 ng/ml factor de crecimiento básico de fibroblastos, 0,4% de albúmina sérica bovina (BSA) y 4 &micro; g/ml de insulina</td></tr><tr><td>KSFM-scm</td><td>ThermoFisher Scientific 17005042</td><td></td><td>Suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina, 20 ng/ml de EGF, 10 ng/ml factor básico de crecimiento de fibroblastos, 0,4% de albúmina sérica bovina (BSA) y 4 &micro; g/ml de insulina</td></tr><tr><td>MCDB 153-LB medio basal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403</td><td>MCDB 153-LB medio basal con tampón HEPES</td></tr><tr><td>NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, NEGRO Paredes sobre portaobjetos de vidrio, 6/PK, 12/CS</td><td>Stellar Scientific</td><td>NST230111</td><td>para inmunotinción</td></tr><tr><td>P63</td><td>Thermo Scientific</td><td>703809</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>PE-conjugado anti-EGFR conjugado ( San José, CA; número de catálogo )</td><td>BD Pharmingen</td><td>555997</td><td>Para análisis FACS</td></tr><tr><td>pMSCV-IRES-EGFP vector plásmido</td><td>Addgene</td><td>20672</td><td>Para la transfección</td></tr><tr><td>Promega TransFast</td><td>kit Promega</td><td>E2431</td><td>Para la transfección</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Para experimentos de microarrays</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; Unidades estériles de filtro de vacío de un solo uso</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-63D</td><td>Para medios celulares</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia Zeiss Axionvert 135</td><td>Uso de Zeiss</td><td></td><td>con el software Axiovision Rel. 4.5</td></tr></tbody></table>

establecimiento de un sistema de cultivo de esferoides epidérmicos de alto rendimiento para modelar la plasticidad de las células madre de queratinocitos

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

La desregulación epitelial es un nodo para una variedad de afecciones y dolencias humanas, incluidas heridas crónicas, inflamación y más del 80% de todos los cánceres humanos. Como tejido de revestimiento, el epitelio de la piel a menudo está sujeto a lesiones y se ha adaptado evolutivamente al adquirir la plasticidad celular necesaria para reparar el tejido dañado. A lo largo de los años, se han realizado varios esfuerzos para estudiar la plasticidad epitelial utilizando modelos in vitro y ex vivo basados en células. Sin embargo, estos esfuerzos han sido limitados en su capacidad para recapitular las diversas fases de la plasticidad de las células epiteliales. Describimos aquí un protocolo para generar esferoides epidérmicos 3D y células derivadas de esferoides epidérmicos a partir de queratinocitos humanos neonatales primarios. Este protocolo describe la capacidad de los cultivos de esferoides epidérmicos para modelar funcionalmente distintas etapas de la plasticidad generativa de queratinocitos y demuestra que el rechapado de esferoides epidérmicos puede enriquecer cultivos heterogéneos de queratinocitos humanos normales (NHKc) para integrinaα6hi/ EGFRlo queratinocitos subpoblaciones de queratinocitos con características mejoradas similares a los tallos. Nuestro informe describe el desarrollo y mantenimiento de un sistema de alto rendimiento para el estudio de la plasticidad de los queratinocitos cutáneos y la regeneración epidérmica.

Durante el ensayo de epidermosfera de la piel, los cultivos de NHKc se siembran en pozos recubiertos de agarosa de una placa de 96 pozos(Figura 1A). Las células formadoras de esferoides deben autoagregórse dentro de las 48 horas. La formación autónoma de esferoides se puede evaluar tan pronto como 24 h utilizando un microscopio estándar de contraste de fase invertido. La formación de la epidermosfera de la piel y el ensayo de re-recubrimiento modelan varias fases de la regeneración del tejid...

Aquí describimos un protocolo para el cultivo sistemático de esferoides epidérmicos en cultivo de suspensión 3D. Este protocolo tiene una amplia gama de aplicaciones para su uso en una variedad de tipos de tejidos epiteliales y para el modelado de varias enfermedades y afecciones humanas.

Establecimiento de un sistema de cultivo de esferoides epidérmicos de alto rendimiento para modelar la plasticidad de las células madre de queratinocitos

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Este protocolo presenta un método novedoso para el cultivo y mantenimiento de cultivos de esferas epidérmicas, y la estrategia para investigarlos de cerca utilizando el ensayo de replantación de esferoides. Comience preparando el medio de lavado como se describe en el manuscrito de texto. En una campana de flujo laminar, lave el prepucio neonatal dos veces con cinco mililitros de medios de lavado en un tubo cónico de cinco mililitros, luego transfiera el prepucio lavado a una placa de Petri estéril.Con un bisturí y un bórceps, raspe el tejido adiposo y los tejidos conectivos sueltos de la capa dérmica, luego vuelva a lavar el prepucio con medios de lavado. Coloque la epidermis del prepucio hacia arriba en una placa de seis ormentos que contenga dos mililitros de enzima Dispasa diluida en medios de lavado. Transfiera la placa a una incubadora durante cuatro horas.Después de la incubación, transfiera el prepucio a una placa de Petri y use forrórceps de punta fina para separar la epidermis de la capa de la dermis. Coloque la epidermis en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,25%. Triturar la epidermis flotante con una pipeta serológica de cinco mililitros e incubarla durante 15 minutos a 37 grados centígrados con vórtice periódico durante cinco segundos cada cinco minutos.Después de la incubación, agregue dos mililitros de inhibidor de tripsina de soja y mézclelo mediante pipeteo para neutralizar la tripsina, luego centrífuga la suspensión celular. Resuspend el pellet en 12 mililitros de medio KSFM-SCM completo y coloca las células en un plato de 10 centímetros para incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, retire el medio con una pipeta aspiradora y reemplácelo con 12 mililitros de KSFM-SCM completo.Repita esto en los días cuatro y siete. Prepare una mezcla de 5% de agarosa agregando 2.5 gramos de agarosa a 50 mililitros de PBS en una botella de vidrio de 100 mililitros. Autoclave la botella en el ciclo de líquido y deje que se enfríe a temperatura ambiente.Para preparar los platos, coloque el vaso enfriado que contiene la solución de agarosa en un vaso de precipitados de un litro lleno de 200 mililitros de agua desionizada. Derrita la mezcla de agarosa en un microondas de grado de investigación durante un tiempo de hasta dos minutos, mezclando la agarosa cada 60 segundos inclinando suavemente la botella de lado a lado. Agregue tres mililitros de agarosa derretida al 5% a 12 mililitros de KSFM-SCM precalentado a 42 grados Celsius para una concentración final de 1% de agarosa.Agregue 200 microlitros de la mezcla de 1% de agar a cada pozo de una placa de 96 pozos usando un pipete multicanal. Luego deje la placa en un ambiente estéril a 25 grados centígrados durante cuatro horas. Pasa queratocitos humanos normales formadores de esferoides mediante medios de aspiración y células de lavado en dos mililitros de PBS.Aspire PBS y agregue dos mililitros de Tripsina-EDTA al 0,25% a las células lavadas. Luego incuba durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, agregue dos mililitros de inhibidor de tripsina de soja a la placa y lave las células de la placa en un tubo de 15 mililitros.Centrifugar a 250 veces G durante cinco minutos. Resuspenda el pellet celular en un mililitro de PBS y cuantifique las células utilizando la tinción Trypan Blue. Alícuota 20.000 queratinocitos humanos normales en 100 microlitros de KSFM-SCM y siembra las células en cada pozo de la placa de 96 pozos previamente preparada.Luego incuba el plato durante la noche. Usando un microscopio de contraste de fase invertida, analice los pozos sembrados para la formación de la esfera de la epidermis. De 24 a 48 horas después de la formación de la esfera de la epidermis en 3D, agregue cuatro mililitros de KSFM-SCM precalentado a 37 grados Celsius a un plato de seis centímetros.Usando una punta de pipeta de un mililitro de diámetro ancho, transfiera un solo esferoide a la placa e incube la placa durante la noche. Analice el esferoide sembrado para unir o propagar células utilizando un microscopio de contraste de fase invertida. Alimente las células cada 96 horas retirando el medio y agregando dos mililitros de medios KSFM-SCM frescos a la placa.Paso 70 a 80% de queratinocitos humanos normales derivados de esferoides confluentes y cultivos monocapa 2D como se demostró anteriormente. A continuación, cuantifique la viabilidad de la célula utilizando Trypan Blue y un contador de células automatizado. Alícuota de 100 microlitros que contienen de 100.000 a 4 millones de queratinocitos humanos normales en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Coloque los tubos sobre hielo en un ambiente oscuro apagando las luces brillantes dentro de la campana laminar. Agregue dos microlitros de anti-integrina alfa seis conjugada con FITC y dos microlitros de anti-EGFR conjugado con PE a los tubos para lograr una dilución de uno a 50. Prepare un tubo sin anticuerpos agregados para que sirva como control no manchado.Incubar los tubos en hielo en la oscuridad durante 30 minutos. Realice análisis de citometría de flujo con los láseres apropiados. Use los controles negativo y positivo para establecer puertas.Ordenar la subpoblación de la fracción de células madre epidérmicas, la fracción de células progenitoras proliferativas y la fracción de células progenitoras comprometidas. Pruebe la capacidad proliferativa de las subpoblaciones de células clasificadas transfiriendo el contenido de cada tubo de clasificación respectivo a un tubo cónico de 15 mililitros que contiene 10 veces el volumen de células clasificadas en PBS. Centrifugar los tubos a 250 veces G durante cinco minutos.Retire el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet en cuatro mililitros de KSFM-SCM. Transfiera las células resuspendidas a una placa de seis centímetros e incube durante la noche a 37 grados Centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% con un 95% de humedad. Al día siguiente, retire los medios de las placas y agregue cuatro mililitros de KSFM-SCM precalentado a 37 grados Celsius cada tres días hasta que se alcance una confluencia del 70 al 80%.La capacidad autónoma de formación de esferoides epidérmicos de queratinocitos humanos normales en cultivo 3D se evaluó mediante el ensayo de esfera de epidermis cutánea. La agregación celular no esférica no se consideró como una formación adecuada de la esfera de la epidermis. La agregación densa en forma de esfera se consideró un sello distintivo de la formación espontánea de esferoides.Fue necesario utilizar más de dos veces 10 a las cuatro células para asegurar una agregación espontánea adecuada. La plantación de esferas de epidermis en cultivo 2D resultó en la proliferación de queratinocitos humanos normales viables de pequeño tamaño. Es importante mantener estos cultivos por debajo del 100% de confluencia, ya que esto puede afectar considerablemente su crecimiento y el estado de las células madre en cultivo.El proceso de formación de esferoides epidérmicos fue rastreado funcionalmente a nivel de una sola célula por células transfectadas con un reportero fluorescente. La subpoblación de queratinocitos humanos normales derivados de esferoides es integrina alfa seis alta y EGF son células bajas. Las células generalmente constituyen alrededor del 25% de los cultivos.La caracterización de esta subpoblación de queratinocitos similares al tallo se logró mediante el análisis de inmunotinción de la citoqueratina basal 14 y la proteína tumoral 63. El ensayo de replatación de esferoides es una estrategia efectiva para el enriquecimiento de células madre epidérmicas de la piel humana neonatal. Este sistema se puede emplear como un modelo basado en células de alto rendimiento para investigar enfermedades cutáneas como la cicatrización de heridas y el cáncer.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Una forma rápida y robusta de aislar células viables de adultos epiteliales madre de la piel humana se describe. El método utiliza la digestión enzimática de la matriz de colágeno la piel, seguido por el punteo de los folículos pilosos y el aislamiento de las suspensiones de células individuales o fragmentos de tejido para el cultivo celular.

Aislamiento y cultivo de células madre adultas epiteliales de la piel humana

Este manuscrito proporciona un procedimiento paso a paso para la derivación y el mantenimiento de queratinocitos humanos a partir de pelo arrancado y la posterior generación de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) libres de integración por vectores episomales.

Generación de células madre Integración de libre Humanos pluripotentes inducidas Usando derivada de pelo queratinocitos

El objetivo de este artículo es proporcionar un protocolo completo y detallado sobre cómo generar piel organotípica humana modificada genéticamente a partir de queratinocitos epidérmicos y dermis humana desvitalizada.

Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

La piel humana actúa como primera línea de defensa contra el medio ambiente externo. Presentamos un método para aislar queratinocitos humano primario de piel adulto. Estos queratinocitos aislados son útiles en numerosas configuraciones experimentales y son un modelo muy adecuado para el estudio de mecanismos moleculares en biología cutánea en vitro.

Generación y cultivo de Keratinocytes humanos primarios de piel adulto

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo 3D organotypic melanoma esferoide piel que recapitula la arquitectura y complejidad multicelular de un órgano, tumor en vivo pero al mismo tiempo acomoda sistemático experimental intervención.

Un modelo de piel Organotypic Melanoma 3D esferoide

Aquí presentamos un protocolo para aislar eficientemente keratinocytes humanos primarios de tejidos de la piel adulta. Este método simplifica el procedimiento convencional mediante el uso de la Y-27632 del inhibidor de la roca en el medio de inoculación separar espontáneamente las células epidérmicas de las células cutáneas.

Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel

El objetivo de este protocolo es aislar los queratinocitos epidérmicos de la piel dorsal de ratones adultos para una variedad de aplicaciones aguas abajo, como biología molecular, bioquímica, clasificación celular activada por fluorescencia y usos primarios in vitro (por ejemplo, clonogénicos queratinocitos).

Aislamiento de los queratinocitos epidérmicos de ratón y su cultivo clonogénico In Vitro

Este protocolo describe un método sencillo para cultivar epidermis humana reconstituida tridimensional de una manera reproducible y robusta. Además, caracteriza la relación estructura-función del modelo de barrera epidérmica. Las respuestas biológicas de la epidermis humana reconstituida sobre estímulos proinflammatory también se presentan.

El cultivo de una epidermis humana reconstruida tridimensional a gran escala

Este protocolo describe el cultivo de queratinocitos recién obtenidos (pasaje 0) para su uso en la obtención de imágenes de células vivas.

Generación de cultivos primarios para la obtención de imágenes de células vivas de queratinocitos

Aquí, proporcionamos un método para el análisis de imágenes de células vivas que se puede utilizar para rastrear manualmente los linajes de los queratinocitos de paso 0 y que permite la recopilación de métricas de proliferación, incluido el destino de la división celular y la duración del ciclo celular.

Imágenes de células vivas con fotografía de lapso de tiempo para estudiar la cinética de proliferación de queratinocitos epidérmicos

Este protocolo describe un método para producir organoides cutáneos que contienen folículos pilosos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos utilizando un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido plano y fisiológicamente relevante para replicar la arquitectura y función de la piel.

Generación de organoides cutáneos planos con cabello derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos mediante un sistema de cultivo de interfaz aire-líquido

Aprende a cultivar esferoides epidérmicos en 3D usando queratinocitos humanos y el ensayo de replanteo. Este protocolo de alto rendimiento permite modelar enfermedades cutáneas y estudiar la plasticidad de células madre epidérmicas.

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Establecimiento de un sistema de cultivo de esferoides epidérmicos de alto rendimiento para modelar la plasticidad de las células madre de queratinocitos

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